CN115975040A - 埃氏拟杆菌肝素酶i融合蛋白及其编码基因和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝素酶融合蛋白制备技术领域，具体涉及埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法。埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，包括肝素酶I和麦芽糖结合蛋白，肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间连接有连接肽，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示。本方案可以解决使用生物工程技术获得的肝素酶的酶活性有限的技术问题，对建立表达效率高、酶活性高的肝素酶重组表达系统具有重要的理论和现实意义。

Description

埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法

技术领域

本发明涉及肝素酶融合蛋白制备技术领域，具体涉及埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法。

背景技术

肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素或者乙酰肝素分子的多糖裂解酶，分别为肝素酶I、II、III。肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)，此外，在许多微生物中也发现了肝素酶的存在，但至今肝素黄杆菌仍然是商品肝素酶的唯一来源。

自上世纪九十年代开始，已有大量的肝素酶I的基因工程表达研究和实践，其中以大肠杆菌为宿主的异源表达研究和应用最多。但是，在大肠杆菌中的表达肝素酶I，容易聚集成不溶性包涵体，形成包涵体肝素酶I很难再复性。此外，许多融合表达策略已被用于改善肝素酶I的生产。但是，针对肝素酶I的融合蛋白的研究，都是以肝素黄杆菌来源的肝素酶I为研究对象，并且表达的肝素酶I的活性和产量都难以达到工业化水平。因此寻找和建立表达效率高、酶活性高的肝素酶重组表达技术、以及寻找新型的可以商业化的肝素酶I，具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明意在提供埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，以解决使用生物工程技术获得的肝素酶的酶活性有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，包括肝素酶I和麦芽糖结合蛋白，肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间连接有连接肽，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示。

本方案的原理及优点是：肝素酶I大多以肝素黄杆菌来源的肝素酶I为研究对象，本方案以埃氏拟杆菌来源的肝素酶I为研究对象，拓宽了酶的来源。发明人从埃氏拟杆菌中克隆获得肝素酶I基因，并对其性质和表达条件进行了大量研究。与普通的肝素酶I基因不同，在使用埃氏拟杆菌来源的肝素酶I基因进行生物工程菌表达的时候，发明人发现表达的肝素酶I的活性有限，于是尝试了使用融合蛋白的方式来提升目的蛋白的活性。并通过大量研究和筛选发现，在制备肝素酶I和麦芽糖结合蛋白形成的融合蛋白时，需要在两个蛋白之间连接上核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示的连接肽。由于上述两种连接肽的加入，保证由工程菌表达的融合蛋白可以正确折叠，并保证理想的酶活性。如果在肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间不加入连接肽，获得的融合蛋白的活性显著低于含有连接肽的融合蛋白的活性。如果将本方案的连接肽更换为其他种类的连接肽，获得的融合蛋白的活性也不及本方案制备获得的融合蛋白。由此可见，连接肽的选择对于本方案至关重要，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示的连接肽可以较为显著地增加融合蛋白的目的活性，减少包涵体肝素酶I的产生量，进而拓宽肝素酶I的来源，进而可以克服现有的肝素酶I的活性和产量都难以达到工业化水平的技术问题，具有重要的理论和现实意义。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或者SEQ IDNO.14所示。由肝素酶I、连接肽和麦芽糖结合蛋白融合形成的蛋白质序列为SEQ ID NO.13或者SEQ ID NO.14。上述蛋白具有较高的原核表达量和活性，适应于工业化应用和大规模生产。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.10所示。由肝素酶I基因、连接肽核苷酸序列和麦芽糖结合蛋白基因融合形成的基因序列为SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.10。上述基因可以在原核表达系统中大量表达，形成活性高并适合于工业化应用的融合蛋白。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的基因整合在载体pMAL-c2x的多克隆位点上，形成表达载体。载体pMAL-c2x自带麦芽糖结合蛋白标签，为常用的商业化载体，易于获取和操作。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，包括如下依次进行的步骤：

S1表达载体的构建：

S2工程菌的制备：将表达载体转化进入大肠杆菌中，获得工程菌；所述大肠杆菌的菌种为TB1、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中的一种；

S3融合蛋白的表达：发酵并诱导所述工程菌，获得酶菌体；所述酶菌体中表达有埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白。

通过转基因感受态细胞，获得工程菌，并诱导工程菌表达目的蛋白，可实现埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的大量表达。

进一步，还包括S4融合蛋白的纯化：将所述酶菌体破碎后，离心取上清，获得粗酶；通过亲和柱层析获得纯化后的融合蛋白。通过细胞破碎和后续的纯化步骤，可以获得纯度较高的目的蛋白，高纯度的蛋白将用于后续的制药以及制备检测试剂的应用。

