CN115974741A

CN115974741A - 一种基于锍盐的阳离子化合物及抗菌用途

Info

Publication number: CN115974741A
Application number: CN202310077541.3A
Authority: CN
Inventors: 李婧; 周晓东; 刘成才
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2023-01-13
Filing date: 2023-01-13
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明涉及化学合成与应用技术领域，具体涉及通式(A)的锍盐阳离子化合物，化合物具有抗菌的用途。公开了该类化合物的有机合成方法，锍上的三个取代基包含甲基、苄基和疏水烷烃链，以革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为测试菌株，以氯化十二烷基苄基铵(BAC)作为对照，检测锍盐化合物对菌株的最小抑菌浓度(MIC)强于对照物BAC，对大肠杆菌的最小杀菌浓度(MBC)与BAC相近，对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度强于BAC，菌株在锍盐阳离子抗菌剂作用后，菌体形态的变化，化合物对细菌膜结构产生破坏。

Description

一种基于锍盐的阳离子化合物及抗菌用途

技术领域

本发明涉及化学合成及应用技术领域，具体涉及一种有机合成的锍盐化合物及抗菌用途。

背景技术

致病性细菌、霉菌、真菌等每年都会引起的农作物、畜禽的病害，造成严重损失，各种耐药性致病菌的出现，使得在病害防治过程中难度加大。当前应用的各类抗菌剂能在一定程度上防治菌害，拥有低毒、高效、杀菌广谱等优点，但是仍然面临诸多问题，例如耐药性、选择性、杀菌药效时间、药物残留、生物降解等。细菌耐药性的出现，迫使对抗菌剂的研究不断深入。阳离子抗菌剂被广泛研究，例如季铵盐类、季鏻盐类、吡啶盐类、咪唑盐类以及烷基胍盐类等。它们具有快速杀菌、稳定长效等优点，多数的研究者认为阳离子抗菌剂的抗菌机制是带正电荷的抗菌剂能够与带着负电荷的细胞膜互相吸引，进而与细胞膜发生结合，而后能够打乱细菌的细胞膜的组成，细菌内的物质发生泄漏，导致菌体死亡。通常能有效地抑制并杀死病原微生物。但是近年来随着环境变化、长期施药等原因，使得阳离子抗菌剂也面临一些问题，比如出现耐药性、杀菌的持久性降低等。针对这些问题，阳离子抗菌剂的开发呈现出一些新的趋势，如通过复配得到效果更好的抗菌剂，开发新型具有高效持久的阳离子抗菌剂。在阳离子抗菌剂的研究中，近些年锍盐类阳离子抗菌剂在分子设计中越来越引起关注，孙静等报道了一组具有选择性抗菌能力的聚氨酸锍盐聚合物(Adv Mater，2021，33，e2104402)；饶静一等构建了聚锍化合物并探索化合物多细菌膜结构及生物被膜的破坏作用(ACS Macro Lett，2021，10，1643)，含有锍盐阳离子结构的化合物展现出多种多样的生物活性。锍类化合物作为抗菌剂的研究逐渐扩展开来，更多功能性化合物将被逐步开发出来。

发明内容

本发明以锍盐阳离子为结构主体的抗菌剂，锍上的三个取代基包含甲基、苄基和合适长度的疏水烷烃链；以革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为测试菌株，以氯化十二烷基苄基铵(BAC)作为对照，检测锍盐化合物对菌株的最小抑菌浓度(MIC)强于对照物BAC，最小杀菌浓度(MBC)与BAC相近，菌株在锍盐阳离子抗菌剂作用后菌体形态的变化，化合物对细菌膜结构产生破坏。

本发明的化合物通式A如下：

在A中，R＝C₁₂H₂₅、C₁₄H₂₉、C₁₆H₃₃；

上述通式的化合物可以是：

S-甲基-苄基-十二烷基锍鎓氯盐(A1)，

S-甲基-苄基-十四烷基锍鎓氯盐(A2)，

S-甲基-苄基-十六烷基锍鎓氯盐(A3)，

化合物A1-A3制备方法见Scheme 1。

Scheme 1

含有通式A的化合物的合成方法：溴化苄与硫醇在碱性下反应，生成硫醚中间产物，然后与碘甲烷在四氟硼酸银的条件下制得锍盐阳离子，经氯离子交换树脂交换后，得到锍盐阳离子抗菌剂A。

锍盐阳离子抗菌剂抗菌活性结果表明，A1、A2、A3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌活性，MIC和MBC的结果见表1。

表1锍盐化合物的MIC与MBC结果

采用透射电子显微镜(TEM)对菌体形态的观察，发现锍盐化合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜有破坏作用。结果如图1显示，未处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁光滑，细胞膜完整，轮廓清晰；经过MBC浓度的A1处理4h后，细菌细胞壁发生皱缩甚至破裂，细胞膜也受到破坏，内容物质流出；经A2、A3处理的细胞具有相同的结果。

