CN115975885A - 一种利用鱼加工副产物为氮源的嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备 - Google Patents
一种利用鱼加工副产物为氮源的嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物培养基技术领域，尤其涉及一种利用鱼加工副产物为氮源的嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备。所述培养基原料包括：脑心浸出液肉汤、L‑半胱氨酸盐酸盐和鱼加工副产物水解物；所述鱼加工副产物水解物的制备方法包括：将鱼加工副产物破碎、灭菌、去除脂肪后利用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解，将酶解产物过滤后即得鱼加工副产物水解物。在降低培养基成本、解决鲢鱼加工副产物资源的浪费和其丢弃后污染环境问题的同时，还可以提高Akk菌的培养效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养基技术领域，尤其涉及一种利用鱼加工副产物为氮源的嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备。
背景技术
嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，Akk菌)是定植于肠道黏液层中可特异性降解黏蛋白的革兰氏阴性厌氧菌。研究发现，Akk菌具有良好的代谢调节能力，可以改善动物脂代谢和肠道通透性，成为治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖的候选药物。此外，也相继报道了Akk菌具有改善肝损伤等疾病症状的作用。发现Akk菌的丰度在疾病的发展中起着重要的作用，有望成为改善因心脑血管系统紊乱引发的疾病的靶点。
Akk菌作为当前研究热点，其培养及培养基的优化是一个必需而且至关重要的内容。目前国内外对于Akk菌的培养大都依赖于脑心浸出液肉汤和猪胃黏蛋白配置而成的培养基，但该种培养基配方成本较高。且猪胃黏蛋白来自于猪胃，可能会携带未知病毒和其他危险成分，该培养基成分的安全性无法得到充分保障。
鲢鱼是淡水渔业生产中产量较高、放养比例较大的养殖品种，生产成本低。研究发现，鲢鱼的蛋白白度和凝胶特性较好，被广泛用于生产冷冻鱼糜和鱼糜制品。2021中国渔业统计年鉴中指出，全国鱼糜制品总量达12.68万吨。在鲢鱼制备鱼糜的加工过程中会产生占鱼体重量约57％的副产物，包括鱼头、鱼骨、内脏、鱼皮、鱼鳍、鱼鳞。目前少有对鲢鱼加工副产物系统的处理，大部分被直接丢弃或被简单加工成鱼粉添加到饲料中，产品附加值低，造成大量蛋白质资源的浪费，同时对环境造成污染。
中国专利号CN201910265701.0公开了一种培养Akk菌的培养基及其使用方法，所述培养基的组分包括大豆蛋白胨、苏氨酸、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、氯化钠和磷酸氢二钠。虽然不添加脑心浸出液肉汤和猪胃黏蛋白的上述培养基仍然能够培养Akk菌，且培养基的组分来源安全，不存在潜在的生物危险。然而Akk菌生长缓慢，OD600值较低，不利于研究工作的开展。
因此，寻找成本低、且安全高效的新型Akk菌培养基氮源是必要的。
发明内容
本发明提供一种利用鱼加工副产物为氮源的嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备，用以解决现有技术中缺少成本低、高效黏蛋白阿克曼菌培养基的缺陷，通过替换Akk菌培养基中的氮源来降低培养基成本，解决鲢鱼加工副产物资源的浪费和其丢弃后污染环境的问题，同时避免来源于猪的氮源存在的病毒风险，还可以提高Akk菌的培养效率。
本发明提供一种嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其原料包括：脑心浸出液肉汤、L-半胱氨酸盐酸盐和鱼加工副产物水解物；
所述鱼加工副产物水解物的制备方法包括：
将鱼加工副产物破碎、灭菌、去除脂肪后利用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解，将酶解产物过滤后即得鱼加工副产物水解物。本发明可以有效降低培养基氮源的经济成本，同时可以避免来源于猪的氮源存在的病毒隐患，鲢鱼加工副产物水解物的利用能够减少鲢鱼加工副产物资源的浪费及其对环境造成的污染，同时提高其经济价值，利用本发明的培养基培养Akk菌的效率高、效果好。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，每60mL水中含有1.5-2.5g脑心浸出液肉汤、0.01-0.05g L-半胱氨酸盐酸盐、0.05-2g鲢鱼加工副产物水解物。利用该制备方法制备得到的培养基，可以保证Akk菌的质量。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，所述鱼加工副产物选自淡水鱼的加工副产物，优选所述鱼加工副产物包括鲢鱼加工副产物、罗非鱼加工副产物、鲶鱼加工副产物中的一种或几种；进一步优选所述鱼加工副产物为鲢鱼加工副产物。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，所述鱼加工副产物包括鱼头和鱼骨，所述鱼头与鱼骨的质量比为2.5-3.5:1.5-2.5。将鱼头与鱼骨控制在上述质量比范围内，获得的培养基质量更好。
