CN115980221A

CN115980221A - 一种基于分子印迹-hplc联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法

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Publication number: CN115980221A
Application number: CN202211710610.1A
Authority: CN
Inventors: 单伟光; 郭胜男; 傅璐璐; 蒋娅鸯
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明涉及生物样品中痕量药物浓度的检测技术领域，特别涉及一种基于分子印迹‑HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法。所述方法是通过制备羟氯喹分子印迹聚合物，并对生物样品进行预处理后通过羟氯喹分子印迹聚合物进行样品富集，随后与HPLC联用，实现生物样品中痕量药物硫酸羟氯喹的浓度检测。本发明制备得到的羟氯喹分子印迹聚合物将印迹层包覆在纳米材料表面，极大地增加了聚合物的比表面积，富集效果好，结合能力和传质能力强；且对生物样品中痕量目标物质吸附容量大，特异性强、回收率高，与HPLC联用，有效提高检测灵敏度。

Description

一种基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法

技术领域

本发明涉及生物样品中痕量药物浓度的检测技术领域，特别涉及一种基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法。

背景技术

药物进入体循环后，被分配到身体的各个组织，而药物在组织的分布会直接影响药效：若药物在靶组织含量较高，则与特定受体相互作用更强，此外药物在组织或器官的积累可以延长药物作用时间；若药物在非靶组织分布较多，那么组织浓度过高或代谢物在组织长期累积都易造成毒副反应。因此，了解药物在生物体内的分布特征是设计新药、类似物和前药的关键因素。目前已建立的几种检测生物体内痕量药物的方法，包括高效液相色谱法(HPLC)、液质联用技术、分子成像技术等，但仍存在许多限制，如灵敏度低、费时、选择性低、成本高等。因此，找到一种简单、低成本的、快速的样品前处理技术来提高分析灵敏度非常重要。

分子印迹聚合物因对目标分析物具有很高的选择性，具有特异性强、富集率高、环境耐受性好和成本低的特点而被广泛应用于分离提取和样品的前处理过程。相比于其他吸附剂，分子印迹聚合物MIPs吸附性能和特异性更强且制作简便，然而，传统的MIPs制备方法常会导致模板分子包埋过深，在洗脱过程中被重新洗脱出来往往会导致分析结果偏高，尤其是痕量检测时影响尤为明显，因此如何寻找一种效果优良的印迹聚合物并应用于HPLC生物样品痕量药物的检测中是本领域所要解决的重要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，尤其是一种羟氯喹分子印迹-HPLC用于检测生物样品中硫酸羟氯喹的方法。本发明通过用3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷制备表面乙烯基功能化的纳米二氧化硅，再以羟氯喹为模板分子，α-MAA为功能单体，EDGMA为交联剂，AIBN为引发剂制备羟氯喹表面分子印迹聚合物，将其运用于大鼠血浆及肺组织中，成功分离富集到体内硫酸羟氯喹，采用HPLC进行含量测定，有效消除基质干扰，测定药时曲线。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，所述方法是采用羟氯喹分子印迹聚合物与HPLC联用，检测生物样品中痕量药物硫酸羟氯喹的浓度。

优选的，所述方法包括以下步骤：

(1)制备羟氯喹分子印迹聚合物；

(2)对生物样品进行预处理，将硫酸羟氯喹转变为羟氯喹，并通过羟氯喹分子印迹聚合物对羟氯喹进行富集，得到富集的样品；

(3)采用HPLC对富集的样品进行检测，得到生物样品内痕量药物硫酸羟氯喹的浓度。

优选的，所述羟氯喹表面分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：

(1.1)制备表面改性的纳米二氧化硅：将活化的SiO₂分散在甲苯中，加入3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和三乙胺，超声处理15min～30min后，在惰性气氛保护下加热搅拌回流，后处理后得到表面经双键改性的纳米二氧化硅(MSP@SiO₂)；

