CN115960915A - 橡胶草中与天然橡胶含量相关的基因del及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及橡胶草中与天然橡胶含量相关的基因DEL及其应用。提供一种核酸分子，其包含如下(a1)‑(a4)的任一核苷酸序列：(a1)SEQ ID NO:1,3或5所示的核苷酸序列；(a2)与SEQ ID NO:1,3或5所示的核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列；(a3)编码SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(a4)编码与SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的橡胶草更多的乳管细胞数目以及更高的天然橡胶含量。本发明为橡胶草天然橡胶产量提升提供了新的基因资源，有助于加快橡胶草的驯化和改良，培育高产天然橡胶的橡胶草品种。

Description

橡胶草中与天然橡胶含量相关的基因DEL及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及橡胶草中与天然橡胶含量相关的基因DEL及其应用。

背景技术

天然橡胶(Natural rubber,NR)是在植物中合成的以顺式-1,4-聚异戊二烯为主要成分的天然高分子化合物，全球每年消费量超1,200万吨，价值达200亿美元，因性能优异，在很多应用领域无法被合成橡胶(Synthetic rubber,SR)替代。目前，巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)是天然橡胶最主要的商业化来源，但因病虫威胁、产胶周期长、仅能在热带种植等原因，亟需开发其他橡胶作物以进行天然橡胶的生产。

橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin,TKS)是一种原产于我国新疆与哈萨克斯坦地区的野生植物，其根部能合成高质量的天然橡胶，并且具有很强的环境适应性，可以在全球大部分地区种植。橡胶草中的乳管细胞(Laticifer cells)是合成和贮存天然橡胶的场所。乳管细胞是一类高度特化的细胞类型，为伸长的单细胞或者联结的多细胞，可形成错综复杂的网络结构，分布于植物全身。橡胶草的根部生物量、胶乳占根的比例(即乳管细胞密度)以及天然橡胶占胶乳的比例(即天然橡胶的合成)对橡胶草的天然橡胶产量具有重要影响。

为了使野生橡胶草能够真正成为具有生产和应用价值的经济作物，需要进一步提高其天然橡胶的含量。

发明内容

本发明从橡胶草中分离了一种与天然橡胶含量相关的基因，命名为DEL(DenseLaticifer Cells)基因，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1,3或5所示，其编码的蛋白质(DEL蛋白质)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2,4或6所示。该基因在橡胶草中的过量表达能够增加橡胶草根部的乳管细胞数目及天然橡胶含量。

本发明要解决的技术问题是提高橡胶草的天然橡胶含量。

为解决上述技术问题，本发明提供一种核酸分子，其包含如下(a1)-(a4)的任一核苷酸序列：

(a1)SEQ ID NO:1,3或5所示的核苷酸序列；

(a2)与SEQ ID NO:1,3或5所示的核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列；

(a3)编码SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(a4)编码与SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；

其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的橡胶草更多的乳管细胞数目以及更高的天然橡胶含量。

包含上述核酸分子的表达盒、载体或宿主菌也属于本发明的保护范围。

所述载体可以是克隆载体，包含上述核酸分子以及质粒复制所需的其它元件。所述载体也可以是表达载体，包含上述核酸分子以及能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了上述核酸分子的pB7WG2D载体。

所述宿主菌可以是包含上述克隆载体的宿主菌，例如E.coli DH5α，通过在适当的条件下培养细菌，使上述核酸分子得到复制。所述宿主菌也可以是包含上述表达载体的宿主菌，例如根癌农杆菌AGL1，通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术将表达载体转入橡胶草受体材料中，获得转基因橡胶草植株。

上述核酸分子在培育高橡胶含量的橡胶草植株中的应用也属于本发明的保护范围。

上述核酸分子在天然橡胶生产中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种获得高橡胶含量的橡胶草植株的方法，其特征在于，包括：增强橡胶草中DEL蛋白质的编码基因的表达，得到高橡胶含量的橡胶草；所述DEL蛋白质为如下(B1)或(B2)：

