CN115960377A - 一种特异性荧光指示片及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性荧光指示片及其制备方法，所述指示片采用相转化法制备，以无纺布玻璃纤维、涤纶、氯纶、锦纶、或多孔尼龙作为支撑层，将指示片制备溶液在所述支撑层上刮制得到表面功能层和过滤层的荧光指示片；所述指示片制备溶液是高分子溶液和特异性荧光颗粒的混合溶液；所述高分子溶液由致孔剂和高分子基材溶解在溶剂中所得。本发明所述特异性荧光指示片的荧光信号非常稳定，具有灵敏度高、检出限低、操作简单、便携、易于存放运输、适用于现场快速检测等优点，能够实现实际样品中农药、三聚氰胺、瘦肉精、吡咯素等待测物的精准定量。

Description

一种特异性荧光指示片及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学检测领域，具体是涉及一种特异性荧光指示片及其制备方法及在快速检测中的应用。

背景技术

荧光纳米材料目前在分析领域得到高度关注，目标分析物与荧光纳米材料接触，会直接引起荧光材料的荧光淬灭或增强，或通过抑制淬灭效应间接地造成荧光增强，根据荧光材料荧光强度的变化来实现对目标分析物定量检测。

目前荧光纳米材料绝大多数都是分散在溶液中，以液体的形式进行荧光强度变化测定，进行快速检测，其存在以下弊端：一是这种方法在检测之前仍需要一些前处理净化步骤；二是荧光纳米颗粒在加入到溶剂前需要充分碾磨，荧光纳米材料在溶液中容易团聚或沉淀，从而造成检测结果不够精确；三是以液体的形式进行快速检测，不便携。四是食品基质复杂在对实际样品检测时容易受其他基质干扰。

现有一些技术将荧光纳米材料分散到滤纸中，制备成微流控纸芯片。而纤维具有亲水特性，因而纳米颗粒难以稳定地保留在其表面，颗粒在检测时易从纸质基材中脱落到样品溶液中；而且荧光纳米材料在纸质基质中分布很不均匀，还容易产生光环的“扩散效应”，降低了检测性能，限制了其实际应用。而且这种芯片也只具备荧光信号输出功能，不具备样品前处理功能。

目前食品中农药、三聚氰胺、瘦肉精、吡咯素等有害物的检测技术主要是仪器分析法，通常存在仪器昂贵、分析时间长、需要专业技术操作人员等诸多缺陷。一些快速检测方法存在前处理步骤繁琐、目标物不能充分有效提取、灵敏度低、检出限高的问题。特异性荧光分子印迹在快速检测中得到越来越多的关注，但是目前绝大多数方法都是将荧光分子印迹颗粒分散在溶液中，以液体的形式进行快速检测，弊端一是在用荧光分子印迹颗粒检测之前仍需要一些前处理净化步骤，二是颗粒在溶液中溶液团聚或沉淀，荧光性能不够稳定，从而造成检测结果不够精确；三是以液体的形式进行快速检测，不便携。四是食品基质复杂在对实际样品检测时容易受其他基质干扰。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种特异性荧光指示片及其制备方法及在快速检测中的应用，所述特异性荧光指示片除了兼具样品净化和荧光信号输出功能，还具有荧光性能更加稳定、更优的检测线性的优势。

本发明的第一个方面，是提供一种特异性荧光指示片，其采用相转化法将特异性荧光材料装载到高分子材料的基材中。

一种特异性荧光指示片，其采用相转化法制备，以无纺布、玻璃纤维、涤纶、氯纶、锦纶、或多孔尼龙作为支撑层，将指示片制备溶液在所述支撑层上刮制得到具有表面功能层和过滤层的荧光指示片；所述指示片制备溶液是高分子溶液和特异性荧光颗粒的混合溶液；所述高分子溶液由致孔剂和高分子基材溶解在溶剂中所得；所述表面功能层由所述特异性荧光颗粒和高分子基材制备构成，所述过滤层主要由高分子基材构成。

在其中一些实施例中，所述特异性荧光颗粒是本领域中常规的荧光材料@分子印迹颗粒，或磁性荧光材料@分子印迹颗粒，其中，荧光材料可以为硒化镉/硫化锌、碲化镉、硫化镉、硒化镉、硫化铅、碳点、石墨烯量子点等常规材料。