(1.2)制备模板分子：取硫酸羟氯喹溶于水中，用碱液碱化后萃取并经后处理，得到模板分子羟氯喹；

(1.3)制备预聚合液：将模板分子溶于氯仿中，加入功能单体甲基丙烯酸MAA，搅拌得到预聚合液；

(1.4)向预聚合液中加入步骤(1.1)所得MSP@SiO₂，超声使其分散，随后加入交联剂EDGMA、引发剂AIBN；惰性气氛保护下加热搅拌回流，得到聚合物；

(1.5)将步骤(1.4)的聚合物用甲醇/乙酸混合物溶液多次超声清洗至溶液中不含有模板分子为止；用无水甲醇反复清洗聚合物，真空干燥，即得到羟氯喹表面分子印迹聚合物HCQ-MSP@MIPs。

优选的，本发明中惰性气氛为氮气、氩气、氦气的至少一种。

优选的，所述步骤(1.1)中3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷用量为SiO₂质量的5％～80％；三乙胺的用量为SiO₂质量的5％，甲苯用量以SiO₂计为13.3mL/g，回流时间优选为3～15h，加热温度优选为90℃；分散可采用超声分散；活化的SiO₂优选采用在盐酸水溶液中加热回流的方法来活化SiO₂，增加其表面羟基密度；

后处理包括过滤、洗涤、干燥等常规后处理步骤，具体可以为：反应体系过滤后，固体依次用甲苯、丙酮、甲醇反复洗涤后80℃真空干燥24h。

优选的，所述步骤(1.2)中硫酸羟氯喹用量为0.1～0.3mmol；硫酸羟氯喹在水中的浓度优选为0.1～0.3mmol/L；碱为氢氧化钠，氢氧化钠与硫酸羟氯喹的摩尔比优选为2:1；碱液浓度优选为0.2～0.6mmol/L；萃取剂优选为氯仿；

后处理优选包括除去溶剂、除去可能存在的水分、干燥等常规后处理操作，更优选为萃取后旋转蒸发除去溶剂，再加入少量无水甲醇，旋干以除去少量水分，80℃真空干燥24h。

优选的，所述步骤(1.3)中功能单体甲基丙烯酸与模板分子摩尔比为(2～6):1；搅拌优选为220rpm磁力搅拌3小时。

优选的，所述步骤(1.4)中交联剂与模板分子摩尔比优选为(10～30):1；引发剂与模板分子的摩尔比优选为1:1；MSP@SiO₂的质量优选为0.5g。

优选的，所述步骤(1.4)中加热温度为55℃～70℃，时间为3h，搅拌速率为220rpm。

优选的，所述步骤(1.5)中甲醇/乙酸混合溶液中甲醇和乙酸比例为9:1，v/v。

优选的，所述步骤(1.5)中，每次清洗溶液进行HPLC检测，直至检测不到模板分子为止。

优选的，所述步骤(2)中，向生物样品中加入碱或碱液进行碱化，实现预处理。

优选的，所述步骤(3)中，HPLC条件为：色谱柱：Agilent Extend-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5m)，流动相为90％0.02M磷酸二氢钾(pH 3.0)-10％乙腈，检测波长254nm，流速0.8mL/min，进样量10μL，柱温箱温度30℃，分析时间30min。

本发明通过制备方法制备得到羟氯喹分子印迹聚合物，并与HPLC联用，用于生物样品中痕量硫酸羟氯喹的分离与测定，将其应用于服用硫酸羟氯喹的大鼠血浆及肺组织中硫酸羟氯喹的分离富集与含量测定。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明制备得到的羟氯喹分子印迹聚合物机械强度高，耐受性强、成本低。

