CN115960876A - 一种天冬氨酸β-脱羧酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶催化技术领域，尤其是一种天冬氨酸β‑脱羧酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，与野生型天冬氨酸β‑脱羧酶相比具有更高的热稳定性。本发明的天冬氨酸β‑脱羧酶突变体在45℃‑60℃的活性更持久，能有效缩短反应周期；该突变体对反应的冷却系统要求不高，因而降低了能耗并降低了成本。而且可在室温下运输保存，有效延长保质期。另外，在高温催化反应的条件下，避免了杂菌的生长机会，从而减少了细菌的代谢产物对产品的污染，有助于增加底物的溶解度，提高单位体积的生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种天冬氨酸β-脱羧酶突变体。
背景技术
L-丙氨酸，即L-α-氨基丙酸，是人体中一种小的非必需氨基酸，丙氨酸是蛋白质构建中最广泛使用的氨基酸之一，参与色氨酸和维生素吡哆醇的代谢。它参与糖和酸代谢，可提高免疫力，并为肌肉组织、大脑和中枢神经系统提供能量，增强免疫系统，并在动物中显示出降低胆固醇的作用。L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，已应用于众多领域，如食品、制药和化学工业。L-丙氨酸可作为合成氨基酸表面活性剂螯合剂MGDA的原料，同时也是合成维生素B6、甜味剂阿力甜和氨基丙醇(用于生产盐酸左氧氟沙星)的重要中间体。
在化学合成中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常用方法。但该方法存在产品质量差、合成路线长、收率低、成本高、环境污染严重等缺点，目前已基本被淘汰。几十年来，L-丙氨酸的商业生产一直由使用底物L-天冬氨酸的天冬氨酸β-脱羧酶(ASD)进行。Chibata以40％的L-天冬氨酸为催化底物催化生成L-丙氨酸，72h内L-丙氨酸收率超过90％(I.Chibata,T.Kakimoto and J.Kato,Appl.Microbiol.,1965,13,638–645)。Fusee用聚氨酯预聚物固定P.dacunhae的全细胞，通过每天提供23％的L-天冬氨酸与0.1mMα酮戊二酸和0.1mM 5-磷酸吡哆醛(PLP)，在31天内连续将L-天冬氨酸转化为L-丙氨酸。ASD由于其对L-天冬氨酸的高活性，在工业上被成熟地应用于生产L-丙氨酸(M.C.Fusee and J.E.Weber,Appl.Environ.Microbiol.,1984,48,694–698)。
随着基因编辑和代谢工程的发展，L-丙氨酸的生产正在向经济的发酵方法转变。Zhou等将野生型大肠杆菌敲除丙氨酸消旋酶，并敲入L-丙氨酸脱氢酶基因，最终在摇瓶水平产量可达67.2g/L(Li Zhou,CanDeng,Wen-Jing Cui,Zhong-Mei Liu,Zhe-MinZhou.Efficient L-alanine production by a thermo-regulated switch inEscherichia coli.Applied Biochemistry and Biotechnology,2016,178:324-337)。Zhang利用一种工程化的大肠杆菌W(大肠杆菌W)使用葡萄糖作为碳源在48小时内产生113.8g/L L-丙氨酸(X.Zhang,K.Jantama,J.C.Moore,K.T.Shanmugam and L.O.Ingram,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,77,355–366)。Jojima等利用谷氨酸棒状杆菌工程菌在厌氧下32小时产生98g/L L-丙氨酸(T.Jojima,M.Fujii,E.Mori,M.Inui and H.Yukawa,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,87,159–165)。Zhou等通过温度调节工程大肠杆菌，减轻了L-丙氨酸对细胞生长的抑制，在40小时内获得120.8g/L L-丙氨酸(L.Zhou,C.Deng,W.Cui,Z.Liu and Z.Zhou,Appl.Biochem.Biotechnol.,2016,178,324–337)。
但与酶催化相比，发酵法生产L-丙氨酸具有光学纯度差、副产物多、纯化困难等明显缺点。特别是在厌氧条件下，许多细胞内溶物及副产物在长期培养后由于细胞溶解而释放出来。氨基丙醇因涉及加氢反应对杂质要求高，发酵法指标远达不到合格要求，而进一步纯化的成本甚至超过L丙氨酸的生产成本，使得发酵路线应用面较窄，仅能满足部分化工需求，如MGDA合成。随着对L-丙氨酸作为药物前体的需求不断增加，生产具有高光学纯度的L-丙氨酸变得越来越必要。
天冬氨酸β-脱羧酶(EC 4.1.1.12)是一种催化下列化学反应的酶，L-天冬氨酸＝L-丙氨酸+CO2。因此，这种酶有一个底物——L-天冬氨酸，和两个产物——L-丙氨酸和CO2。该反应是L-丙氨酸工业合成的基础。这种酶属于裂解酶家族，特别是羧基裂解酶，其裂解碳-碳键。该酶类的系统名称是L-天冬氨酸4-羧基裂解酶(L-丙氨酸形成)。常用的其他名称包括脱硫酶、氨基丙二酸脱羧酶、天冬氨酸β-脱羧酶、天冬氨酸ω-脱羧酶、天冬氨酸ω-脱羧酶、天冬氨酸β-脱羧酶、L-天冬氨酸β-脱羧酶、半胱氨酸亚磺酸脱硫酶、L-半胱氨酸亚磺酸脱硫酶和L-天冬氨酸4-羧基裂解酶。该酶参与丙氨酸和天冬氨酸代谢和半胱氨酸代谢。它使用一种辅助因子——磷酸吡哆醛(PLP)。编码L-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。
CN1155716C通过诱变获得一株具有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L-天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长。
CN109536429A异源表达了不动杆菌(Acinetobacter sp.ACNIH2)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶，全细胞催化法生产L-丙氨酸，37℃、200r/min下进行全细胞反应(振荡反应)。但是存在的问题主要有三个：(1)反应体系菌体OD600为300，仅菌体的成本远远超过产品的价值。(2)底物浓度过低，仅为800mM的天冬氨酸钠。(3)反应温度过低，仅为37℃，不利于高浓度底物生成高浓度产物。
CN105018405A公布了一种睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CICC11023s来源的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因，反应9小时，L-丙氨酸的产量仅为112.7g/L，生产速率12.5g/(L·h)，转化率仅为93.9％，满足不了工业化规模生产的成本要求。