(B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:2,4或6所示的蛋白质；

(B2)SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加获得的具有相同功能的蛋白质。

上述方法中，所述DEL蛋白质的编码基因为上述核酸分子。

上述方法中，通过向橡胶草受体材料中导入包含上述核酸分子的过表达载体，获得高橡胶含量的橡胶草植株。

上述方法中，所述过表达载体通过农杆菌介导到所述橡胶草受体材料中。

本发明还提供一种生产天然橡胶的方法，其特征在于，包括：采用上述方法获得高橡胶含量的转基因橡胶草植株，培养所述转基因橡胶草植株并提取根中的天然橡胶。

本发明还提供一种蛋白质，为如下(B1)或(B2)：

(B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:2,4或6所示的蛋白质；

(B2)SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加获得的具有相同功能的蛋白质。

经实验证明，与野生型橡胶草相比，DEL基因过量表达的橡胶草在形态上表现出叶色淡绿、叶片与地面夹角变大、叶片之间聚拢成团、叶片数目增多的表型，其根部的中柱明显增大、乳管细胞层数以及同层乳管细胞的数目显著增多、乳管细胞指数(组织切片中根部横截面中乳管细胞所占的面积比例)显著提高、天然橡胶含量提高了2-3倍(图5)。

本发明为橡胶草天然橡胶产量提升提供了新的基因资源，有助于加快橡胶草的驯化和改良，对于高产天然橡胶的橡胶草品种的培育具有重要意义。

附图说明

图1显示了橡胶草突变体b318的植物表型、叶片数目、根部拉丝情况和天然橡胶含量。其中A为橡胶草野生型(WT)和b318突变体植株地上部分的表型；标尺长度为5厘米。B为橡胶草野生型(WT)与b318突变体在0.5个月和1个月时期的叶片数目统计结果；数值表示平均值±s.d.(n＝20)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。C为橡胶草野生型(WT)与b318突变体的干根拉丝表型；标尺长度为1mm。D为不同生长阶段(2、3、4个月)的橡胶草野生型(WT)与b318突变体的根部的天然橡胶相对含量(％)；数值表示平均值±s.d.(n＝3)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。

图2显示了b318突变体根部及乳管细胞表型分析。其中A为橡胶草野生型(WT)与b318突变体根部横向切片分析；白色虚线圈指示根部中柱的面积，标尺长度为500μm。B为橡胶草野生型(WT)与b318突变体根部纵向切片分析；标尺长度为500μm。C为橡胶草野生型(WT)与b318突变体培养4个月的根部乳管细胞层数统计分析；数值表示平均值±s.d.(n＝15)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。D为橡胶草野生型(WT)与b318突变体培养4个月的根部乳管细胞指数(％)统计分析；数值表示平均值±s.d.(n＝15)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。E为橡胶草野生型(WT)与b318突变体培养4个月的根部中柱面积占根部横切面比例(％)统计分析；数值表示平均值±s.d.(n＝15)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。

图3为DEL1、DEL2和DEL3蛋白质的氨基酸序列比对结果。

图4为b318突变体性状的遗传性分析、突变形式及DEL1基因的表达水平。其中A为橡胶草野生型(WT)，b318突变体，以b318突变体为母本、野生型为父本的杂交后代(b318♀)的植株表型(上排)及其根部横切片(下排)；图中标尺长度均为500μm。B为橡胶草野生型(WT)和b318突变体植物中DEL1基因的表达水平；数值表示平均值±s.d.(n＝3)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。C为橡胶草野生型(WT)和以b318突变体为母本、野生型为父本的杂交后代植物(b318♀)中DEL1基因的表达水平；数值表示平均值±s.d.(n＝3)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。

图5为转基因橡胶草的表型分析结果。其中A为橡胶草野生型(WT)和转基因橡胶草(35S::DEL1、35S::DEL2、35S::DEL3)生长3个月时的表型；上排为根部横切片，显示根部乳管细胞层数以及乳管细胞数目，标尺长度为500μm；中排为植株的侧视图，标尺长度为4cm；下排为植株的俯视图，标尺长度为5cm。B为橡胶草野生型(WT)和转基因橡胶草(35S::DEL1、35S::DEL2、35S::DEL3)生长3个月时根部3个DEL基因的表达水平。数值表示平均值±s.d.(n＝3)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。C为橡胶草野生型(WT)和转基因橡胶草(35S::DEL1、35S::DEL2、35S::DEL3)生长3个月时的乳管细胞指数(％)统计；数值表示平均值±s.d.(n＝9)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。D为橡胶草野生型(WT)和转基因橡胶草(35S::DEL1、35S::DEL2、35S::DEL3)生长3个月时根部的天然橡胶相对含量(％)；数值表示平均值±s.d.,(n＝3)，P值如图所示，显著性分析采用双尾学生t检验。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不用于限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册或厂商说明书；所使用的试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或通过常规方法制备。