(2)本发明制备得到的羟氯喹分子印迹聚合物将印迹层包覆在纳米材料表面，极大地增加了聚合物的比表面积，富集效果好，结合能力和传质能力强。

(3)本发明制备得到的羟氯喹分子印迹聚合物对生物样品中痕量目标物质吸附容量大，特异性强、回收率高，与HPLC联用，有效提高检测灵敏度。

附图说明

图1为实施例1所制备的羟氯喹分子印迹聚合物的SEM图。

图2为实施例1所制备的羟氯喹分子印迹聚合物的热重图。

图3为测试例3中动力学吸附实验与等温吸附实验的测试结果图。

图4为测试例3中选择性考察的测试结果图。

图5为测试例3中重复利用性考察的测试结果图。

图6为实施例2中专属性考察结果图，MIPs处理的空白血浆加标准品(A)、不经MIPs处理的给药后血浆样品(B)、MIPs处理的给药后血浆样品(C)色谱图。

图7为实施例2中测得硫酸羟氯喹在大鼠体内的血药浓度图。

图8为实施例3中专属性考察结果图，空白肺组织(A)、经MIPs处理的空白肺组织(B)、MIPs处理的空白肺组织加标准品(C)、不经MIPs处理的给药后肺组织样品(D)、MIPs处理的给药后肺组织样品(E)色谱图。

图9为实施例3中测得硫酸羟氯喹在大鼠肺组织中分布曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

实施例1：

本发明提出的羟氯喹表面分子印迹聚合物的制备方法具体步骤如下：

(1)二氧化硅的活化：

将10g纳米SiO₂置于250mL圆底烧瓶中，再向圆底烧瓶中加入120mL10％盐酸水溶液，超声分散30min后，在112℃下220rpm回流搅拌24小时，抽滤后用纯化水反复洗涤至中性，120℃下真空干燥24小时，得到活化的SiO2备用。

(2)二氧化硅的表面修饰：

将3g活化的SiO2分散在40mL甲苯中，并加入1.5mL 3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和0.2mL三乙胺，超声处理15min，用氮气吹扫将圆底烧瓶中的氧气置换出来，在氮气保护下90℃以220rpm搅拌回流反应12小时后，过滤产物，依次用甲苯、丙酮、甲醇反复洗涤，并在80℃下真空干燥24小时，得到表面经双键改性的纳米二氧化硅(MSP@SiO2)。

(3)表面分子印迹聚合物的制备：

将10mL 0.01mmol/ml硫酸羟氯喹水溶液转入分液漏斗中，加入10mL2mol/L氢氧化钠溶液后萃取(氯仿萃取2次，每次10mL)，旋转蒸发除去溶剂，还可以加入少量甲醇旋转蒸发除去水分，50℃下真空干燥1小时，得到模板分子羟氯喹。模板分子溶于40mL氯仿中，加入0.8mmol甲基丙烯酸MAA，磁力搅拌3小时，使模板分子和功能单体完成充分的自组装过程。加入0.5g MSP@SiO2，超声30min使其分散，随后加入4mmol交联剂EDGMA、30mg引发剂AIBN，在氮气保护下60℃搅拌回流24小时，得到聚合液。聚合液经分离后，将分离得到的聚合物用甲醇/乙酸(v/v，9∶1)混合溶液多次清洗，直至羟氯喹不能被HPLC检测出来为止。用无水甲醇反复清洗聚合物以除去残留的乙酸，随后真空干燥24小时，即得到HCQ-MSP@MIPs。

测试例1用扫描电镜观察实施例1制备得到的羟氯喹表面分子印迹聚合物的形貌

图1是SiO₂、MSP@SiO₂、HCQ-MSP@MIPs的扫描电镜SEM图。图1A为活化二氧化硅SiO₂，可以看到活化硅胶为光滑球形，并且易团聚，这是由于活化后的SiO₂表面富含羟基，羟基之间易通过氢键吸引，所以SiO₂易形成团聚物。图1B为改性二氧化硅MSP@SiO₂，在二氧化硅表面接上双键后，疏水性增强，并且不易团聚，可以看到多为分散的单个颗粒。图1C为印迹聚合物HCQ-MSP@MIPs，相比于SiO₂和MSP@SiO₂，印迹聚合物表面更为粗糙，且直径更大，这是因为表面覆盖了一层聚合物层，说明分子印迹聚合层成功聚合到二氧化硅表面。