所述荧光材料@分子印迹颗粒，或磁性荧光材料@分子印迹颗粒可由反相微乳法、本体聚合法、沉淀聚合法或溶胶凝胶法制备得到。

在其中一些实施例中，所述特异性荧光颗粒由以下方法制备得到：1)环己烷作为溶剂、曲拉通作为表面活性剂，搅拌获得微乳化体系；2)将荧光材料@分子印迹颗粒、硅酸四乙酯和氨水混合进行硅烷化反应；3)加入待检测物或其类似物的模板分子、功能单体聚合获得聚合物；4)用洗脱液洗脱模板分子后获得特异性荧光颗粒。

在其中一些实施例中，所述特异性荧光颗粒由以下方法制备得到：将待检测物或其结构类似物的模板分子、功能单体、以及致孔剂、碳点CDs溶液聚合；加入交联剂和引发剂，封口聚合，离心除去上清液，除去未反应的试剂，洗脱模板分子，即得；所述功能单体与交联剂聚合获得聚合物。

在其中一些实施例中，所述功能单体是3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯吡啶、席夫碱、硼酸酯等。功能单体能提供特定功能基团与交联剂聚合获得聚合物。交联剂是用于原位固定化功能单体，使高分子聚合物形成一定的空间网络结构，这样当制备时模板分子去除后，聚合物仍保留与模板分子互补的三维孔穴。

在其中一些实施例中，特异性荧光颗粒制备中的所述致孔剂是乙腈。

在其中一些实施例中，所述高分子溶液由致孔剂和高分子基材溶解在溶剂中所得。优选地，所述致孔剂为聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇。

根据检测对象的亲水或亲油性选取合适的高分子材料基材。待测体系为水性时，选择亲水性材质如、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚氯乙烯(PVC)等，待测物体系为疏水性时，选择疏水性材质如聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)等。

在其中一些实施例中，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

在其中一些优选的实施例中，所述致孔剂在高分子溶液中的质量百分比浓度为1％-5％，优选为1％-3％。

在其中一些实施例中，所述高分子基材在高分子溶液中的质量百分比浓度为3％-30％，优选为5％-20％，更优选为5％-15％。

在其中一些实施例中，在所述混合液中，所述特异性荧光颗粒与溶剂的用量比为1-10mg，优选为3-6mg：1ml。

在其中一些实施例中，所述特异性荧光颗粒与高分子溶液的用量比为0.1-50mg:1，0.5-5mg:1ml。

本发明的第二个方面，是提供了上述特异性荧光指示片的制备方法，包括以下步骤：

制备得到所述特异性荧光颗粒；

制备所述高分子溶液；

将所述特异性荧光颗粒溶于溶剂，得到特异性荧光颗粒溶液；

将特异性荧光颗粒溶液与高分子溶液混合均匀，在支撑层上刮刀刮片，纯净水浴相转化，获得所述特异性荧光指示片。

本发明的第三个方面，是提供了所述特异性荧光指示片在农产品有害物质检测中的应用。

所述有害物质为农药、三聚氰胺、瘦肉精、吡咯素等有害物。

所述农产品包括有蔬菜、牛奶、粮食、和食品。

所述食品为饮料、酒、茶、水果、肉、面包、咖啡、酱油以及热加工食品等。

本发明通过相转化法，构建得到特异性功能层-过滤层组成的特异性指示片结构，指示片特异性功能层中的特异性荧光颗粒能与待测目标物充分结合，进而猝灭，从而达到高度灵敏的快速检测的效果；指示片过滤层的孔状结构，能够将样品中的干扰成分过滤去除，从而达到样品净化的效果。

本发明所述制备的特异性荧光指示片，由于荧光信号稳定，可以灵敏快速地应用于检测农药、三聚氰胺、瘦肉精、吡咯素等待测物，集样品前处理与荧光信号输出为一体，整个检测过程在30min以内完成。本发明所述特异性荧光指示片具有表面功能层和过滤层，由于特异性荧光颗粒被装载在固体指示片里，克服了颗粒以液体的形式进行检测时发生团聚、沉淀现象造成的荧光信号不稳定的技术瓶颈，荧光信号非常稳定；且荧光指示片的过滤层兼具精华功能，使得检测时具有更高的灵敏度；指示片的表面特异性功能层的反复吸附富集作用，使得方法的检出限更低；而且本发明所述荧光指示片的制备方法不需要进行复杂的前处理，操作简单、便携、易于存放运输、适用于现场快速检测等优点。能够实现实际样品中农药、三聚氰胺、瘦肉精、吡咯素等待测物的精准定量。