进一步，在S1表达载体的构建步骤中，包括以下步骤：

使用序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物P1和序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物P2，并以SEQ ID NO.2所示的麦芽糖结合蛋白基因为模板，克隆获得MBP-F；

使用序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物P4和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物P5，并以SEQ ID NO.1所示的氏拟杆菌肝素酶I基因为模板，克隆获得F-HEP；

将MBP-F、F-HEP和酶切处理后的载体pMAL-c2x三片段连接，获得表达载体。

进一步，在S1表达载体的构建步骤中，包括以下步骤：

使用序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物P1和序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物P3，并以SEQ ID NO.2所示的麦芽糖结合蛋白基因为模板，克隆获得MBP-R；

使用序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物P6和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物P5，并以SEQ ID NO.1所示的氏拟杆菌肝素酶I基因为模板，克隆获得R-HEP；

将MBP-R、R-HEP和酶切处理后的载体pMAL-c2x三片段连接，获得表达载体。

使用上述引物，通过多步PCR反映以及后续的片段连接过程，可以获得目的基因，并将目的基因连接到空载体中，获得表达载体。

进一步，在S2工程菌的制备中，将表达载体转化进入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中，获得工程菌。两种融合蛋白MBP-F-HEP与MBP-R-HEP分别在E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL都具有最高酶活，因此最优宿主菌为E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL。经过第二次筛选实验也验证了E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL是最佳宿主，可以应用于后续的工业化生产。

进一步，在S3融合蛋白的表达中，使用LB培养基30-37℃培养所述工程菌12-16h；然后使用M9YE培养基30-37℃培养工程菌至OD₆₀₀值为0.6-0.8；最后使用0.2mM的IPTG15-20℃诱导20-24h。通过大量筛选实验，IPTG终浓度为0.2mM时，获得的产物的发酵酶活与酶液酶活最高，是一种优化的方案。

附图说明

图1为本发明实施例1的带柔性连接肽的MBP的PCR扩增结果。

图2为本发明实施例1的带刚性连接肽的MBP的PCR扩增结果。

图3为本发明实施例1的带柔性连接肽的HEP的PCR扩增结果。

图4为本发明实施例1的带刚性连接肽的HEP的PCR扩增结果。

图5为本发明实施例1的MBP-F-HEP的PCR验证结果。

图6为本发明实施例1的MBP-R-HEP的PCR验证结果。

图7为本发明实施例2的融合蛋白酶活测定结果。

图8为本发明实施例2的MBP-F-HEP融合蛋白的蛋白电泳检测结果。

图9为本发明实施例2的MBP-R-HEP融合蛋白的蛋白电泳检测结果。

图10为本发明实施例3的最优工程菌第二次筛选结果。

图11为本发明实施例4的IPTG添加量的筛选结果。

图12为本发明对比例的连接肽作用研究结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：表达载体的构建

采用

HiFi DNA Assembly，并按其说明将埃氏拟杆菌肝素酶I基因片段(HEP，其核苷酸序列参见SEQ ID NO.1)插入载体pMAL-c2x多克隆位点(采用试剂盒

HiFi DNA Assembly)，然后将MBP标签(麦芽糖结合蛋白，其核苷酸序列参见SEQID NO.2)与肝素酶序列之间的连接肽替换成柔性(Flexibility)或刚性(Rigidity)连接肽。具体操作如下：

1.引物设计

(1)MBP引物对

根据MBP标签序列设计引物对，并在引物序列中添加柔性(Flexibility)或者刚性(Rigidity)连接肽的一部分。其上游引物与pMal-c2x相邻的地方要有重叠的同源序列，下游引物与相邻的埃氏拟杆菌肝素酶I序列要有重叠的同源序列，MBP引物对序列如下：

MBP-F(含有柔性连接肽的MBP引物对)：

上游引物P1：

(带边框碱基为Nde I的酶切位点，SEQ ID NO.3)

下游引物P2：

5’-AACCACCGCCACCGGATCCACCACCGCCGCTACCGCCGCCACCGCTGCCGCCACCACCCCTTCCCTCGATC CCGAGGTT-3’(带下划线的碱基为添加的部分柔性连接肽，SEQ ID NO.4)

MBP-R(含有刚性连接肽的MBP引物对)：

上游引物P1：

(带边框碱基为Nde I的酶切位点，SEQ ID NO.3)