以下实施例中使用的橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin,TKS)为已知的1151品系，由本实验室保存并繁种。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得该生物材料。

以下实施例中使用的菌株：

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α由本实验室保存，可商购获得。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1为本实验室保存的菌株，可从北京华越洋生物科技有限公司购买获得，货号为NRR01250。

以下实施例中使用的载体：

pDONR221载体是Gateway系统的DONR载体，为本实验室保存，可从Invitrogen公司购买获得，货号为12536017。双元载体pB7WG2D(Gateway)由本实验室保存，可从BioVectorNTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买获得。

以下实施例中使用的试剂与耗材：

油红O，购于Sigma-Aldrich公司，Oil Red O solution，Cat#O1391。天然橡胶标准品，购于Sigma-Aldrich公司，Cat#431257-100G。聚苯乙烯标准品(NIM-RM2068)购于中国计量科学院。KOD FX(Toyobo，货号：KFX-101)，KOD Plus(Toyobo，货号：KOD-201)，购自北京百灵克生物科技有限责任公司。TaKaRa Taq^TM，购自北京六合通经贸有限公司，货号：R001A。RNA快速提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司，货号：0416-50。

IIIFirst-Strand Synthesis System反转录试剂盒，购自Invitrogen，Cat#18080051。SsoFast

Supermix，购自Bio-Rad公司，Cat#1725201。琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号：DH101-01)、质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)(货号：DP102-01)购自北京博迈德基因技术有限公司。BP CLONASE II ENZYME MIX(货号：11789100)，LR CLONASE II ENZYME MIX(货号：11791020)为Invitrogen公司产品。胶乳提取RNA试剂盒购自Qiagen公司，货号：74804。MS培养基购自北京启维益成科技有限公司，货号：M0222.0050。MES、6-BA、NAA、植物凝胶购自Sigma公司。蔗糖购自国药集团化学试剂有限公司，货号：10021418。

实施例1.DEL基因的发现与克隆

1.橡胶草突变体b318的获得

所用的橡胶草SARE(sense/antisense RNA expression system)突变体库由本课题组构建而成。突变体的筛选鉴定方法如下：将橡胶草SARE突变体在温室培养1个月左右，根据地上部分有无表型进行编号。将编号归类后的突变体材料继续在温室中培养至3个月，此时将突变体从土壤中挖出，洗掉根部浮土，观察根部形态变化。取部分根，洗净烘干至恒重，采用折断法估算橡胶含量的多少，然后挑选拉丝变化明显的突变体植株，对其根部进行组织切片，统计乳管细胞层数、乳管细胞指数以及根部中柱面积占根部横切面比例。组织切片的方法参考文献(Sando,T.,Hayashi,T.,Takeda,T.,Akiyama,Y.,Nakazawa,Y.,Fukusaki,E.,and Kobayashi,A.(2009).Histochemical study of detailed laticiferstructure and rubber biosynthesis-related protein localization in Heveabrasiliensis using spectral confocal laser scanning microscopy.Planta 230,215-225.)，具体如下：取一小段长约1.5cm的橡胶草根，在80％乙醇中固定至少12h。切取中间约0.5cm小段，用低熔点琼脂糖包埋，振荡切片机切片，切片厚度100μm，去掉根切片周围的琼脂糖，用油红O染色1min，然后用45％冰醋酸漂洗一次，再用蒸馏水洗两次，用60％(v/v)甘油封片后置于体视镜(OLYMPUS SZX16)下观察并拍照。用ImageJ软件进行乳管面积统计，乳管细胞指数＝乳管细胞面积/根切片面积×100％。用ImageJ软件进行中柱面积统计，中柱面积比例＝中柱面积/根切片面积×100％。