附图说明

图1为本发明制备的碳点@分子印迹(CDs@MIPs)特异性荧光指示片在400nm激发波下的荧光发射图。

图2为本发明制备的CDs@MIPs特异性荧光颗粒的扫描电镜图。

图3为本发明制备的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片表面和断面的扫描电镜图。

图4为本发明制备的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片的荧光比值随时间变化曲线。

图5为溶液形式保存的CDs@MIPs特异性荧光颗粒荧光比值随时间变化曲线。图6为本发明制备的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片的荧光比值随紫外照射时间变化曲线。

图7为溶液形式保存的CDs@MIPs特异性荧光颗粒荧光比值随紫外照射时间变化曲线。

图8为本发明提供的特异性荧光指示片快速检测应用示意图。

图9为应用本发明制备的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片绘制的基质标准曲线。

图10为应用CDs@MIPs特异性荧光颗粒绘制的基质标准曲线。

图11为本发明制备的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片动态吸附时间曲线。

图12为CDs@MIPs特异性荧光颗粒动态吸附时间曲线。

图13为本发明制备的硒化镉/硫化锌@分子印迹(CdSe/ZnS@MIPs)特异性荧光指示片在430nm激发波下的荧光发射图。

图14为本发明制备的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒的扫描电镜图。

图15为本发明制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片表面和断面的扫描电镜图。

图16为本发明制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片的荧光比值随时间变化曲线。

图17为溶液形式保存的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒荧光比值随时间变化曲线。

图18为本发明制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片的荧光比值随紫外照射时间变化曲线。

图19为溶液形式保存的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒荧光比值随紫外照射时间变化曲线。

图20为应用本发明制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片绘制的基质标准曲线。

图21为应用CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒绘制的基质标准曲线。

图22为本发明制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片动态吸附时间曲线。

图23为CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒动态吸附时间曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

特异性荧光指示片将特异性荧光分子印迹颗粒装载在成固态的片状，制备成特异性荧光指示片。本发明所制备的特异性荧光指示片快速检测方法，减少了现有制备方法中的复杂的前处理过程，有良好的过滤性能，达到集样品前处理与信号输出为一体，避免了颗粒的团聚，可以实现大量样品中痕量物质的富集，提高了精确度，大大降低了检出限；同时特异性荧光指示片中的分子印迹位点能特异性识别目标物，指示片的孔状结构能过滤去除食品基质中其他干扰成分从而提高灵敏度；特异性荧光指示片特异性吸附食品中农药、三聚氰胺、瘦肉精、吡咯素等待测目标物后，引起特异性荧光指示片中的量子点荧光变化，根据特异性荧光指示片的荧光值变化对待测物进行快速检测。其使用方便、快速、特异强、成本低、操作简单，不需要专业人员和大型昂贵仪器，可为食品安全快速检测提供新的策略，并具备实际推广应用价值。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例公开了菊酯类农药特异性荧光指示片的制备及在黄瓜中农药残留快速测定中的应用，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备菊酯类农药的碳点@分子印迹(CDs@MIPs)特异性荧光颗粒:采用沉淀聚合法进行制备。

称取0.5mmol高效氯氟氰菊酯(LC)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL乙腈(致孔剂)溶解模板，然后加入2mmol的甲基丙烯酸(MAA)作为功能单体，2mL碳点CDs溶液，室温震摇预聚合30min；随后加入5mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)作为交联剂和30mg偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，充氮5min后立即封口，60℃水浴中聚合反应24h；聚合完成后，取出聚合物，离心(4000rpm，3min)除去上清液，再加入甲醇充分分散后离心，以除去未反应的溶液，滤纸包裹后放入索式抽提器中，用乙酸：甲醇＝1:9溶液交替洗脱模板直至模板洗脱完全，HPLC检测不到模板分子为止。

(2)相转化法制备聚偏氟乙烯特异性荧光指示片(PVDF-CDs@MIPs)。

将聚偏氟乙烯5％，致孔剂聚乙烯吡咯烷酮1％，N,N-二甲基甲酰胺94％混合，80℃下磁力搅拌溶解，静置24h以除去气泡。先去取1mL上述溶液，再另取5mg所制备的CDs@MIPs特异性荧光颗粒溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺，异丙醇等作为转化溶剂，将二者充分混合。将该高分子聚合物作为制备特异性荧光指示片的溶液倒在洁净的玻璃板上，用150μm刮刀匀在玻璃板上迅速均匀刮完后，静置30s后将玻璃板浸入室温水固化浴中，获得特异性荧光指示片。利用荧光光谱仪测定其荧光强度，结果如图1所示。从图1可以看出，加入菊酯类农药的碳点@分子印迹(CDs@MIPs)特异性荧光颗粒后，PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片在550nm的发射下，呈现出良好的荧光峰形。

