CN111505143A - 一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，包括如下步骤：S1、制备百菌清分子印迹聚合物；S2、将所述百菌清分子印迹聚合物与硅藻土混合装柱制得百菌清分子印迹固相萃取柱；S3、将制得的百菌清分子印迹固相萃取柱用于待测样品处理，得洗脱液；S4、对步骤S3处理所得洗脱液，用色谱法检测洗脱液中的百菌清及其氧化还原产物含量。本发明利用百菌清为模板分子制备百菌清分子印迹聚合物，并将聚合物装填于固相萃取柱中制成萃取柱，对蔬菜与水体样品中的百菌清及其降解产物进行富集，净化，结合色谱法检测，确立一种高效、简单的方法；本发明特异性更高、灵敏度更好、检测速度更快。

Description

一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法
技术领域
本发明涉及分子印迹聚合物制备领域，尤其涉及一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法。
背景技术
百菌清(chlorothalonil)化学名称为四氯间苯二腈，是一种非内吸性、广谱、高效的保护性杀菌剂，对多种作物的真菌病害具有防治作用。其杀菌机理是与真菌细胞中的磷酸甘油醛脱氢酶发生作用，结合脱氢酶体中含有半胱氨酸的蛋白质，使脱氢酶丧失活性，破坏真菌细胞的新陈代谢，从而导致真菌的死亡。
百菌清从生产开始，至今在世界农业生产中的使用已经超过50年，由于广泛和长期使用，在农作物和自然生态环境中都检测到百菌清的残留，同时百菌清在自然界中存在氧化降解与还原降解，其母体和降解产物对环境和食品安全均具有潜在威胁。百菌清对人和哺乳动物低毒，会引起皮肤炎症、眼睛不适和胃肠刺激等症状，对鱼、贝类等水生生物高毒，美国国家环境保护总署已经将其列为可能使人类致癌的物质之一。我国2012年修订的《生活饮用水卫生标准》首次将百菌清列入了监测范围。目前，关于农作物和自然生态环境中百菌清的检测方法有很多，但普遍存在以下缺陷：特异性较低、灵敏度差、检测时间长。
分子印迹技术(Molecular Imprinting Techniqe，MIT)是近年来出现的制备具有识别功能的聚合物材料的新技术，可获得在空间结构和结合位点上与某一分子完全匹配的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)。分子印迹识别的高选择性来源于印迹聚合物基体中大量在大小、形状及功能基等方面与目标分子相匹配的结合位点。
据此，目前急需设计出一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，并将其应用到农作物与自然生态环境中百菌清的检测中来，以提高检测的特异性、增加检测的灵敏度、缩短检测的时间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，可以快速检测待测物中的百菌清及其氧化还原产物，可提高检测的特异性、增加检测的灵敏度、缩短检测的时间。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特点在于，包括以下步骤：
S1、制备百菌清分子印迹聚合物；
S2、将所述百菌清分子印迹聚合物与硅藻土混合装柱制得百菌清分子印迹固相萃取柱；
S3、将制得的百菌清分子印迹固相萃取柱用于待测样品处理，得洗脱液；
S4、对步骤S3处理所得洗脱液，用色谱法检测洗脱液中的百菌清及其氧化还原产物含量。
进一步，所述S3具体步骤如下：
S31、获得待测样品提取液；
S32、活化百菌清分子印迹固相萃取柱；
S33、将待测提取液过柱上样；
S34、对分子印迹固相萃取柱淋洗除杂，然后丙酮洗脱；得洗脱液。
进一步，所述百菌清及其氧化还原产物包括4-羟基百菌清、5-氯1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈、2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈。
进一步，所述百菌清分子印迹聚合物制备方法如下：
以母体百菌清为模板分子，以乙腈为致孔剂，以丙烯酰胺为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，以偶氮二异丁腈分别为引发剂，并按照如下方法制备：