经过上述筛选流程，发现了一个橡胶草株型明显改变、乳管细胞数目显著增多的橡胶草突变体，命名为b318。与野生型橡胶草相比，b318突变体的叶色淡绿、叶片与地面夹角变大、叶片之间聚拢成团并且叶片数目增多(图1A-B)，根中橡胶丝显著增多(图1C)，根部中柱明显增大、乳管细胞层数显著增多、同层乳管细胞的数目显著增多、乳管细胞指数显著提高(图2)。

采用同时期的橡胶草野生型和b318突变体的根部进行天然橡胶提取并定量。天然橡胶的提取方法参考文献(Kreuzberger,M.,Hahn,T.,Zibek,S.,Schiemann,J.,andThiele,K.(2016).Seasonal pattern of biomass and rubber and inulin of wildRussian dandelion(Taraxacum koksaghyz L.Rodin)under experimental fieldconditions.Eur.J.Agron.80,66-77.)并进行了适当修改，具体操作如下：将橡胶草在温室种植一定时间后取根，洗净，置于50℃烘箱中烘干至恒重，之后将其冷冻研磨成粉末，称取100mg粉末，置于2.0mL离心管中，加入1mL甲苯，将粉末全部悬起后再充分涡旋1min。于50℃下750rpm提取2h，10,000rpm室温离心10min，取上清，如此重复3次。将上清浓缩并定容至500μL，加入1mL甲醇，4℃放置30min后，离心去上清，加1mL蒸馏水，室温清洗10min，离心去上清，再加入1mL丙酮，室温清洗10min，离心去上清，干燥，得到天然橡胶，保存于零下20℃冰箱中。

采用文献(Rolere,S.,Liengprayoon,S.,Vaysse,L.,Sainte-Beuve,J.,andBonfils,F.(2015).Investigating natural rubber composition with FourierTransform Infrared(FT-IR)spectroscopy:a rapid and non-destructive method todetermine both protein and lipid contents simultaneously.Polym.Test.43,83-93.)中记载的傅里叶红外变换光谱法对橡胶草野生型和b318突变体的根部的天然橡胶含量进行检测。具体操作如下：

用甲苯配制不同浓度(0.5，1，2，4，6，8mg/mL)的天然橡胶标准品(Sigma-Aldrich，Cat#431257-100G)，每个浓度的标准品溶液取150μL，与15μL浓度为10mg/mL的聚苯乙烯标准品(中国计量科学院，NIM-RM2068)混匀，用移液器吸取70μL混合液，均匀涂于事先用压片机压制的溴化钾晶片上，并在烤箱中烤干，然后用远红外光谱仪(BRUKER，TENSOR 27)进行检测，检测过程中共对晶片扫描32次。所得的红外谱图经过简单气氛补偿、基线校正后，计算835cm^-1(天然橡胶吸收峰)和699cm^-1(聚苯乙烯吸收峰)的峰面积比值。以峰面积比值和天然橡胶浓度为坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程式X＝(Y-0.0698)/0.2596，R²＝0.9961，其中X代表天然橡胶浓度，Y代表835cm^-1和699cm^-1的峰面积比值。

将提取的橡胶草野生型和b318突变体的根部橡胶分别用1mL甲苯溶解，取150μL，加入15μL浓度为10mg/mL的聚苯乙烯标准品(中国计量科学院，NIM-RM2068)作为外标，混匀，用移液器吸取70μL混合液，按照上述方法进行红外光谱检测，计算835cm^-1(天然橡胶吸收峰)和699cm^-1(窄分布聚苯乙烯吸收峰)的峰面积比值。将得到的橡胶草天然橡胶吸收峰与聚苯乙烯吸收峰的峰面积比值代入上述标准曲线X＝(Y-0.0698)/0.2596，计算天然橡胶的浓度。天然橡胶的相对含量(％)＝天然橡胶的浓度(mg/mL)×提取用的甲苯体积(mL)/提取橡胶所用的根的粉末质量(mg)×100％。

经过检测发现，不同生长时期的b318突变体中天然橡胶含量较野生型均有显著增加，b318突变体中天然橡胶含量是同时期野生型橡胶草中天然橡胶含量的2-3倍(图1D)。