(3)性能

①扫描电镜

CDs@MIPs特异性荧光颗粒的扫描电镜图如图2所示。

所述PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片表面和断面的扫描电镜图如图3(a)和3(b)所示。

从图3可见，CDs@MIPs特异性荧光颗粒较为均匀的分布在特异性荧光指示片的表面(形成特异性功能层)，在特异性荧光指示片断面(特异性荧光指示片的过滤层)也分布有少量的CDs@MIPs特异性荧光颗粒。当待测物随着样品经过特异性荧光指示片时，特异性荧光指示片表面特异性功能层由于CDs@MIPs特异性荧光颗粒的存在，会特异性识别吸附待测物，而样品基质中的干扰成分会由于特异性荧光指示片过滤层的净化作用而被过滤去除。

②荧光稳定性

考察PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片、CDs@MIPs特异性荧光颗粒乙腈分散液的荧光稳定性。荧光分光光度计测量荧光值，第一天的初始荧光值记为F0。避光保存，每隔5天记录一次荧光强度值F，观察F/F0的变化。PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片和CDs@MIPs特异性荧光颗粒乙腈分散液的荧光变化F/F0随保存时间的曲线分别如图4和图5所示。

由图4可见，本发明所制备的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片荧光稳定性强，在放置了30天后，荧光值基本保持不变。

其他一般方法把特异性荧光颗粒分散在溶剂中进行检测，CDs@MIPs特异性荧光颗粒的分散液30天后，颗粒荧光有明显下降，仅为初始值的65％。

③紫外稳定性

考察PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片、CDs@MIPs特异性荧光颗粒甲醇分散液的紫外稳定性。荧光分光光度计每隔1h检测一次荧光，第0h测量荧光值记为F0。分别将PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片、CDs@MIPs特异性荧光颗粒甲醇分散液放置在紫外灯箱内照射，每隔1h记录一次荧光强度，记为F，观察F/F0的变化。PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片、CDs@MIPs特异性荧光颗粒甲醇分散液紫外照射下的荧光变化随时间曲线分别如图6和图7所示。

由图6可见，本发明中的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片在紫外照射了6h后，荧光基本保持稳定，紫外稳定性好。现有的特异性荧光颗粒溶液形式，在紫外照射6h后，荧光有明显下降。

(4)标准曲线,线性更好：

所述PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片的标准曲线：取5g黄瓜粉碎，涡旋离心取上清液，将聚偏氟乙烯特异性荧光指示片(PVDF-CDs@MIPs)放置在自动循环推送设备上，调节过滤压力0.1MPa，流速2mL/min，过滤吸附12min后，得到空白基质液，指示片的使用过程示意图如图8所示。取1mg/ml菊酯农药标准溶液，用空白基质液进行稀释，分别配置浓度为5μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L、300μg/L6个浓度的菊酯类农药标准溶液。再分别将6个浓度的菊酯类农药标准溶液置于放置聚偏氟乙烯特异性荧光指示片(PVDF-CDs@MIPs)的自动循环推送设备上，调节过滤压力0.1MPa,流速2mL/min，过滤吸附12min后，取出特异性荧光指示片，荧光仪测定特异性荧光指示片的荧光(激发波400nm，发射波556nm，狭缝3nm)，绘制以特异性荧光指示片荧光值F₀/F作y轴，不同浓度菊酯类农药作x轴的标准曲线。参见图9。由图9可见，随着菊酯类农药浓度的增加，指示片的荧光强度下降，所述PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片的标准曲线R²＝0.9908，F0/F值在5-300μg/L范围内线性增加。

现有特异性荧光颗粒溶液检测方法的标准曲线：称取20g黄瓜，置于烧杯中捣碎，加入30ml丙酮和30ml石油醚，于捣碎机上捣碎2min，捣碎液经过抽滤，滤液移入250ml分液漏斗中，加入100ml2％硫酸钠水溶液，充分摇匀，静止分层，将下层溶液转移到另一250ml分液漏斗中，用40ml石油醚萃取，合并三次萃取的石油醚层，过无水硫酸钠层，于蒸发旋转仪上浓缩至10ml，得到空白基质液。取1mg/ml菊酯农药标准溶液，用空白基质液进行稀释，分别配置浓度为5μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L、300μg/L6个浓度的菊酯类农药标准溶液。将合成的CDs@MIPs颗粒配置成1mg/ml的乙腈分散溶液，分别取150μL的CDs@MIPs特异性颗粒分散溶液和150μL的菊酯类农药基质标准溶液，加入到96孔板中进行静态吸附，发生荧光猝灭。平衡30分钟后，放入酶标仪进行检测。绘制以特异性荧光颗粒荧光值F0/F作y轴，不同浓度菊酯类农药作x轴的标准曲线，如图10所示。