下游引物P3：

5’-TCGCCGCTGCCTCTTTTGCGGCCGCCTCTTTCGCTGCCGCTTCCTTTGCGGCAGCCTCCCTTCCCTCGATC CCGAGGTT-3’(带下划线的碱基为添加的部分刚性连接肽，SEQ ID NO.5)

(2)埃氏拟杆菌肝素酶I引物对

根据埃氏拟杆菌肝素酶I序列设计引物对，并在引物序列中添加柔性(Flexibility)或者刚性(Rigidity)连接肽的一部分。其下游引物与pMal-c2x相邻的地方要有重叠的同源序列，埃氏拟杆菌肝素酶I引物对序列如下：

F-HEP(含有柔性连接肽的HEP引物对)：

上游引物P4：

5’-GCGGCGGTAGCGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGCAGCAAAAAGAACATCTTC ATCATC-3’(带下划线的碱基为添加的另一部分柔性连接肽，SEQ ID NO.6)

下游引物P5：

(带下划线的部分为与pMal载体同源的部分，带边框碱基为添加的终止密码子，SEQ ID NO.7)

R-HEP(含有刚性连接肽的HEP引物对)：

上游引物P6：

5’-AGCGGCAGCGAAAGAGGCGGCCGCAAAAGAGGCAGCGGCGAAAGAAGCTGCGGCCAAGAAAAAGAACATCT TCATCATC-3’(带下划线的碱基为添加的另一部分刚性连接肽，SEQ ID NO.8)

下游引物P5：

(带下划线的部分为与pMal载体同源的部分，带边框碱基为添加的终止密码子，SEQ ID NO.7)

2.MBP和HEP的PCR扩增

PCR反应体系：采用NEB的Q5TM High-Fidelity DNA Polymerase，按照说明书要求配制反应体系，使用“1.引物设计”中的引物分别对MBP和HEP进行体外扩增。扩增程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，55-70℃引物退火30s，72℃延伸90s，34个循环后，72℃终延伸5min结束反应。

PCR结果如图1-4所示(图1-4的底部数字表示采用的退火温度，单位℃)，表明扩增得到了带刚柔性连接肽的MBP序列与肝素酶序列，测序比对表明分子克隆正确。图1为带柔性连接肽的MBP序列(MBP-F)，最优退火温度是55℃；图2为带刚性连接肽的MBP序列(MBP-R)，最优退火温度是67℃；图3为带柔性连接肽的肝素酶序列(F-HEP)，最优退火温度是68.9-60.7℃；图4为带刚性连接肽的肝素酶序列(R-HEP)，最优退火温度是55℃。

3.构建含有目的片段的克隆载体

pMal-c2x空载体(含有Factor Xa和MBP，Factor Xa和MBP之间存在连接序列)用EcoR I与Hind III进行双酶切，后用

HiFi DNA Assembly分别进行pMal-c2x、MBP-F、F-HEP三片段连接，以及pMal-c2x、MBP-R、R-HEP三片段连接，根据说明书要求配制反应体系，于50℃反应20min，得到含有MBP-F-HEP片段(MBP-F-HEP融合蛋白的核酸序列，SEQID NO.9)的连接产物与含有MBP-R-HEP片段(MBP-R-HEP融合蛋白的核酸序列，SEQ IDNO.10)的连接产物。其中，柔性连接肽F的序列如SEQ ID NO.11所示，刚性连接肽R的序列如SEQ ID NO.12所示。

MBP-F-HEP片段和MBP-R-HEP片段均连接在pMal-c2x上，获得两种表达载体，分别为表达MBP-F-HEP融合蛋白的表达载体和表达MBP-R-HEP融合蛋白的表达载体。

4.基因转化以及阳性克隆筛选

将“3.构建含有目的片段的克隆载体”中获得的两种连接产物以现有技术的常规方法分别转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中。涂布至含100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上进行筛选，37℃培养16h(可选范围：12-20h)。MBP-F-HEP挑选菌落并以此为模板，用引物P1和P5进行菌落PCR鉴定，使用2×Easy Taq SuperMix进行菌落PCR，PCR反应体系及反应条件根据说明书设置。MBP-R-HEP挑菌落提取质粒进行用EcoR I与Hind III酶切验证。反应结束后，对产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。MBP-F-HEP结果如图5，1-5泳道分别为菌落PCR扩增结果，1、2、4、5泳道阳性，3泳道为阴性，M泳道为Marker；MBP-R-HEP结果如图6，用到1-4泳道分别为酶切验证结果，2、4泳道阳性，1、3泳道为阴性，M泳道为Marker。将筛选得到的阳性克隆菌交由生工生物进行测序。其中MBP-F-HEP的2号菌，MBP-R-HEP的4号菌测序比对结果正确。重组载体命名为MBP-F-HEP表达载体与MBP-R-HEP表达载体。MBP-F-HEP片段和MBP-R-HEP片段均连接在pMal-c2x上，获得两种表达载体，分别为表达MBP-F-HEP融合蛋白的表达载体(MBP-F-HEP表达载体)和表达MBP-R-HEP融合蛋白的表达载体(MBP-R-HEP表达载体)。