在本发明的一些优选实施例中，所述鱼头与鱼骨的质量比为3:2。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，将破碎后的鱼加工副产物与水按照质量比0.5-1.5:1.5-2.5混合后再灭菌。在该质量比下，在冷藏后更容易分离脂肪。
在本发明的一些优选实施例中，所述鱼加工副产物与水的比例为1:2。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，所述灭菌的方式为高温高压灭菌。
所述灭菌的条件优选为120-122℃处理0.8-1.2h。
在本发明的一些优选实施例中，所述灭菌的条件为121℃处理1h。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，按酶活比例1.8-2.2:0.8-1.2加入碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶。利用该酶活比例，酶解效果更优。
在本发明的一些优选实施例中，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活比例为2：1。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，在45-55℃下酶解2.5-3.5h。
在本发明的一些优选实施例中，在50℃下酶解3h。
本发明还提供一种嗜黏蛋白阿克曼菌培养基，其原料包括鱼加工副产物水解物，所述鱼加工副产物水解物的制备方法包括：
将鱼加工副产物破碎、灭菌、去除脂肪后利用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解，将酶解产物过滤后即得鱼加工副产物水解物。
根据本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基，所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基由上述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法制备而成。
在本发明的一些优选实施例中，所述培养基的组分包括鲢鱼加工副产物水解物、脑心浸出液肉汤和L-半胱氨酸盐酸盐。
所述培养基的制备步骤为：
1)前处理
收集鲢鱼加工过程中产生的鱼头、鱼骨副产物，用绞肉机均匀打碎质量比为3:2的鱼头鱼骨。将经过搅碎后的鲢鱼加工副产物和去离子水按质量比为1:2均匀混合。之后于高压蒸汽灭菌锅中121℃处理1h，冷却至室温，放于4℃冰箱冷藏8h后去除上层脂肪。
2)酶解
将高温高压处理后的鲢鱼加工副产物和水的混合物在50℃水浴锅中预热10min，加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶。继续在50℃水浴锅中进行酶解，酶解时间为3h。之后在90℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温后于10000rpm离心10min，取上清液，经定性滤纸过滤后冷冻干燥得到鲢鱼加工副产物水解物。
3)培养基的配制
向60mL水中加入脑心浸出液肉汤2.22g，L-半胱氨酸盐酸盐0.03g，鲢鱼加工副产物水解物0.13～0.65g，混合均匀并搅拌溶解后分装于厌氧细胞培养管中，充氮排氧，121℃高压蒸汽灭菌15min。
优选的，步骤1)中收集的鱼头和鱼骨的比例为3：2(质量比)。
优选的，步骤3)中额外添加鲢鱼加工副产物水解物的氮含量占培养基干基氮含量的6.74～33.7％。
本发明还提供了上述技术方案所述培养基的使用方法，包括：Akk菌在36-38℃下活化46-50h,传代34-38h后，将所述Akk菌接种于上述技术方案所述的培养基中，进行厌氧培养。利用该使用方法，Akk菌生长更快。
在本发明的一些优选实施例中，Akk菌在标准BHI培养基，37℃恒温培养箱中活化48h,传代36h后，将所述Akk菌液以5％的比例(v/v)接种于上述技术方案所述的培养基中，进行厌氧培养。
本发明的有益效果：
本申请提供一种培养Akk菌的培养基及其使用方法和应用，所述培养基利用鲢鱼加工副产物水解物替代Akk菌培养基中猪胃黏蛋白的使用，有效降低培养基氮源的经济成本，同时可以避免来源于猪的氮源存在的病毒隐患。另一方面，鲢鱼加工副产物水解物的利用能够减少鲢鱼加工副产物资源的浪费及其对环境造成的污染，同时提高其经济价值。
本发明制备得到的培养基，培养Akk菌的生长速度快、效果好、培养质量高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明Akk菌在实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和猪胃黏蛋白例1培养基上的生长曲线图。
图2是本发明Akk菌体的扫描电镜图；
A图、B图为Akk菌在对比例1培养基37℃下培养72h扫描电镜图，C图、D图为Akk菌在实施例3培养基37℃下培养72h扫描电镜图，E图、F图为Akk菌在猪胃黏蛋白例1培养基37℃下培养72h扫描电镜图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中采用的嗜黏蛋白阿克曼菌为Akkermansia muciniphila ATCCBAA-835，脑心浸出液肉汤为索莱宝B8130。
实施例1
该实施例嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法包括以下步骤：
1)前处理