附图说明

图1.透射电子显微镜下菌体形态图。A：大肠杆菌；B：锍盐A1处理的大肠杆菌；C：金黄色葡萄球菌；D：锍盐A1处理的金黄色葡萄球菌。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明锍盐阳离子抗菌剂的合成、结构表征以及抗菌实验作说明。

实施例1

S-甲基-苄基-十二烷基锍鎓氯盐(A1)，

在氩气保护条件下，将溴化苄(0.6mL，5mmol)与十二烷基硫醇(1.4mL，6mmol)溶解于DMF(30mL)中，加入氢化钠(0.3g，7.2mmol)室温搅拌反应12h，加蒸馏水淬灭反应之后用二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并二氯甲烷，干燥、浓缩，通过硅胶柱层析纯化，得到苄基十二烷基硫醚(0.95g，3.2mmol，产率65％)，R_f＝0.48(石油醚)，为黄色油状物；将苄基十二烷基硫醚(0.95g，3.2mmol)溶解于干燥乙腈(10mL)溶液中，加入碘甲烷(0.24mL，3.84mmol)，再加入四氟硼化银(0.75g，3.84mmol)，在室温下避光进行反应12h，过滤，加入强碱性阴离子交换树脂(Cl^-交换)50mg，搅拌2h，过滤，浓缩，通过硅胶柱层析(甲醇-二氯甲烷)纯化，得到A1(0.786g，2.56mmol，产率80％)，为黄色油状物，R_f＝0.3(甲醇-二氯甲烷1∶20)。¹H NMR(CDCl₃，δ)：7.50-7.40(m，5H，C₆H₅)，4.68(s，2H，CH₂)，3.28-3.25(t，J＝8.1Hz，2H，CH₂)，2.83(s，3H，CH₃)，1.75-1.61(m，2H，CH₂)，1.39-1.34(m，2H，CH₂)，1.30-1.20(m，16H，CH₂)，0.89-0.85(t，J＝7.4Hz，3H，CH3)；¹³C NMR(CDCl₃，δ)：130.79(2C)，130.24，129.73(2C)，126.93，46.06，40.94，31.90，29.58，29.44，29.38，29.33，29.20，28.86，28.29，24.37，22.68，21.63，14.12；HR-MS(ESI)m/z：Calcd for C₂₀H₃₅S{[M-Cl^-]⁺}307.5564，found：307.2594。

实施例2

S-甲基-苄基-十四烷基锍鎓氯盐(A2)，

在氩气保护条件下，将溴化苄(0.6mL，5mmol)与十四烷基硫醇(1.4mL，6mmol)溶解于DMF(30mL)中，加入氢化钠(0.3g，7.2mmol)室温搅拌，反应12h，加蒸馏水淬灭反应之后用二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并二氯甲烷，干燥、浓缩，通过硅胶柱层析纯化，得到苄基十四烷基硫醚(0.9g，2.8mmol，产率56％)，为透明晶状物，R_f＝0.43(石油醚)。苄基十四烷基硫醚(0.29g，1.42mmol)溶解于干燥乙腈(10mL)溶液中，加入碘甲烷(0.25mL，3.36mmol)，再加入四氟硼化银(0.65g，3.36mmol)，在室温下避光进行反应12h，过滤，加入强碱性阴离子交换树脂(Cl^-交换)50mg，搅拌2h，过滤，浓缩，通过硅胶柱层析(甲醇-二氯甲烷)纯化，得到产品A2(0.68g，1.85mmol，产率55％)，为黄色固体，R_f＝0.3(甲醇-二氯甲烷＝2∶25)。¹H NMR(CDCl₃，δ)：7.53-7.41(m，5H，C₆H₅)，4.68(s，2H，CH₂)，3.27-3.25(t，J＝8.0Hz，2H，CH₂)，2.83(s，3H，CH₃)，1.77-1.59(m，2H，CH₂)，1.39-1.34(m，2H，CH₂)，1.30-1.20(m，20H，CH₂)，0.89-0.85(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃)；¹³C NMR(CDCl₃，δ)：130.79(2C)，130.23，129.72(2C)，126.97，46.06，40.94，31.92，29.69，29.65，29.65，29.59，29.46，29.36，29.22，28.87，28.30，24.37，22.69，21.63，14.13；HR-MS(ESI)m/z：Calcd for C₂₂H₃₉S{[M-Cl-]+}335.2767，found：335.2590。