实施例2：埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的表达和纯化

1.融合蛋白的表达

提取大肠杆菌DH5α中的MBP-F-HEP表达载体和MBP-R-HEP表达载体，按照常规化转方法分别转化大肠杆菌TB1、BL21、BL21(DE3)(简称DE3)、BL21(DE3)pLysS(简称pLysS)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(简称RIPL)(厂家均为：唯地生物，货号分别是：EC1030/EC1001/EC1002/EC1003/EC1007)，通过氨苄青霉素筛选，得到TB1/MBP-F-HEP、BL21/MBP-F-HEP、DE3/MBP-F-HEP、pLysS/MBP-F-HEP、RIPL/MBP-F-HEP与TB1/MBP-R-HEP、BL21/MBP-R-HEP、DE3/MBP-R-HEP、pLysS/MBP-R-HEP、RIPL/MBP-R-HEP作为表达MBP-F-HEP与MBP-R-HEP的工程菌。

按照以下操作对上面的工程菌进行平行表达：将工程菌分别在含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基37℃(可选范围：30-37℃)培养16h(可选范围：12-16h)。然后按照1％接种量接入M9YE培养基(Yeast Extract 12.5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.76g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1g/L，121℃20min灭菌，冷却到50℃，加入灭菌后的1M MgSO₄ 1mL，40％(w/v)葡萄糖30mL，0.1M CaCl₂ 10mL)37℃(可选范围：30-37℃)培养OD₆₀₀至0.6-0.8后，加入终浓度为0.2mM IPTG 16℃(可选范围：15-20℃)诱导养22h(可选范围：20-24h)。10000rpm，6min离心，收集菌体并用Tris缓冲液(Tris-HCL 20mM，NaCl 500mM，pH7.4)洗涤两次，然后重悬菌体。将重悬液进行超声破碎，后10000rpm离心30min得到的上清即为含埃氏拟杆菌肝素酶I的粗酶。酶活检测采用UV232法，酶活定义为30℃每分钟降解底物肝素生成1μM不饱和糖醛酸的活力(IU)。

工程菌都表达除了有活性的可溶性埃氏拟杆菌肝素酶I蛋白，酶活检测结果如图7所示。可以发现MBP-F-HEP与MBP-R-HEP分别在E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL都具有最高酶活，因此最优宿主菌为E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL。

2.融合蛋白纯化

对最优宿主菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL表达的MBP-F-HEP与MBP-R-HEP蛋白分别进行纯化。因MBP-F-HEP与MBP-R-HEP均带MBP标签，能够与麦芽糖Dextrin Beads进行吸附实现纯化效果。按照以下步骤分别操作。

将Dextrin Beads装入空层析柱，Tris缓冲液(Tris-HCL 20mM，NaCl 500mM，pH7.4)为柱平衡液，用5倍填料体积的柱平衡液平衡填料，将粗酶倒入填料里，4℃旋转混匀1h，用柱平衡液重力流穿清洗填料2倍填料体积，后用清洗Tris缓冲液(Tris-HCL 20mM，NaCl150mM，pH7.4)清洗至无杂蛋白流出。用洗脱Tris缓冲液(Tris-HCL 20mM，NaCl 150mM，麦芽糖10mM，pH7.4)洗脱目标蛋白，即得纯酶。将粗酶与纯酶分别进行蛋白电泳，MBP-F-HEP融合蛋白如图8所示，M泳道为Marker(由上至下分子量依次均为130kDa、100kDa、70kDa、50kDa、35kDa、25kDa)，1-3泳道分别为菌体破碎液、菌体破碎上清(粗酶)、纯酶，箭头所指处为融合蛋白MBP-F-HEP(88kDa，SEQ ID NO.13)；MBP-R-HEP融合蛋白(SEQ ID NO.14)如图9所示，M泳道为Marker(由上至下分子量依次均为130kDa、100kDa、70kDa、50kDa、35kDa、25kDa)，1-3泳道分别为菌体破碎上清(粗酶)、菌体破碎液、纯酶，箭头所指处为融合蛋白MBP-R-HEP(89kDa)。