2.突变体中插入序列的鉴定

采用CTAB法从突变体幼嫩的叶片中抽提总DNA作为模板，利用载体引物Primer F1和Primer R1通过聚合酶链式反应(PCR)扩增b318突变体中插入的cDNA片段，按照PCR酶KODFX(TOYOBO，KFX-101)的产品说明书配制PCR体系(50μL)。PCR产物用载体引物Primer F2和Primer R2进行一代测序，获得了插入序列的信息。

载体引物的序列如下：

Primer F1:5’-TCGCATGCCTGCAGGTCACT-3’

Primer R1:5’-CCAACCACGTCTTCAAAGC-3’

Primer F2:5’-GAGAGAGATAGATTTGTAGAGAG-3’

Primer R2:5’-TCATTTGGAGAGGACTCCGGT-3’。

测序结果显示，b318突变体是由野生型橡胶草的基因组中正向插入了一个1,291bp的cDNA片段造成。通过在NCBI和橡胶草1151品系参考基因组中比对，发现该片段中包含70bp的5'UTR区，1,101bp的编码区及120bp的3'UTR区。该基因被命名为DEL1(Denselaticifer cell 1,DEL1)，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质(DEL1蛋白质)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。通过与橡胶草1151参考基因组中全部基因所编码的蛋白序列进行比对，发现测序品系1151中并没有与DEL1蛋白序列完全一致的蛋白，但存在两个与DEL1蛋白质有98％以上氨基酸相似性的蛋白(图3)。因构建SARE突变体库时，所用cDNA为多个品种的混合样品，为方便区分，将参考基因组中比对到的两个基因分别命名为DEL2(Dense laticifer cell 2,DEL2)和DEL3(Dense laticifer cell 3,DEL3)。DEL2基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的蛋白质(DEL2蛋白质)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。DEL3基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的蛋白质(DEL3蛋白质)的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

RNA提取及反转录：分别取橡胶草野生型和突变体b318生长3个月的根洗净，液氮研磨，用RNA快速提取试剂盒(华越洋，0416-50)按照产品说明书提取RNA。该试剂盒中配有DNA酶，可去除总RNA中的DNA污染。将总RNA溶于试剂盒中的洗脱缓冲液EB中。通过紫外分光光度计测定230nm、260nm、280nm的OD值，进行RNA的质量检测和定量。以Oligo dT为引物，使用

III First-Strand Synthesis System反转录试剂盒(Invitrogen，18080051)按照产品说明书对提取的RNA进行反转录，得到cDNA。

DEL1基因表达的定量分析：以cDNA为模板，使用SsoFast

Supermix(Bio-Rad，1725201)按照产品说明书配制荧光定量PCR反应体系。使用实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD，CFX96)进行PCR反应。PCR反应体系为：2×SsoFast mix 5μL；cDNA 2μL；上下游引物(1μM)各1.5μL。PCR反应程序为：98℃，30s；(98℃，5s→60℃，5s→信息采集)，40个循环；60-95℃，0.5℃/5s，信息采集/5s。程序运行完毕后通过BIO-RAD CFX Manager软件对数据进行分析。

实时荧光定量PCR使用的引物如下：用于检测DEL1表达水平的引物qDEL1-F和qDEL1-R(扩增得到位于DEL1编码区3’末端的105bp片段)，以及用于检测GAPDH内参基因(http://bigd.big.ac.cn/gwh/，登录号：PRJCA000437，Gene ID：evm.model.utg9113.3)表达水平的引物qGAPDH-F和qGAPDH-R(扩增得到位于DEL1编码区3’末端的244bp片段)。

上游引物qDEL1-F:5’-TATGGTGGTCAAGGATATGGTTAC-3’；

下游引物qDEL1-R:5’-TGATTGCTGATCTCCACCACC-3’。

上游引物qGAPDH-F:5’-AGTTGGTTTCGTGGTATGAC-3’；

下游引物qGAPDH-R:5’-ACATGTCAGTGAACAGGTAGAC-3’。

DEL1 mRNA的相对表达水平参照文献(Livak,K.J.,and Schmittgen,T.D.(2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCRand the 2^-ΔΔCt Method.Methods 25,402-408.)中记载的方法进行计算。首先计算ΔCt＝DEL1的Ct减去GAPDH的Ct；ΔΔCt＝b318突变体中ΔCt减去野生型中ΔCt；用公式2^-ΔΔCt计算出实验组每个样品相对于对照组的表达量。