实施例3

S-甲基-苄基-十六烷基锍鎓氯盐(A3)，

在氩气保护条件下，将溴化苄(0.6mL，5mmol)与十六烷基硫醇(1.4mL，6mmol)溶解于DMF(30mL)中，加入氢化钠(0.3g，7.2mmol)室温搅拌反应12h，加蒸馏水淬灭反应之后用二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并二氯甲烷相，干燥、浓缩，通过硅胶柱层析纯化，得到苄基十六烷基硫醚(0.91g，2.6mmol，产率52％)，为透明晶状物，R_f＝0.4(石油醚)。苄基十六烷基硫醚(0.29g，1.42mmol)溶解于干燥乙腈(10mL)溶液中，加入碘甲烷(0.25mL，3.36mmol)，加入四氟硼化银(0.65g，3.36mmol)，在室温下避光进行反应12h，过滤，加入强碱性阴离子交换树脂(Cl^-交换)50mg，搅拌2h，过滤，浓缩，通过硅胶柱层析(甲醇-二氯甲烷)纯化，得到产物A3(0.62g，1.6mmol，产率50％)，为黄色固体，R_f＝0.3(甲醇-二氯甲烷2∶25)。¹H NMR(CDCl₃，δ)：7.56-7.41(m，5H，C₆H₅)，4.68(s，2H，CH₂)，3.27-3.25(t，J＝7.9Hz，2H，CH₂)，2.83(s，3H，CH₃)，1.74-1.61(m，2H，CH₂)，1.39-1.34(m，2H，CH₂)，1.30-1.20(m，24H，CH₂)，0.89-0.85(t，J＝7.1Hz，3H，CH₃)；¹³C NMR(CDCl3，δ)：130.79(2C)，130.25，129.74(2C)，126.91，46.05，40.93，31.93，29.71，29.70，29.69，29.67，29.65，29.60，29.46，29.37，29.22，28.88，28.30，24.38，22.70，21.62，14.13；HR-MS(ESI)m/z：Calcd for C₂₄H₄₃S{[M-Cl^-]⁺}363.3080，found：363.2853。

实施例4

最小抑菌活性MIC测试

将化合物A1、A2、A3以及BAC用DMSO溶解，配制成化合物溶液。将细菌培养到对数生长期，测定OD₆₀₀＝0.5，将菌悬液稀释成浓度为5×10⁵CFU·mL^-1，向96孔板中每孔加入200μL的菌悬液，分别加入1μL的A1、A2、A3和BAC于96孔板中，使化合物最终浓度为240μmol·L^-1、120μmol·L^-1、60μmol·L^-1、30μmol·L^-1、15μmol·L^-1、7.5μmol·L^-1、3.75μmol·L^-1。另设只含有培养基的孔，和只含有菌液的孔作为对照，平行3个副孔，放置于37℃的培养箱中培养16h。将96孔板放置酶标仪中，测定波长为600nm的吸光度，计算各化合物MIC。

实施例5

最小杀菌活性MBC测试

将细菌培养到对数生长期，测定OD₆₀₀＝0.5，将菌悬液稀释成浓度为5×10⁵CFU·mL^-1，向96孔板中每孔加入200μL的菌悬液，分别加入1μL的A1、A2、A3和BAC于96孔板中，使化合物最终浓度为大于等于MIC值，处理24h。混合物依次吸出50μL滴入到MH琼脂平板上，37℃恒温培养24h，观察菌落状态，以琼脂平板上计数少于5个单菌落的化合物浓度为最小杀菌浓度。

实施例6

透射电子显微镜(TEM)观察菌体形态

培养菌体至对数生长期，将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.5，取菌液1mL，在5000rmp/min，离心5min。用PBS清洗细菌细胞2次，离心后用200μL PBS重悬，加入MBC浓度的A1锍盐阳离子抗菌剂1μL，孵育4h。以未加抗菌剂的细菌细胞作为对照。通过离心收集细菌细胞，用超纯水清洗2次，离心后收集菌体，并用PBS溶液(pH 7.4)稀释10倍重悬，吸取10μL滴至铜网上，自然晾干后，以2％磷酸钨水溶液滴到碳膜上进行负染20s，用滤纸吸干磷钨酸，置于透射电镜下观察菌体形态。

Claims

1.通式(A)的化合物：

其中R＝C₁₂H₂₅、C₁₄H₂₉、C₁₆H₃₃。

2.根据权利要求1的通式(A)的化合物，其特征在于含有锍正离子基团。

3.根据权利要求1的通式(A)的化合物，其特征在于含有甲基。

4.根据权利要求1的通式(A)的化合物，其特征在于含有12、14、16个碳的直链烷烃基。

5.根据权利要求1的通式(A)的化合物，其中为下列任一化合物：

S-甲基-苄基-十二烷基锍鎓氯盐(A1)，

S-甲基-苄基-十四烷基锍鎓氯盐(A2)，

S-甲基-苄基-十六烷基锍鎓氯盐(A3)。

6.一种药物组合物，其中含有根据权利要求1的通式(A)的化合物。

7.根据权利要求1的通式(A)的化合物用于抗菌、杀菌的用途。

8.根据权利要求7的用途，通式(A)的化合物对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌产生抗菌杀菌作用。

9.根据权利要求7的用途，通式(A)的化合物的抗菌、杀菌作用是通过其正电基团与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌膜作用，细胞膜破裂，内容物流出，导致菌体死亡。