测试例2测试实施例1制备得到的羟氯喹表面分子印迹聚合物的热稳定性

图2是SiO₂、MSP@SiO₂、HCQ-MSP@MIPs的热重分析曲线图。图中显示热重曲线主要可分为三个阶段，在0～100℃范围内，相比于活化SiO₂，MSP@SiO₂和HCQ-MSP@MIPs表面水分损失比重较少，这是因为SiO₂表面接枝双键后，其疏水性增加，表面不易吸水。当逐渐升温至200～450℃时，MSP@SiO₂的曲线出现一个明显的下降，表明SiO₂表面接枝的MPS开始分解，而HCQ-MSP@MIPs则出现大幅下降，这是由于覆盖在表面的分子印迹层脱落所致，温度上升至440℃时，聚合物已经基本脱落完毕。在450℃之后，三个样品的质量变化趋于稳定，一些无机物质的分解使曲线呈现小幅的下降。以上结果证明分子印迹层已成功地包覆在纳米SiO₂表面，且该材料具有良好地热稳定性，在200℃内使用不会破坏聚合物结构。

测试例3测试实施例1制备得到的硫酸羟氯喹分子印迹聚合物的吸附性能

(1)吸附动力学实验：

按照实施例1制备方法制备对比例，但不加模板分子，得到印迹聚合物HCQ-MSP@NIPs。

称取8mg HCQ-MSP@MIPs或HCQ-MSP@NIPs于5mL玻璃离心管中，分别加入3mL浓度为600μg/mL的羟氯喹氯仿溶液，密封，室温下振荡吸附，于不同时间点取出离心管，离心，取1mL上清液氮气吹干，用1mL流动相复溶后进行HPLC分析。

动力学实验结果图3A，随着时间的增加，HCQ-MSP@MIPs对羟氯喹的吸附量也逐渐增大，当吸附时间达到1h时，基本达到动态吸附平衡，即HCQ-MSP@MIPs对羟氯喹的吸附量接近于饱和。HCQ-MSP@NIPs对羟氯喹的吸附量也随着时间增大，但是由于是非特异性结合，所以吸附量相对明显较低。

(2)等温吸附实验：

分别配置一系列浓度为15～600μg/mL的羟氯喹氯仿溶液，称取8mg HCQ-MSP@MIPs或HCQ-MSP@NIPs于5mL玻璃离心管中，各取不同浓度的上述羟氯喹溶液3mL于离心管中，密封，室温下振荡吸附2小时。吸附完成后离心，取1mL上清液氮气吹干，用1mL流动相复溶后进行HPLC分析。

吸附等温曲线如图3B，HCQ-MSP@MIPs的吸附量随着浓度的增大而逐渐增加，而HCQ-MSP@NIPs在羟氯喹初始浓度大于250μg/ml时的吸附量已趋于饱和，并且在相同初始浓度下的MIPs吸附量明显大于NIPs的吸附量，说明MIPs对羟氯喹具有较高的特异性吸附。

(3)选择性吸附实验：

本发明选取羟氯喹结构类似物氯喹(Chloroquine,CQ)、奎宁(Quinine,QN)为竞争性吸附物质，结构如下式所示。配制同等浓度的羟氯喹、氯喹、奎宁的混合溶液，称取8mgHCQ-MSP@MIPs或HCQ-MSP@NIPs于5mL玻璃离心管中，分别加入3mL上述混合溶液，密封，室温下振荡吸附2小时。吸附完成后离心，取1mL上清液氮气吹干，用1mL流动相复溶后按照3.2.3项下条件进行HPLC分析。据吸附前后的浓度变化计算聚合物对羟氯喹、氯喹、奎宁的吸附容量，采用分配系数K_D、选择系数α及印迹因子IF评价印迹聚合物的选择性吸附性能。

硫酸羟氯喹分子印迹聚合物的选择性考察结果如图4和表1，HCQ-MSP@MIPs对羟氯喹及干扰物质的分配系数K_D和选择系数α均高于HCQ-MSP@NIPs，且对于羟氯喹具有显著更高的分配系数，这表明HCQ-MSP@MIPs对羟氯喹有着更好的吸附能力，体现出其对底物有着良好的选择性和特异性识别能力。