实施例3：最优工程菌第二次筛选

经过第一轮筛选后MBP-F-HEP与MBP-R-HEP分别筛选出表现较为优秀的TB1/MBP-F-HEP、RIPL/MBP-F-HEP、TB1/MBP-R-HEP、RIPL/MBP-R-HEP，按照第一轮相同的条件进行发酵表达。结果如图10所示，经过第二轮筛选后MBP-F-HEP与MBP-R-HEP的宿主菌种发酵酶活最高的仍然是RIPL/MBP-F-HEP和RIPL/MBP-R-HEP，进一步验证了我们的结论。

实施例4：IPTG添加量的筛选

按照相同的发酵表达方法，以RIPL/MBP-F-HEP菌株为例，选择添加不同终浓度的IPTG，分别为0.04mM、0.08mM、0.12mM、0.16mM、0.20mM。实验结果如图11所示，可以看出IPTG终浓度为0.2mM发酵酶活与酶液酶活最高。

对比例

为了研究连接肽的加入对于目的蛋白表达的作用，本对比例构建了不含有连接肽的融合基因即将MBP-R-HEP(SEQ ID NO.10)或者MBP-F-HEP(SEQ ID NO.9)中的连接肽序列(SEQ ID NO.12或者SEQ ID NO.11)去掉，获得MBP-HEP基因。按照实施例1和实施例2的方法，构建表达载体和进行蛋白表达，以上过程均为分子克隆的常规技术手段，在此不做赘述。按照常规化转方法转化进大肠杆菌TB1、BL21、BL21(DE3)(简称DE3)、BL21(DE3)pLysS(简称pLysS)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(简称RIPL)中，通过氨苄青霉素筛选，得到TB1/MBP-HEP、BL21/MBP-HEP、DE3/MBP-HEP、pLysS/MBP-HEP、RIPL/MBP-HEP作为表达MBP-HEP的工程菌。发酵表达条件得到粗酶，并进行酶活检测，测试结果参见图12(表达MBP-HEP融合蛋白的工程菌为图12右侧5种工程菌，图12左侧10种同图6)。由图12可知MBP-HEP转入各工程菌后，酶活产量均比不上替换连接肽后的MBP-F-HEP与MBP-R-HEP。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，其特征在于：包括肝素酶I和麦芽糖结合蛋白，肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间连接有连接肽，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.13或者SEQ ID NO.14所示。

3.根据权利要求2所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.10所示。

4.根据权利要求3所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的基因，其特征在于：其整合在载体pMAL-c2x的多克隆位点上，形成表达载体。

5.根据权利要求2所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下依次进行的步骤：

S1表达载体的构建：

S2工程菌的制备：将表达载体转化进入大肠杆菌中，获得工程菌；所述大肠杆菌的菌种为TB1、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中的一种；

S3融合蛋白的表达：发酵并诱导所述工程菌，获得酶菌体；所述酶菌体中表达有埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，其特征在于：还包括S4融合蛋白的纯化：将所述酶菌体破碎后，离心取上清，获得粗酶；通过亲和柱层析获得纯化后的融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，其特征在于：在S1表达载体的构建步骤中，包括以下步骤：

使用序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物P1和序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物P2，并以SEQ ID NO.2所示的麦芽糖结合蛋白基因为模板，克隆获得MBP-F；

使用序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物P4和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物P5，并以SEQ ID NO.1所示的氏拟杆菌肝素酶I基因为模板，克隆获得F-HEP；

将MBP-F、F-HEP和酶切处理后的载体pMAL-c2x三片段连接，获得表达载体。

8.根据权利要求6所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，其特征在于：在S1表达载体的构建步骤中，包括以下步骤：

使用序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物P1和序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物P3，并以SEQ ID NO.2所示的麦芽糖结合蛋白基因为模板，克隆获得MBP-R；

使用序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物P6和序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物P5，并以SEQ ID NO.1所示的氏拟杆菌肝素酶I基因为模板，克隆获得R-HEP；

将MBP-R、R-HEP和酶切处理后的载体pMAL-c2x三片段连接，获得表达载体。

9.根据权利要求6所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，其特征在于：在S2工程菌的制备中，将表达载体转化进入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中，获得工程菌。

10.根据权利要求9所述的埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的制备方法，其特征在于：在S3融合蛋白的表达中，使用LB培养基30-37℃培养所述工程菌12-16h；然后使用M9YE培养基30-37℃培养工程菌至OD₆₀₀值为0.6-0.8；最后使用0.2mM的IPTG 15-20℃诱导20-24h。

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