经过RT-PCR检测发现，b318突变体及其杂交后代中DEL1基因的表达量均显著上调(图4)。该结果表明b318突变体的表型是可以稳定遗传的，且DEL1基因的过量表达可能参与调控b318突变体的突变表型。

实施例2.DEL基因的功能验证

1.过表达载体的构建

使用引物GW-DEL-F与GW-DEL-R，以b318突变体的基因组DNA为模板，扩增获得长度为1101bp的DEL1基因片段。使用引物GW-DEL-F与GW-DEL-R，以橡胶草野生型1151品系的胶乳cDNA为模板，扩增获得长度分别为1110bp和1101bp的DEL2基因片段和DEL3基因片段。

上游引物GW-DEL-F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGAGTCAGACGAAGGGAAGCT-3’；

下游引物GW-DEL-R：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTACTGGTAACCAGTCTGCCCATTA-3’。

PCR体系为：10×KOD Plus Buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO₄ 2μL，KODPlus(1.0U/μL)1μL，GW-DEL-F(10μM)0.75μL，GW-DEL-R(10μM)0.75μL，DNA模板2μL，ddH₂O补足至50μL。

PCR程序为：94℃3min；98℃10s，55℃30s，68℃1min，30个循环；68℃10min。

PCR反应结束后，取1μL反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(博迈德生物，货号DH101-01)按照试剂盒说明书提供的操作步骤回收条带大小正确的基因片段。

利用BP反应将DEL1/DEL2/DEL3基因片段分别同源重组到中间载体pDONR221上。BP反应体系和反应条件如下：基因片段150ng，pDONR221载体150ng，BP Clonase II EnzymeMix 1μL，1×TE(pH＝8.0)补足至10μL；25℃孵育10h；加入Proteinase K 1μL，37℃孵育10min，得到BP反应产物，置于冰上。

用BP反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化产物涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种于500μL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm活化3h，然后利用引物DEL-TEST-F和M13R进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。

引物DEL-TEST-F：5’-TATGGAAACCCTGGTGGACTG-3’

引物M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’

PCR体系为：2×GC Buffer 10μL，2mM dNTPs 2μL，TaKaRa Taq(5U/μL)0.2μL，DEL-TEST-F(10μM)0.3μL，M13R(10μM)0.3μL，菌液2μL，ddH₂O补足至20μL。

PCR程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

将菌液PCR鉴定的阳性克隆送北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。将测序正确的阳性克隆接种于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，用质粒小量快速提取试剂盒(北京博迈德，DP102-01)，按照试剂盒说明书提取质粒。得到重组质粒pDONR221-DEL1、pDONR221-DEL2和pDONR221-DEL3。

利用LR反应将DEL1/DEL2/DEL3基因片段分别同源重组到双元载体pB7WG2D上。LR反应体系和反应条件如下：pDONR221-DEL1/pDONR221-DEL2/pDONR221-DEL3质粒150ng，pB7WG2D质粒150ng，LR Clonase II Enzyme Mix 1μL，1×TE(pH＝8.0)补至10μL；25℃孵育10h；加入Proteinase K：1μL，37℃孵育10min，得到LR反应产物，置于冰上。

用LR反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化产物涂布于含50μg/ml壮观霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落，接种于500μL含50μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm活化3h，然后利用引物DEL-TEST-F和T35S-R进行菌液PCR，鉴定阳性克隆。

引物T35S-R：5’-TCGCATGCCTGCAGGTCACT-3’

PCR体系为：2×GC Buffer 10μL，2mM dNTPs 2μL，TaKaRa Taq(5U/μL)0.2μL，DEL-TEST-F(10μM)0.3μL，T35S-R(10μM)0.3μL，菌液2μL，ddH₂O补足至20μL。

PCR程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

将菌液PCR鉴定的阳性克隆送北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。将测序正确的阳性克隆接种于10mL含50μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，用质粒小量快速提取试剂盒(北京博迈德，DP102-01)，按照试剂盒说明书提取质粒。得到DEL1、DEL2和DEL3基因的过表达载体35S::DEL1、35S::DEL2和35S::DEL3。