表1

(4)重复利用性实验：

将8mg HCQ-MSP@MIPs于5mL玻璃离心管中，分别加入3mL浓度为600μg/mL的羟氯喹氯仿溶液，密封，室温下振荡吸附2小时。吸附完成后离心，取1mL上清液氮气吹干，用1mL流动相复溶后进行HPLC分析，根据吸附前后的浓度变化计算聚合物对羟氯喹的吸附容量Q。使用甲醇/乙酸(9:1，v/v)对HCQ-MSP@MIPs进行反复超声洗脱，得到的材料进行再次吸附，如此重复5次，通过吸附容量的变化评价聚合物的重复利用性能。

HCQ-MSP@MIPs的重复利用实验结果如图5所知，在重复使用了5次以后，印迹聚合物的吸附性能仍保留90％，表明材料的稳定性和重复利用性能良好，高度交联的网状结构中形成的空腔，不会因为模板分子的吸附解吸附过程受到损坏，多次使用后依然具有很好的识别能力。

实施例2

本发明提出分子印迹与HPLC联用检测大鼠血浆中硫酸羟氯喹含量的具体步骤如下：

(1)动物给药：

取SD雄性大鼠48只，随机分成12组。灌胃给予硫酸羟氯喹溶液。剂量为10mg/kg(以硫酸羟氯喹计)，大鼠给药前禁食12h，期间自由饮水。给药后，于10min、20min、40min、60min、80min、100min、2h、3h、4h、12h、24h，对照组大鼠灌胃同等剂量生理盐水。

(2)血浆样品处理：

取1mL大鼠血浆，加100μL 0.02M NaOH溶液，涡旋混匀，加1.5mg HCQ-MSP@MIPs，振荡吸附20min，离心(10000rmp,5min)除去上清，加3mL甲醇/乙酸(9:1,v/v)，超声洗脱20min，离心取上层氮吹，100μL流动相复溶，离心。

(3)色谱条件：

色谱柱：Agilent Extend-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5m)，流动相为90％0.02M磷酸二氢钾(pH 3.0)-10％乙腈，检测波长254nm，流速0.8mL/min，进样量10μL，柱温箱温度30℃，分析时间30min。

(4)标准曲线的制备：

取大鼠空白血浆1mL，加入硫酸羟氯喹标准溶液，配制成硫酸羟氯喹质量浓度分别为10.18、50.88、101.76、152.64、203.52、254.40ng/mL的标准含药肺组织匀浆，涡旋混匀后，分别按照步骤(2)下进行处理，按照(3)色谱条件进行HPLC测定硫酸羟氯喹含量，记录峰面积，绘制标准曲线。

(5)专属性实验：

取大鼠空白血浆1mL，按照步骤(2)项下进行处理，得图6中空白色谱图A。另取大鼠空白血浆1mL，加入一定浓度的硫酸羟氯喹标准溶液，按照步骤(2)项下处理得到标准品色谱图B。取大鼠给药后的血浆，同法处理后得色谱图C。

(6)精密度实验：

取大鼠空白血浆1mL，加入硫酸羟氯喹标准溶液，配制成质量浓度分别为254.40、101.76、50.88ng/mL的高、中、低三个浓度的样品溶液，分别按照步骤(2)项下进行处理，每个样品平行进样6次，连续进样3d，根据测定结果计算日内与日间精密度、准确度。

(7)萃取回收率实验：

取大鼠空白血浆1mL，加入硫酸羟氯喹标准溶液，配制成质量浓度分别为254.40、101.76、50.88ng/mL的高、中、低三个浓度的样品溶液，每个浓度平行三份，分别按照步骤(2)项下进行处理，测定峰面积，另同时测定未经处理的同浓度对照品的峰面积，计算回收率。

(8)大鼠血浆样品中硫酸羟氯喹含量测定：

按步骤(2)处理方法处理血浆样品后，按步骤(3)色谱条件进行HPLC测定各峰面积，计算给药后各个取样时间点的血浆硫酸羟氯喹浓度。

空白含药血浆经过处理按步骤(3)进行HPLC分析得到的标准方程为：y＝1.5687x+5.08(R²＝0.9945)，在10.18～254.40ng/mL范围内线性关系良好，检测限(S/N＝3)和定量限(S/N＝10)分别为为3.04ng/mL、10.18ng/mL。