由图10可见，随着菊酯类农药浓度的增加，混合体系荧光强度下降，R²＝0.9802，F0/F值在5 -300μg/L，F0范围内线性增加。

采用本发明方法所制备的菊酯类农药特异性荧光指示片的标准曲线线性更优，R²＝0.9908，在5-300μg/L的浓度范围内表现出良好的线性响应(y＝0.0026+1.0989)。我们发现，这是由于现有的CDs@MIPs特异性荧光颗粒溶液检测形式，是将特异性荧光颗粒均匀分散在溶剂中，置于96孔板进行酶标仪检测。而CDs@MIPs的分散液在用酶标仪进行荧光读取时，颗粒需要先在孔板中震荡摇匀，立即上机检测，随着时间增长，特异性荧光颗粒将会在分散液中发生团聚和沉淀，荧光检测值也随之降低，并随着时间变化荧光值而产生较大的变动幅度。本发明将CDs@MIPs特异性荧光颗粒加入到高分子聚合物中形成PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片，指示片更强荧光稳定性，使得PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片检测方法具备更优的线性。

(5)实际样品测定：

①无需前处理，更快更简便

现有的CDs@MIPs特异性荧光颗粒液体形式在实际样品检测运用中，需要十分复杂的前处理过程，称取20g黄瓜，置于烧杯中捣碎，加入30ml丙酮和30ml石油醚，于捣碎机上捣碎2min，捣碎液经过抽滤，滤液移入250ml分液漏斗中，加入100ml2％硫酸钠水溶液，充分摇匀，静止分层，将下层溶液转移到另一250ml分液漏斗中，用40ml石油醚萃取，合并三次萃取的石油醚层，过无水硫酸钠层，于蒸发旋转仪上浓缩至10ml，得到净化液。且净化液再进行荧光吸附30min后，达到吸附平衡，进行荧光测定。

本发明方法所制备的PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片，由于指示片中过滤层的存在，具备净化作用，使得检测方法在实际样品检测运用中，无需繁琐的前处理净化步骤，直接将黄瓜、苹果等进行榨汁离心后，取1ml上清液用PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片通过恒流泵进行反复吸附。吸附时间从30min缩短到12min即可实现指示片的完全猝灭，大大缩短了检测步骤和时间。PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片和CDs@MIPs颗粒的吸附平衡变化曲线分别如图11和图12所示。

②方法更精准，检出限更低

本发明方法所制备的菊酯类农药特异性荧光指示片检测方法：分别在黄瓜中添加不同浓度的菊酯类农药标准溶液。经聚偏氟乙烯特异性荧光指示片(PVDF-CDs@MIPs)过滤12min后，取出特异性荧光指示片，荧光光谱仪测定特异性荧光指示片的荧光，得到聚偏氟乙烯特异性荧光指示片(PVDF-CDs@MIPs)方法检出限，计算回收率，如表1所示。

现有特异性荧光颗粒液体检测方法：20g黄瓜捣碎，在黄瓜中添加10μg/L、80μg/L、180μg/L不同浓度的菊酯类农药标准溶液，加入30ml丙酮和30ml石油醚，于捣碎机上捣碎2min，捣碎液经抽滤，滤液移入250ml分液漏斗中，加入100ml2％硫酸钠水溶液，充分摇匀，静止分层，将下层溶液转移到另一250ml分液漏斗中，用40ml石油醚萃取，合并三次萃取的石油醚层，过无水硫酸钠层，蒸发旋转仪上浓缩得到净化液。分别取150μl的CDs@MIPs特异性荧光颗粒分散液和150μl 10μg/L、80μg/L、180μg/L的净化液加入到96孔板中。用CDs@MIPs吸附30min后，酶标仪测定其荧光值，得到特异性荧光颗粒(CDs@MIPs)方法检出限，计算回收率，如表2所示。

表1PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片在黄瓜基质中的加标回收(μg/L)

本发明所述PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片在检测黄瓜基质中的菊酯类农药时，回收率范围在95.3％-113.3％之间，相对标准偏差小于7.16％，聚偏氟乙烯特异性荧光指示片(PVDF-CDs@MIPs)方法检出限为3.415μg/L。而现有CDs@MIPs特异性荧光颗粒液体检测方法，回收率范围在90.7％-118.2％之间，相对标准偏差小于9.27％，特异性荧光颗粒(CDs@MIPs)方法检出限为4.471μg/L。本发明所述PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片的相对标准偏差小于现有CDs@MIPs特异性荧光颗粒液体检测方法，精密度更高，这也是由于所述的特异性荧光指示片具备更稳定的荧光特性；PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片的净化作用和对待测物的反复富集作用，使得PVDF-CDs@MIPs特异性荧光指示片检测方法具备更低的检出限。