(1)称取百菌清，并溶解于乙腈中，然后加入丙烯酰胺，于室温下超声振荡30min，使百菌清与丙烯酰胺完全结合；接着，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯以及偶氮二异丁腈，继续超声振荡15min，使其充分混合均匀；充氮气排氧后密封，于60℃水浴锅中加热16h，得到白色固体聚合物；
(2)将步骤(1)得到的白色固体聚合物进行粉碎研磨，并过200目筛；
(3)用有机溶剂索氏提取以洗脱聚合物中的百菌清，接着再用超纯水洗脱至中性，最后将产物放于60℃烘箱中干燥24h，即得目标所需的以百菌清为虚拟模板的百菌清分子印迹聚合物MIPs。
进一步，所述步骤(1)中，百菌清：丙烯酰胺：乙二醇二甲基丙烯酸酯：偶氮二异丁腈的摩尔比为1：7：40：0.6。
进一步，所述步骤(3)中，用有机溶剂索氏提取以洗脱聚合物中的百菌清过程中，洗脱时间为30h。
进一步，所述百菌清分子印迹固相萃取柱中，硅藻土：百菌清分子印迹聚合物的质量比为1：1-1：2。
进一步，所述待测样品包括水体、蔬菜、水果、粮食。
进一步，当所述待测物为蔬菜、水果或粮食时，还包括待测液的制备，具体是将待测样品匀浆处理，然后加入0.5％HCl乙腈溶液提取，接着旋涡振荡2min，超声波提取30min，10000r/min离心10min，取上清液；用氮吹仪吹干(或旋转蒸发至干)，再用有机溶剂溶解，纯水稀释得待测溶液。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明针对百菌清有机氯农药残留引发的食品安全问题，着眼于蔬菜与水体环境中的百菌清及其降解产物残留的快速分析检测；本发明利用百菌清为模板分子制备百菌清分子印迹聚合物MIPs，并将聚合物粉末装填于固相萃取柱中制备成百菌清分子印迹固相萃取柱CHT MISPE，对蔬菜与水体样品中的百菌清及其降解产物进行富集，净化，结合色谱仪器进行检测，确立一种高效，简单的方法；相对传统方法，本发明的特异性更高、灵敏度更好、检测速度更快等优点。
附图说明
图1是实施例1中白色固体聚合物的形态图；
图2是实施例1中百菌清分子印迹聚合物MIPs的形态图；
图3是实施例1中不同功能单体类型对Q值的影响结果图；
图4是实施例1中功能单体与模板分子在不同摩尔比下的混合液紫外吸收图；
图5是实施例1中模板分子与引发剂的不同摩尔比对MIPs吸附量Q值的影响结果图；
图6是实施例1中不同洗脱时间对MIPs吸光度值的影响结果图；
图7是实施例1中不同吸附溶剂类型对MIPs吸附量Q值的影响结果图(图中，a.10％乙腈-水；b.30％乙腈-水；c.50％乙腈-水；d.70％乙腈-水；e.乙腈)；
图8是实施例1中不同温度对吸附量Q值的影响结果图；
图9是实施例2中MIPs和NIPs的扫描电镜图(图中，a为MIPs形貌特征，b为NIPs形貌特征)；
图10是实施例2中不同吸附时间下MIPs对底物的吸附量曲线图；
图11是实施例2中MIPs和NIPs对不同底物分子的吸附等温线；
图12是实施例2中CHT MIPs对7种底物的吸附率表示图(图中，a.百菌清；b.5-氯-1，3-间苯二腈；c.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；d.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；e.4-羟基百菌清；f.联苯；g.葡萄糖)；
图13是实施例3中分子印迹固相萃取柱的洗脱曲线图；
图14是实施例4中5种物质的紫外全扫图(图中，a.5-氯1，3-间苯二腈；b.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；c.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；d.百菌清；e.4-羟基百菌清)；
图15是实施例4中236nm下5种标准品的高效液相色谱图(图中，a.4-羟基百菌；b.5-氯1，3-间苯二腈；c.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；d.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；e.百菌清)；