方法专属性考察结果见图6，经分子印迹处理后的空白血浆加标准品图A，羟氯喹峰分离度良好；不经分子印迹处理的给药后血浆样品图B，无法用紫外检测器检测到硫酸羟氯喹；而经分子印迹处理的给药后血浆样品图C，能够检测到硫酸羟氯喹的峰，基质干扰减对样品峰无影响，方法灵敏度提高。

大鼠血浆中硫酸羟氯喹精密度测定，低浓度日内、日间精密度(6.79％、7.49％)均小于10％，高浓度日内、日间精密度(1.01％、1.26％)均小于5％，方法精密度良好。

大鼠血浆硫酸羟氯喹回收率结果，羟氯喹在高、中、低三个浓度下回收率分别为(91.88±1.71)、(91.17±3.06)、(87.16±6.47)，该方法准确可行。

硫酸羟氯喹大鼠血药浓度曲线图7所示，在0～2h内，血药浓度迅速上升，2h达到峰值，此时浓度为160.87ng/mL，表明羟氯喹口服后吸收迅速，血液中游离药物易分布于体内组织。

该实施例可以检测到大鼠血浆中高效液相色谱下的硫酸羟氯喹检测限下的浓度，且精密度好，说明以本发明制备的羟氯喹分子印迹-HPLC联用方法比仅使用HPLC具有更高的灵敏度和准确度，能适用于血浆药时曲线的测定。

实施例3

本发明提出的羟氯喹分子印迹聚合物与HPLC联用检测大鼠肺组织中硫酸羟氯喹含量的具体步骤如下：

(1)动物给药：

具体方法同实施例2步骤(1)。

(2)肺组织样品处理：

肺组织加生理盐水(1:3,w/v)，匀浆，取1mL匀浆液离心，取上清液加100μL 0.02MNaOH溶液，涡旋混匀，加500μL氯仿萃取2次，离心(10000rmp,5min)取下层，合并滤液，加1.5mg HCQ-MSP@MIPs，振荡吸附20min，离心除去上清，加3mL甲醇/乙酸(9:1,v/v)，超声洗脱20min，离心取上层氮吹，100μL流动相复溶，离心。

(3)标准曲线制备：

取大鼠空白肺组织匀浆1mL，加入硫酸羟氯喹标准溶液100μL，配制成硫酸羟氯喹质量浓度分别为0.10、0.51、1.02、1.53、2.04、2.54μg/mL的标准含药肺组织匀浆，涡旋混匀后，分别按照步骤(2)项下进行处理，按步骤(3)测定羟氯喹含量，记录峰面积，绘制标准曲线。

(4)专属性试验：

取大鼠空白肺组织匀浆1mL，按照步骤(2)项下进行处理，大鼠空白肺组织空白色谱图A，加入分子印迹材料得到大鼠空白肺组织空白色谱图B。另取大鼠空白肺组织匀浆1mL，加入一定浓度的硫酸羟氯喹标准溶液，按照步骤(2)项下处理得到对照品色谱图C。取大鼠给药后的肺组织匀浆，不经分子印迹处理得色谱图D，经过分子印迹处理得到色谱图E。

(5)精密度实验

取大鼠空白肺组织匀浆1mL，加入硫酸羟氯喹标准溶液，配制成质量浓度分别为2.54、1.53、0.51μg/mL的高、中、低3个浓度样品，分别按照步骤(2)项下进行处理，每个样品平行进样6次，连续进样3d，根据测定结果计算日内与日间精密度、准确度。

(6)萃取回收率试验：

取大鼠空白肺组织匀浆1mL，加入硫酸羟氯喹标准溶液，配制成质量浓度分别为2.54、1.53、0.51μg/mL的高、中、低三个浓度样品，每个浓度平行三份，分别按照步骤(2)项下进行处理，测定峰面积，另同时测定未经处理的同浓度对照品的峰面积，计算回收率。