表2CDs@MIPs特异性荧光颗粒在黄瓜基质中的加标回收(μg/L)

实施例2

本实施例公开了吡咯素特异性荧光指示片的制备及在牛奶中吡咯素快速测定中的应用，所述吡咯素特异性荧光指示片的制备方法包括以下步骤：

(1)采用溶胶凝胶法制备吡咯素的硒化镉/硫化锌@分子印迹(CdSe/ZnS@MIPs)特异性荧光颗粒。

将7.2mL曲拉通分散在30mL环己烷中，强磁力搅拌20分钟；加入4mL CdSe/ZnSQDs、200μL四乙氧基硅烷和400μL氨水溶液(25wt％)。混合物搅拌2h后，加入7.6μL3-氨丙基三乙氧基硅烷0.02mo l/L的吡咯素溶液；避光搅拌聚合24h。聚合结束后，用丙酮破乳，然后10000r/min离心10min，除去上清液，重复上述操作三次；用甲醇：乙腈＝1:2(v/v)反复提取聚合物，直到目标分子完全洗脱下来；然后在40℃的真空炉中干燥12h，得到CdSe/ZnS@MIPs；相同条件下不加目标物分子制得CdSe/ZnS@NIPs。

(2)制备聚醚砜(PES)-硒化镉/硫化锌量子点@分子印迹(PES-CdSe/ZnS@MIPs)特异性荧光指示片：

将聚醚砜15％，致孔剂聚乙二醇2％，N,N-二甲基甲酰胺83％混合，50℃下磁力搅拌溶解，静置24h以除去气泡。先取2.5mL上述溶液，再取另取4mg CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，将二者充分混合。将该高分子聚合物作为制备特异性荧光指示片的溶液倒在洁净的玻璃板上，用150μm刮刀匀在玻璃板上迅速均匀刮完后，静置30s后将玻璃板浸入室温水固化浴中，获得PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片。利用荧光光谱仪测定其荧光强度，结果如图13所示。从图13可以看出，PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片在590nm发射波长下呈现出荧光良好峰形。

(3)性能

①扫描电镜

CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒的扫描电镜图如图14所示。

所述PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片表面和断面的扫描电镜图如图15(a)和15(b)所示。

②荧光稳定性

考察PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片、CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒乙腈分散液的荧光稳定性。荧光分光光度计测量荧光值，第一天的初始荧光值记为F0。避光保存，每隔5天记录一次，荧光强度值记录为F，观察F/F0的变化。PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片和CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒乙腈分散液的荧光变化F/F0随保存时间的曲线分别如图16和图17所示。

由图16可见，本发明所制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片荧光稳定性强，在放置了30天后，荧光值基本保持不变。

其他一般方法把特异性荧光颗粒分散在溶剂中进行检测，CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒的分散液30天后，颗粒荧光有明显下降，仅为初始值的56％。

③紫外稳定性

考察PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片、CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒乙腈分散液的紫外稳定性。荧光分光光度计每隔1h检测一次荧光，第0h测量荧光值，记为F0。分别将PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片、CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒乙腈分散液放置在紫外灯箱内照射，每隔1h记录一次荧光强度，记为F，观察F/F0的变化。PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片、CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒乙腈分散液紫外照射下的荧光变化随时间曲线分别如图18和图19所示。

由图18可见，本发明中的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片在紫外照射了6h后，荧光基本保持稳定，紫外稳定性好。图19显示，现有的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒在溶液形式下，紫外照射6h后，荧光有明显下降。

(4)标准曲线，线性更好：

所述PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片的标准曲线：取5mL牛奶，将聚醚砜-硒化镉/硫化锌量子点@分子印迹特异性荧光指示片(PES-CdSe/ZnS@MIPs)放置在自动循环推送设备上，调节过滤压力0.1MPa,流速2mL/min，过滤吸附70min后，得到空白基质液。取1mg/ml吡咯素标准溶液，用空白基质液进行稀释，分别配置浓度为0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、2mg/L、3mg/L5个浓度的吡咯素标准溶液。再分别将不同浓度的吡咯素标准溶液置于放置在新的聚醚砜特异性荧光指示片上，(PES-CdSe/ZnS@MIPs)自动循环推送循环吸附过滤，调节过滤压力0.1MPa,流速2mL/min，过滤吸附70min后，取出特异性荧光指示片，荧光仪测定特异性荧光指示片的荧光(激发波430nm，发射波590nm，狭缝2.5nm)，绘制以特异性荧光指示片荧光值F₀/F作y轴，不同浓度吡咯素作x轴的标准曲线。参见图20。由图20可见，随着吡咯素浓度的增加，指示片的荧光强度下降，所述PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片的标准曲线R²＝0.994,F0/F值在0.3-3mg/L范围内线性增加。