图16是实施例4中220nm下5种标准品的高效液相色谱图(图中，a.4-羟基百菌；b.5-氯1，3-间苯二腈；c.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；d.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；e.百菌清)；
图17是实施例5中不同提取剂类型对小白菜中的百菌清及其降解产物提取效率的影响图(图中，a.0.5％HCl，80％甲醇水溶液；b.0.5％HCl，100％甲醇溶液；c.0.5％HCl乙腈溶液)；
图18是实施例5中小白菜空白样品色谱图；
图19是实施例5中小白菜加标样品色谱图(图中，a.4-羟基百菌；b.5-氯1，3-间苯二腈；c.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；d.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；e.百菌清)；
图20是实施例5中紫松实际样品色谱图；
图21是实施例5中五月慢实际样品色谱图；
图22是实施例5中紫松实际样品GC-MS色谱图(图中，a.样品MRM图；b.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈保留位置；c.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈对应的离子对图；d.百菌清离子对图)；
图23是实施例7中水溶液中百菌清光解色谱图；
图24是实施例7中水溶液光解加入花青素时百菌清及其氧化还原产物色谱图；
图25是实施例7中水溶液光解加入原花青素时百菌清及其氧化还原产物色谱图；
图26是实施例7中30％乙腈水溶液色谱图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的百菌清分子印迹聚合物是以百菌清(CHT)为模板分子，以乙腈为致孔剂，以丙烯酰胺(AM)为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，以偶氮二异丁腈(AIBN)分别为引发剂，并按照如下方法制备：
(1)精确称取0.133g(摩尔质量为0.5mmol)的百菌清(CHT)于螺口试管中，并溶解于致孔剂乙腈中，然后加入功能单体丙烯酰胺(AM)，于室温下超声振荡30min，使模板分子百菌清(CHT)与功能单体丙烯酰胺(AM)完全结合；接着，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)以及引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，继续超声振荡15min，使其充分混合均匀；充氮气排氧后密封，于60℃水浴锅中加热16h，得到白色固体聚合物(如图1所示)；
(2)将步骤(1)得到的白色固体聚合物进行粉碎研磨，并过200目筛；
(3)用有机溶剂索氏提取以洗脱聚合物中的百菌清，接着再用超纯水洗脱至中性，最后将产物放于60℃烘箱中干燥24h，即得目标所需的以百菌清为虚拟模板的百菌清分子印迹聚合物MIPs(如图2所示)。
其中，具体是通过研究溶剂、功能单体类型，模板分子与功能单体、交联剂、引发剂的摩尔比，洗脱时间对MIPs结合能力Q值(单位质量MIPs吸附模板分子的量)的影响，来确定相应分子印迹聚合物(MIPs)的最佳制备条件。
Q＝(C0-C)V/M
Q—聚合物吸附平衡时的吸附量(μmol/g)；
C0—分析物的初始浓度(mg/L)；
C—平衡时上清液中的分析物浓度(mg/L)；
V—吸附溶液的体积(mL)；
M—加入分子印迹聚合物的质量(g)。
空白印迹聚合物(NIPs)的制备除不加模板分子百菌清(CHT)外，其余步骤与MIPs的制备方法一致。
研究过程及结果如下：
1、致孔剂(溶剂)的选择