CN114107270A公布了一种碱性条件下酶活提高且稳定性提高的突变体E88R，在45、55℃水浴锅中温育30min后，突变体酶E88R在温度45℃和50℃的残余酶活分别为85％、59％。但由于酶活损失较大，没有对更高温度进行测试。
因此，寻找一种热稳定更好的天冬氨酸β-脱羧酶突变体成为了本领域亟需解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天冬氨酸β-脱羧酶突变体。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明所述的天冬氨酸β-脱羧酶突变体，比野生型天冬氨酸β-脱羧酶具有更高的热稳定性，所述野生型天冬氨酸β-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种多核苷酸，可编码上述的天冬氨酸β-脱羧酶突变体。
进一步的，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的天冬氨酸β-脱羧酶突变体与野生型天冬氨酸β-脱羧酶相比，表现出更好的热稳定性，在45℃-60℃的活性更持久。
(2)本发明的天冬氨酸β-脱羧酶突变体具有诸多优点：①加快动力学反应，能有效缩短反应周期；②简化了酶提取流程，宿主细胞蛋白在高温下变性凝结沉淀，易与目的蛋白分离；③对反应的冷却系统要求不高，因而降低了能耗并降低了成本；④稳定性提高后的蛋白可在室温下运输保存，并且有效延长保质期；⑤在高温催化反应的条件下，避免了杂菌的生长机会，从而减少了细菌的代谢产物对产品的污染；⑥高温有助于增加底物的溶解度，提高了单位体积的生产效率。
(3)本发明的天冬氨酸β-脱羧酶突变体用于高温催化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸的制备，反应温度更高，底物溶解度更高，故而可有效增加底物浓度，可有效加快动力学反应并提高生产效率。
(4)本发明的天冬氨酸β-脱羧酶在化工、食品、制药和能源开发等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为底物、产物标准品薄层色谱结果。上方显色条带为产物L-丙氨酸，下方显色条带为底物天冬氨酸。
图2为实施例5反应4小时结果，左侧为突变体反应，右侧为突变前反应。
图3为实施例5反应6小时结果，左侧为突变体反应，右侧为突变前反应。
图4为实施例6反应4小时结果，左侧为使用盐酸，右侧为使用甲酸。
图5为实施例7反应2小时结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。
实施例1野生型天冬氨酸β-脱羧酶基因序列的获得
通过全基因合成的方法，对Myxococcus sp.来源的天冬氨酸β-脱羧酶基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
| 2mM dNTP mix(2mM each dNTP) | 5μl |
| 10×Pfu buffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。
将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO：2，命名为ASDIwt，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
实施例2天冬氨酸β-脱羧酶突变体基因序列的获得
天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其源于实施例1的野生型天冬氨酸β-脱羧酶，能够高温催化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。该天冬氨酸β-脱羧酶突变体，与野生型天冬氨酸β-脱羧酶相比表现出更强的热稳定性。天冬氨酸β-脱羧酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
| 2mM dNTP mix(2mM each dNTP) | 5μl |
| 10×Pfu buffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。
将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ ID NO：4，命名为ASDI，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
实施例3摇瓶表达测试
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
实施例4分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。初级接种菌种制备200ml培养物，OD2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当OD600约为50.0(湿重约为100g/L)时，控制温度为28℃，并用0.15mM IPTG诱导表达。
实施例5反应速率的比较
50mM pH 6.5TrisHCl，终浓度250gL L天冬氨酸(先用氨水调节至7.5使用)，调至pH7.5后加入2mM MgCl2，0.2mM PLP，将温度设为56度，最后加入10g/L两种粗酶液。底物、产物标准品薄层色谱结果如图1所示。取4小时、6小时样品点板，结果见图2、图3。可见突变后6小时没有底物残留，而突变前由于高温条件下造成蛋白的快速失活，只能反应到一半产物不再增加，表明此时已完全丧失酶活。
实施例6
50mM pH 6.5TrisHCl，终浓度300gL L天冬氨酸(先用氨水调节至6.5使用)，调至pH7.5后加入2mM MgCl2，0.2mM PLP，将温度设为56度，最后加入5g/L两种粗酶液。中间分别用盐酸、甲酸控制pH至6.5，取4小时样点板，如图4所示，表明甲酸调pH，结果显示效果很差，对反应不利。
实施例7快速反应测试
50mM pH 7.5TrisHCl，终浓度250gL L天冬氨酸(先用氨水调节pH6.5后使用)，加入2mM MgCl2，0.2mM PLP，将温度设为48℃，最后加入25g/L粗酶液。2小时点板，显示已反应完，结果见图5。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其特征在于：比野生型天冬氨酸β-脱羧酶具有更高的热稳定性，所述野生型天冬氨酸β-脱羧酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
3.一种多核苷酸，其编码如权利要求1或2任一项所述的天冬氨酸β-脱羧酶突变体。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：序列如SEQ ID NO：4所示。
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