现有特异性荧光颗粒溶液检测方法的标准曲线：将合成的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒配置成1mg/ml的溶液，分别取150μl的特异性荧光颗粒分散液和150μl的PRL牛奶基质标液加入到96孔板中，平衡90分钟后，放入酶标仪进行检测。绘制以特异性荧光颗粒荧光值F0/F为y轴，不同浓度吡咯素作x轴的标准曲线，如图21所示。随着PRL浓度的增加，混合体系荧光强度下降，R²＝0.982,F0/F值在1-3mg/L范围内线性增加。

采用本发明方法所制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片的标准曲线线性(R²＝0.994)，优于现有的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒溶液检测方法的标准曲线线性(R²＝0.982)，这是由于现有的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒溶液检测形式，是将特异性荧光颗粒均匀分散在溶剂中，置于96孔板进行酶标仪检测。而CdSe/ZnS@MIPs的分散液在用酶标仪进行荧光读取时，颗粒需要先在孔板中震荡摇匀，立即上机检测，随着时间增长，特异性荧光颗粒将会在分散液中发生团聚和沉淀，荧光检测值也随之降低，并随着时间变化荧光值而产生较大的变动幅度。本发明将CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒加入到高分子聚合物中形成PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片，指示片具有更强荧光稳定性，使得PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片检测方法具备更优的线性。

(5)实际样品测定：

①无需前处理，更快更简便

现有的CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒液体形式在实际样品检测运用中，需要十分复杂的前处理过程，整个前处理耗时3天左右，操作步骤繁琐。首先取一定蛋白当量的样品，加入硼酸钠缓冲液调至0.2mol/L，混匀后加入硼氢化钠还原。样品在4℃下还原10h。得到的溶液加入60％的三氯乙酸使得三氯乙酸的最终浓度为20％，10000r/min离心10min以沉淀蛋白质，获得的蛋白用丙酮洗涤2次，沉淀后的蛋白加入1mL 6mol/L的HCl在110下水解24h，然后氮气吹干，过C18固相萃取柱除杂，洗脱液吹干后用2mL的超纯水复溶，过0.45复溶的水系膜，净化液再进行荧光吸附90min后，达到吸附平衡，进行荧光测定。

本发明方法所制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片检测方法，由于指示片中过滤层的存在，具备净化作用，使得该方法在实际样品检测运用中，无需繁琐的前处理净化步骤，而且能在更短的时间里实现对目标物的吸附。直接将待测食品基质，如牛奶等吸取30ml通过恒流泵进行反复吸附。吸附时间从90min缩短到70min即可实现指示片的完全猝灭，大大缩短了检测步骤和时间。PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片和CdSe/ZnS@MIPs颗粒的吸附平衡变化曲线分别如图22和图23所示。

②方法更精准，检出限更低.

本发明方法所制备的PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片检测方法：牛奶用PES-CdSe/ZnS@MIPs指示片过滤70min后，分别加入0.5mg/L、1.5mg/L、2.5mg/L三种不同浓度的吡咯素标准溶液。用PES-CdSe/ZnS@MIPs过滤70min后，取出PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片，荧光光谱仪测定特异性荧光指示片的荧光，得到PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片方法检出限，计算回收率，如表3所示。

表3PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片检测方法的牛奶加标回收(mg/L)

现有CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒液体检测方法：分别配制1mg/L、1.5mg/L、2.5mg/L的牛奶基质标准溶液，加入硼酸钠缓冲液调至0.2mol/L，混匀后加入硼氢化钠还原。样品在4℃下还原10h。得到的溶液加入60％的三氯乙酸使得三氯乙酸的最终浓度为20％，10000r/min离心10min以沉淀蛋白质，获得的蛋白用丙酮洗涤2次，沉淀后的蛋白加入1mL 6mol/L的HCl在110下水解24h，然后氮气吹干，过C18固相萃取柱除杂，洗脱液吹干后用2mL的超纯水复溶，过0.45复溶的水系膜，净化液用CdSe/ZnSMIPs吸附90min后，测定其荧光值，得到CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒方法检出限，计算回收率，如表4所示。