(7)大鼠肺组织样品中硫酸羟氯喹含量测定：

将大鼠肺组织样品按照上述步骤(2)处理方法处理后，用HPLC测定各峰面积，计算给药后各个取样时间点的肺组织硫酸羟氯喹浓度。

空白含药肺组织经过处理进行HPLC分析得到的标准方程为：y＝206.6x+3.8478(R²＝0.9952)，在0.10～2.54μg/mL范围内线性关系良好，检测限(S/N＝3)和定量限(S/N＝10)分别为为0.004μg/mL、0.015μg/mL。

方法专属性考察结果图8，空白肺组织图A，基质干扰大；经分子印迹处理后空白肺组织图B，生物样品基质干扰大大减小；经MIPs处理的给药后肺组织样品图E与不经MIPs处理的给药后肺组织样品图D相比，硫酸羟氯喹相对峰面积大大增加，且分离度良好。

硫酸羟氯喹在高、中、低三个浓度下日内、日间精密度均小于2％，方法精密度良好。

硫酸羟氯喹在高、中、低三个浓度下回收率分别为(90.20±2.46)、(87.53±2.44)、(85.63±2.65)，该方法准确可行。

硫酸羟氯喹大鼠肺组织分布如图9所示，在0～2h内，肺药浓度迅速上升，2h之后上升缓慢，在4h时达到最高，此时浓度为6.87μg/g，表明硫酸羟氯喹在肺组织中分布较快，浓度较高。

该实施例可以检测到大鼠肺组织中高效液相色谱下的硫酸羟氯喹检测限下的浓度，且精密度好，说明以本发明制备的羟氯喹分子印迹-HPLC联用方法比仅使用HPLC具有更高的灵敏度和准确度，能应用于肺组织分布药时曲线的测定。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制，即本发明的保护范围并不局限于此，通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下，任何根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述方法是采用羟氯喹分子印迹聚合物与HPLC联用，检测生物样品中痕量药物硫酸羟氯喹的浓度。

2.根据权利要求1所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备羟氯喹分子印迹聚合物；

3.根据权利要求2所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述羟氯喹分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：

(1.1)制备表面改性的纳米二氧化硅：将活化的SiO₂分散在甲苯中，加入3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和三乙胺，超声处理15min～30min后，在惰性气氛保护下加热搅拌回流，后处理后得到改性的纳米二氧化硅MSP@SiO₂；

(1.3)制备预聚合液：将模板分子溶于氯仿中，加入功能单体甲基丙烯酸，搅拌得到预聚合液；

(1.5)将步骤(1.4)的聚合物用甲醇和乙酸的混合溶液多次超声清洗至溶液中不含有模板分子为止；用无水甲醇反复清洗聚合物，真空干燥，即得到羟氯喹分子印迹聚合物。

4.根据权利要求3所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述步骤(1.1)中3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷用量为SiO₂质量的5％～80％；三乙胺的用量为SiO₂质量的5％，甲苯用量以SiO₂计为13.3mL/g，回流时间为3～15h，加热温度为90℃。

5.根据权利要求3所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述步骤(1.2)中硫酸羟氯喹在水中的浓度为0.1～0.3mmol/L；碱为氢氧化钠，氢氧化钠与硫酸羟氯喹的摩尔比为2:1；碱液浓度为0.2～0.6mmol/L；萃取剂为氯仿。

6.根据权利要求3所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述步骤(1.3)中功能单体甲基丙烯酸与模板分子摩尔比为(2～6):1。

7.根据权利要求3所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述步骤(1.4)中交联剂与模板分子摩尔比为(10～30):1；引发剂与模板分子的摩尔比为1:1。

8.根据权利要求3所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述步骤(1.4)中加热温度为55℃～70℃，时间为3h。

9.根据权利要求2所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，通过对生物样品进行碱化实现预处理。

10.根据权利要求2所述基于分子印迹-HPLC联用检测生物样品中痕量药物浓度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，HPLC条件为：色谱柱：Agilent Extend-C18色谱柱，流动相为90％0.02M磷酸二氢钾(pH 3.0)-10％乙腈，检测波长254nm，流速0.8mL/min，进样量10μL，柱温箱温度30℃。