2.转化根癌农杆菌

用测序正确的过表达载体35S::DEL1、35S::DEL2、35S::DEL3分别转化根癌农杆菌AGL1，得到菌株AGL1-35S::DEL1、AGL1-35S::DEL2和AGL1-35S::DEL3。具体方法如下：将-80℃保存的根癌农杆菌AGL1感受态细胞在冰浴中融化。每50μL感受态细胞加入150ng质粒，然后电击感受态细胞，电击参数为1.8kV。电击完成后，加入无抗生素的LB液体培养基，28℃，200rpm培养3小时。将培养的菌液于5000rpm离心1分钟收集菌体，弃掉大部分上清液，留100μL左右的上清液，轻轻吹打，重悬菌块后涂布于含有25mg/L利福平和50mg/L壮观霉素的YEP固体培养基平板上，28℃暗培养48h后，挑取单克隆接种于含有25mg/L利福平和50mg/L壮观霉素的YEP液体培养基中，28℃过夜振荡培养后，将菌液按1:100的体积比接种到含有25mg/L利福平和50mg/L壮观霉素的YEP液体培养基中并添加乙酰丁香酮至终浓度为100μM，培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，室温离心收集菌体，去上清，用等体积的含100μM乙酰丁香酮的侵染液充分悬浮，得到侵染菌液。

上述YEP液体培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L，调节pH至7.0。YEP固体培养基在YEP液体培养基的基础上添加琼脂15g/L。

上述侵染液的配方为：MS 4.405g/L、MES 0.5g/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.01mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L，调节pH至5.2。

3.转基因橡胶草的获得

以橡胶草1151品系作为转化受体材料，利用农杆菌浸染橡胶草组培苗根获得转基因植株，所用菌株为AGL1-35S::DEL1、AGL1-35S::DEL2和AGL1-35S::DEL3，每个菌株均独立转化橡胶草组培苗根。具体转化方法如下：取生长状态良好的橡胶草组培苗根，切成约0.5mm的小段，用侵染菌液侵染约10-20min，然后将侵染后的根捞至无菌滤纸上吸去多余菌液并晾干，在21-23℃，黑暗条件下共培养2-3天后，将侵染的橡胶草根转移到抗性愈伤诱导培养基上进行筛选培养，至绿色抗性芽点出现，转移至抗性壮苗培养基中进行筛选培养，培养1-2个月，培养温度为21℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为60-80μmol s^-1m^-2，得到转基因橡胶草。

上述抗性愈伤诱导培养基的配方为：400mg/L特美汀、Basta 10mg/L、MS 4.405g/L、MES 0.5g/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.01mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶3.6g/L，调节pH至5.8。

上述抗性壮苗培养基的配方为：400mg/L特美汀、Basta 10mg/L、MS 2.286g/L、MES0.5g/L、蔗糖10g/L、植物凝胶3.6g/L，调节pH至5.8。

4.转基因橡胶草中DEL基因的表达水平分析

以野生型橡胶草为对照，对转基因橡胶草进行RT-PCR，分析DEL基因的表达水平。

RNA提取和反转录：将生长3个月的转基因橡胶草从土中挖出洗净并擦干水分，取根部的部分组织，迅速用液氮速冻。用RNA快速提取试剂盒(华越洋，0416-50)按照产品说明书提取T₀代转基因橡胶草根部的RNA。以Oligo dT为引物，使用

III First-Strand Synthesis System反转录试剂盒(Invitrogen，18080051)按照产品说明书对提取的RNA进行反转录，得到cDNA。

DEL基因表达的定量分析：以cDNA为模板，使用SsoFast

Supermix(Bio-Rad，1725201)按照产品说明书配制荧光定量PCR反应体系。使用实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD，CFX96)进行PCR反应。PCR反应体系为：2×SsoFast mix 5μL；cDNA 2μL；上下游引物(1μM)各1.5μL。PCR反应程序为：98℃，30s；(98℃，5s→60℃，5s→信息采集)，40个循环；60-95℃，0.5℃/5s，信息采集/5s。程序运行完毕后通过BIO-RAD CFX Manager软件对数据进行分析。