表4CdSe/ZnS@MIPs颗粒液体检测方法的牛奶加标回收(mg/L)

本发明所述PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片在检测牛奶基质中的吡咯素时，回收率范围在93.44％-112.74％之间，相对标准偏差小于4.71％，PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片方法检出限为0.21mg/L。而CdSe/ZnS@MIPs颗粒液体检测方法的回收率范围在88.14％-124.07％之间，相对标准偏差小于7.91％,CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒方法检出限0.447mg/L。本发明所述PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片的相对标准偏差小于现有CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光颗粒液体检测方法，精密度更高，这也是由于PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片具备更稳定的荧光性能；PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片的净化作用和对待测物的反复富集作用，使得PES-CdSe/ZnS@MIPs特异性荧光指示片检测方法具备更低的检出限。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种特异性荧光指示片，其特征是，其采用相转化法制备，以无纺布、玻璃纤维、涤纶、氯纶、锦纶、或多孔尼龙作为支撑层，将指示片制备溶液在所述支撑层上刮制得到具有表面功能层和过滤层的荧光指示片；所述指示片制备溶液是高分子溶液和特异性荧光颗粒的混合溶液；所述高分子溶液由致孔剂和高分子基材溶解在溶剂中所得；所述表面功能层由所述特异性荧光颗粒和高分子基材制备构成，所述过滤层主要由高分子基材构成。

2.根据权利要求1所述的特异性荧光指示片，其特征是，所述特异性荧光颗粒荧光材料@分子印迹颗粒，或磁性荧光材料@分子印迹颗粒；优选地，所述荧光材料为硒化镉/硫化锌、碲化镉、硫化镉、硒化镉、硫化铅、碳点、石墨烯量子点。

3.根据权利要求1所述的特异性荧光指示片，其特征是，所述特异性荧光颗粒由以下方法制备得到：1)环己烷作为溶剂、曲拉通作为表面活性剂，搅拌获得微乳化体系；2)将荧光材料@分子印迹颗粒、硅酸四乙酯作为交联剂和氨水混合进行硅烷化反应；3)加入待检测物或其类似物的模板分子、功能单体聚合获得聚合物；4)用洗脱液洗脱模板分子后获得特异性荧光颗粒；或

所述特异性荧光颗粒由以下方法制备得到：将待检测物或其结构类似物的模板分子、功能单体、以及致孔剂、碳点CDs溶液聚合；加入交联剂和引发剂，封口聚合，离心除去上清液，除去未反应的试剂，洗脱模板分子，即得；所述功能单体能与交联剂聚合获得聚合物。

4.根据权利要求3所述的特异性荧光指示片，其特征是，所述功能单体是3-氨丙基三乙氧基硅烷、丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯吡啶、席夫碱、硼酸酯；和/或特异性荧光颗粒中的所述致孔剂是乙腈。

5.根据权利要求1所述的特异性荧光指示片，其特征是，所述特异性荧光指示片用于检测的对象是亲水性，所述高分子材料基材为亲水性材质，优选为聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚砜、聚氯乙烯；

所述特异性荧光指示片用于检测的对象是疏水性，所述高分子材料基材为疏水性材质，优选为聚四氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯。

6.根据权利要求1所述的特异性荧光指示片，其特征是，所述致孔剂为聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇；和/或所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

7.根据权利要求1所述的特异性荧光指示片，其特征是，所述致孔剂在高分子溶液中的质量百分比浓度为1％-5％，优选为1％-3％。

8.根据权利要求1所述的特异性荧光指示片，其特征是，所述高分子基材在高分子溶液中的质量百分比浓度为3％-30％，优选为5％-20％，更优选为5％-15％；和/或

在所述混合液中，所述特异性荧光颗粒与溶剂的用量比为0.1-50mg：1ml，优选为1-10mg：1ml；和/或

所述特异性荧光颗粒与高分子溶液的用量比为0.1-50mg:1，优选为0.5-5mg:1ml。

9.一种权利要求1-8任一项所述的特异性荧光指示片的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

制备得到所述特异性荧光颗粒；

制备所述高分子溶液；

将所述特异性荧光颗粒溶于溶剂，得到特异性荧光颗粒溶液；

将特异性荧光颗粒溶液与高分子溶液的混合均匀，在玻璃板或支撑层上刮刀刮片，纯净水浴相转化，获得所述特异性荧光指示片。

10.权利要求1-8任一项所述特异性荧光指示片在农产品有害物质检测中的应用，优选地，所述有害物质为农药、三聚氰胺、瘦肉精、吡咯素。

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