收集鲢鱼加工过程中产生的副产物：鱼头、鱼骨，用绞肉机将其均匀搅碎。将经过搅碎后的鲢鱼加工副产物和去离子水混合均匀，副产物和去离子水的质量比为1:2。之后于高压蒸汽灭菌锅中121℃处理1h，冷却至室温，放于4℃冰箱冷藏8h后去除上层脂肪。
2)酶解
将高温高压处理后的鲢鱼加工副产物和水的混合物在50℃水浴锅中预热10min，按酶活比例2:1加入碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶，添加量为3000U/g蛋白质。继续在50℃水浴锅中进行酶解，酶解时间为3h。之后在90℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温后于10000rpm离心10min，取上清液，经定性滤纸过滤后冷冻干燥得到鲢鱼加工副产物水解物。
3)培养基的配制
依据Akk菌生长的需求，取250mL规格的锥形瓶，加入60mL纯水后，再加入2.22g脑心浸出液肉汤、0.03g L-半胱氨酸盐酸盐，0.13g鲢鱼加工副产物水解物充分搅拌均匀，使得额外添加的氮含量占培养基干基氮含量的6.74％。
实施例2
该实施例嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法包括以下步骤：
1)前处理
收集鲢鱼加工过程中产生的副产物：鱼头、鱼骨，用绞肉机将其均匀搅碎。将经过搅碎后的鲢鱼加工副产物和去离子水混合均匀，副产物和去离子水的质量比为1:2。之后于高压蒸汽灭菌锅中121℃处理1h，冷却至室温，放于4℃冰箱冷藏8h后去除上层脂肪。
2)酶解
将高温高压处理后的鲢鱼加工副产物和水的混合物在50℃水浴锅中预热10min，按酶活比例2:1加入碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶，添加量为3000U/g蛋白质。继续在50℃水浴锅中进行酶解，酶解时间为3h。之后在90℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温后于10000rpm离心10min，取上清液，经定性滤纸过滤后冷冻干燥得到鲢鱼加工副产物水解物。
3)培养基的配制
依据Akk菌生长的需求，取250mL规格的锥形瓶，加入60mL纯水后，再加入2.22g脑心浸出液肉汤、0.03g L-半胱氨酸盐酸盐、0.39g所制得的鲢鱼加工副产物水解物,充分搅拌均匀，使得额外添加的氮含量占培养基干基氮含量的20.22％。
实施例3
该实施例嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法包括以下步骤：
1)前处理
收集鲢鱼加工过程中产生的副产物：鱼头、鱼骨，用绞肉机将其均匀搅碎。将经过搅碎后的鲢鱼加工副产物和去离子水混合均匀，副产物和去离子水的质量比为1:2。之后于高压蒸汽灭菌锅中121℃处理1h，冷却至室温，放于4℃冰箱冷藏8h后去除上层脂肪。
2)酶解
将高温高压处理后的鲢鱼加工副产物和水的混合物在50℃水浴锅中预热10min，按酶活比例2:1加入碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶，添加量为3000U/g蛋白质。继续在50℃水浴锅中进行酶解，酶解时间为3h。之后在90℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温后于10000rpm离心10min，取上清液，经定性滤纸过滤后冷冻干燥得到鲢鱼加工副产物水解物。
3)培养基的配制
依据Akk菌生长的需求，取250mL规格的锥形瓶，加入60mL纯水后，再加入2.22g脑心浸出液肉汤、0.03g L-半胱氨酸盐酸盐、0.65g所制得的鲢鱼加工副产物水解物,充分搅拌均匀，使得额外添加的氮含量占培养基干基氮含量的33.7％。
对比例1
该对比例嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法包括以下步骤：依据Akk菌生长的需求，取250mL规格的锥形瓶，加入60mL纯水后，再加入2.22g脑心浸出液肉汤、0.03g L-半胱氨酸盐酸盐充分搅拌均匀。
对比例2
该对比例嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法包括以下步骤：
1)前处理
收集鲢鱼加工过程中产生的副产物：鱼头、鱼骨，用绞肉机将其均匀搅碎。将经过搅碎后的鲢鱼加工副产物和去离子水混合均匀，副产物和去离子水的质量比为1:2。之后于高压蒸汽灭菌锅中121℃处理1h，冷却至室温，放于4℃冰箱冷藏8h后去除上层脂肪。
2)酶解
将高温高压处理后的鲢鱼加工副产物和水的混合物在50℃水浴锅中预热10min，加入中性蛋白酶，添加量为3000U/g蛋白质。继续在50℃水浴锅中进行酶解，酶解时间为3h。之后在90℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温后于10000rpm离心10min，取上清液，经定性滤纸过滤后冷冻干燥得到鲢鱼加工副产物水解物。
3)培养基的配制
依据Akk菌生长的需求，取250mL规格的锥形瓶，加入60mL纯水后，再加入2.22g脑心浸出液肉汤、0.03g L-半胱氨酸盐酸盐、0.39g所制得的鲢鱼加工副产物水解物,充分搅拌均匀。
猪胃黏蛋白例1
猪胃黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法包括以下步骤：依据Akk菌生长的需求，取250mL规格的锥形瓶，加入60mL纯水后，再加入2.22g脑心浸出液肉汤、0.03g L-半胱氨酸盐酸盐充分搅拌均匀。另取0.15g猪胃黏蛋白溶于7.5mL 1M氢氧化钠溶液中，充分溶解后加入至培养基中混匀，然后加入浓盐酸调节pH至7.4。使得额外添加的氮含量占培养基干基氮含量的6.74％。