实时荧光定量PCR使用的引物如下：用于检测DELs表达水平的引物qDELs-F和qDELs-R，为DEL1、DEL2、DEL3三个基因序列一致的区域设计的引物；用于检测GAPDH内参基因表达水平的引物qGAPDH-F和qGAPDH-R。

上游引物qDELs-F：5’-GCCGTGGTGGAGGTTATCAA-3’；

下游引物qDELs-R：5’-CATAGCCGGAGTAAGCTGGG-3’。

结果显示，与野生型橡胶草相比，T₀代35S::DEL1转基因橡胶草、T₀代35S::DEL2转基因橡胶草以及T₀代35S::DEL3转基因橡胶草中DEL基因的mRNA水平均有显著提高(图5B)。

5.转基因橡胶草中乳管细胞数目和天然橡胶含量的分析

将野生型橡胶草与T₀代转基因橡胶草在常规条件下培养：温室培养条件为温度21℃，长日照(16h光照/8h黑暗)，光照强度为80-120μE·m^-2·s^-2。待植物生长1个月后，观察植物的地上部分表型，发现35S::DEL1转基因橡胶草、35S::DEL2转基因橡胶草和35S::DEL3转基因橡胶草在叶形、叶色、株型等方面的表型也均与突变体材料b318一致(图5)。待植物生长3个月后，对野生型橡胶草和转基因橡胶草的根部进行组织切片，统计乳管细胞指数(组织切片中根部横截面中乳管细胞所占的面积比例)，并测定野生型橡胶草和转基因橡胶草根部的天然橡胶含量。组织切片的方法、乳管细胞指数的统计方法、天然橡胶含量的测定方法同实施例1。

结果显示，与野生型橡胶草相比，35S::DEL1转基因橡胶草、35S::DEL2转基因橡胶草和35S::DEL3转基因橡胶草的株型明显改变，具体表现为叶色淡绿、叶片与地面夹角变大、叶片聚拢成团、叶片数目增多(图5A，中排和下排)；根部的中柱明显增大、乳管细胞层数显著增多、同层乳管细胞的数目显著增多(图5A，上排)、乳管细胞指数显著提高(图5C)；根部的天然橡胶含量显著升高(图5D)。以上结果证明，DEL1、DEL2、DEL3基因与橡胶草乳管数目和天然橡胶含量相关，说明DEL1，DEL2，DEL3蛋白质及其编码基因可为橡胶草的育种工作提供理论基础和遗传资源，对于橡胶草的遗传改良及高产橡胶的橡胶草品种的培育具有重要意义。

Claims (10)

1.一种核酸分子，其包含如下(a1)-(a4)的任一核苷酸序列：

(a1)SEQ ID NO:1,3或5所示的核苷酸序列；

(a2)与SEQ ID NO:1,3或5所示的核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列；

(a3)编码SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(a4)编码与SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列具有至少90％序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；

其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的橡胶草更多的乳管细胞数目以及更高的天然橡胶含量。

2.包含权利要求1所述的核酸分子的表达盒、载体或宿主菌。

3.权利要求1所述的核酸分子在培育高橡胶含量的橡胶草植株中的应用。

4.权利要求1所述的核酸分子在天然橡胶生产中的应用。

5.一种获得高橡胶含量的橡胶草植株的方法，其特征在于，包括：增强橡胶草中DEL蛋白质的编码基因的表达，得到高橡胶含量的橡胶草；所述DEL蛋白质为如下(B1)或(B2)：

(B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:2,4或6所示的蛋白质；

(B2)SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加获得的具有相同功能的蛋白质。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DEL蛋白质的编码基因为权利要求1所述的核酸分子。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，通过向橡胶草受体材料中导入包含权利要求1所述的核酸分子的过表达载体，获得橡胶含量高于受体材料的橡胶草植株。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过表达载体通过农杆菌介导到所述橡胶草受体材料中。

9.一种生产天然橡胶的方法，其特征在于，包括：采用权利要求5-8任一所述的方法获得高橡胶含量的转基因橡胶草植株，培养所述转基因橡胶草植株并提取根中的天然橡胶。

10.一种蛋白质，为如下(B1)或(B2)：

(B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:2,4或6所示的蛋白质；

(B2)SEQ ID NO:2,4或6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加获得的具有相同功能的蛋白质。

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