实验例1
分别按照实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、猪胃黏蛋白例1的步骤配制培养基。将Akk菌液按5％的接种量接种于上述技术方案所述的培养基中，37℃恒温培养。培养过程中每隔4h测定培养基在600nm下的吸光度，重复测三次取平均值，绘制Akk菌72h的生长曲线。图1表明了Akk菌在实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、猪胃黏蛋白例1培养基上的生长曲线。Akk菌在实施例3培养基和猪胃黏蛋白例1培养基上的生长曲线没有显著性差异(24-72h，P>0.05)，说明鲢鱼加工副产物水解物可以替代猪胃黏蛋白作为Akk菌培养基氮源。
将菌液接种于上述技术方案所述的培养基中，培养72h后，取出清洗、固定、脱水，通过扫描电镜对菌株表面形态及大小进行观察，成功观察到Akk菌体如图2所示，且镜下并未见其它明显杂菌，证明菌液中的菌为纯菌。结果表明，菌体呈现椭圆形，表面光滑无鞭毛。对比例1培养基组大小约为0.68×0.35μm，长宽比为1.96。实施例3培养基组大小约为0.83×0.35μm，长宽比为2.39。猪胃黏蛋白例1培养基组大小约为0.83×0.39μm，长宽比为2.13。与对比例1相比，实施例3培养基和猪胃黏蛋白例1培养基的细胞形态更长，长宽比更大，表面形态相似，对细胞无负面影响。
由以上实施例和对比例可以得出，采用本发明的培养基能够培养得到Akk菌，且大幅降低了Akk菌培养基的成本。利用鲢鱼加工副产物水解物替代猪胃黏蛋白作为Akk菌培养基氮源可以有效提高培养基安全性。同时解决鲢鱼加工副产物大量丢弃造成的资源浪费和环境污染问题，提高其经济价值，为鲢鱼加工副产物的高值化利用提供新思路。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，其原料包括：脑心浸出液肉汤、L-半胱氨酸盐酸盐和鱼加工副产物水解物；
所述鱼加工副产物水解物的制备方法包括：
将鱼加工副产物破碎、灭菌、去除脂肪后利用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解，将酶解产物过滤后即得鱼加工副产物水解物。
2.根据权利要求1所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，每60mL水中含有1.5-2.5g脑心浸出液肉汤、0.01-0.05g L-半胱氨酸盐酸盐、0.05-2g鲢鱼加工副产物水解物。
3.根据权利要求1或2所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，所述鱼加工副产物选自淡水鱼的加工副产物，优选所述鱼加工副产物包括鲢鱼加工副产物、罗非鱼加工副产物、鲶鱼加工副产物中的一种或几种；进一步优选所述鱼加工副产物为鲢鱼加工副产物。
4.根据权利要求1-3任一项所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，所述鱼加工副产物包括鱼头和鱼骨，所述鱼头与鱼骨的质量比为2.5-3.5:1.5-2.5。
5.根据权利要求1-4任一项所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，将破碎后的鱼加工副产物与水按照质量比0.5-1.5:1.5-2.5混合后再灭菌。
6.根据权利要求1-5任一项所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，所述灭菌的方式为高温高压灭菌；
所述灭菌的条件优选为120-122℃处理0.8-1.2h。
7.根据权利要求1-6任一项所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，按酶活比例1.8-2.2:0.8-1.2加入碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶。
8.根据权利要求1-7任一项所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法，其特征在于，在45-55℃下酶解2.5-3.5h。
9.一种嗜黏蛋白阿克曼菌培养基，其特征在于，其原料包括鱼加工副产物水解物，所述鱼加工副产物水解物的制备方法包括：
将鱼加工副产物破碎、灭菌、去除脂肪后利用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解，将酶解产物过滤后即得鱼加工副产物水解物；
优选的，所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基由上述权利要求1-8任一项嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的制备方法制备而成。
10.权利要求9所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基的使用方法，其特征在于，Akk菌在36-38℃下活化46-50h、传代34-38h后，将Akk菌接种于所述嗜黏蛋白阿克曼菌培养基中，进行厌氧培养。
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