以丙酮、甲醇、正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙腈六种有机试剂分别作为溶剂，考察不同溶剂对CHT的溶解性，并比较易溶的几种溶剂对合成聚合物吸附量Q值的影响。结果表明CHT在丙酮、乙腈中易溶，在正己烷中微溶，在石油醚，甲醇，二氯甲烷中不溶。对于可溶的3种有机溶剂，比较其合成的MIPs的吸附容量Q的大小，结果如表1。其中，当溶剂为乙腈时，结合量Q值最大，为32.1μmol/g；其次为丙酮和正己烷，Q值分别为26.3μmol/g和19.5μmol/g。因此本发明选择乙腈作为制备百菌清分子印迹聚合物的致孔剂。
表1不同致孔剂(溶剂)对Q值的影响
溶剂(致孔剂) 丙酮 乙腈 正己烷
吸附量Q(μmol/g) 26.3 32.1 19.5
2、功能单体的选择
模板分子用量一定，功能单体分别使用甲基丙烯酸(MAA)、2-乙烯基吡啶(2-VP)以及丙烯酰胺(AM)，以合成的MIPs吸附容量Q(μmol/g)值为指标选择最佳的功能单体，结果如图3所示。通过图3能够得出采用AM作为功能单体时，Q值最大，因此用丙烯酰胺(AM)作为功能单体。
3、模板分子与功能单体配比的选择
精确称取0.133g(摩尔质量为0.5mmol)百菌清(CHT)粉末，模板分子用量一定，改变功能单体丙烯酰胺(AM)的用量，考察百菌清：丙烯酰胺的摩尔比为1:3、1:5、1:7、1:9、1:11条件下，在233nm下利用紫外分光光度计检测，根据吸光度值的变化，观察模板分子与功能单体的作用情况，选择最佳模板分子与功能单体的摩尔比例，结果如图4所示。由紫外分光光度计吸光度值的变化可知，当功能单体不断增多时，吸光度值越来越小，表明模板分子与功能单体两者发生发应，即百菌清与丙烯酰胺反应形成复合物。当模板分子与功能单体的摩尔比为1:7时，吸光度值不再发生明显变化，即百菌清与丙烯酰胺已经结合完全，之后再加入功能单体，模板分子的含量不再产生较大变化。所以选择模板分子CHT与AM的摩尔比为1:7时最佳。
4、模板分子与交联剂配比的选择
使模板分子百菌清与交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)的摩尔比为1:20、1:30、1:40、1:50，研究不同摩尔比制备的聚合物其吸附性能的差异，结果如表2所示。
表2模板分子与交联剂的不同摩尔比对MIPs吸附量的影响
n(模板分子)：n(交联剂) 1:20 1:30 1:40 1:50
聚合物形态 未充分聚合 质软 硬度适中 刚硬(有龟裂)
结合量Q(μmol/g) 18.6 27.2 35.0 21.9
添加交联剂使得聚合物具有一定的刚性，由表2可知，随着交联剂的增多，聚合物的硬度逐渐变高，结合量也随之增大；当模板分子与交联剂的摩尔比为1:40时，聚合物的吸附量达到最大值，为35.0μmol/g，且硬度适中，研磨过筛方便；当交联剂继续增多时，聚合物的表面出现龟裂，硬度较大，研磨困难，且聚合物吸附量减小；所以确定CHT与EDMA的最佳摩尔比为1:40。
5、模板分子与引发剂配比的选择
对比研究模板分子与引发剂的摩尔比分别为1:0.1、1:0.3、1:0.6、1:0.9、1:1.2时反应合成的MIPs对百菌清吸附量Q值大小的影响，结果见图5。由图5可知，当模板分子与引发剂摩尔比在1:0.1～1:0.6时，随着引发剂的增多，MIPs对模板分子百菌清的吸附量逐渐变大，当模板分子与引发剂的摩尔比为1:0.6时MIPs对CHT的吸附量Q值达到最大值43μmol/g，当引发剂继续增多时，MIPs对CHT的吸附量Q值开始变小。所以模板分子百菌清与引发剂的最佳摩尔比为1:0.6。
6、洗脱时间的确定
使用丙酮作为洗脱剂，洗脱时间分别为6h、12h、18h、24h、30h、36h，在233nm下用紫外分光光度计分别检测提取器中的上清液，观察不同时间段的吸光度值变化，结果如图6。从该图可以看出，当洗脱时间大于30h时，提取器中的上清液吸光度值不再发生明显变化，表明提取器中的模板分子已经被完全洗脱下来。
7、吸附溶剂的选择
精确称取MIPs 10.0mg每份，分别称取15份MIPs分别加入到相同规格5.0mL试管中，分别加入10％乙腈-水、30％乙腈-水、50％乙腈-水、70％乙腈-水、乙腈溶液稀释至80mg/L的百菌清标准溶液，每种吸附溶剂做3个平行试验。30℃恒温振荡器中振荡(250r/min)3h，后以10000r/min离心10min，取上清液稀释后，在最大吸收波长为233nm下，用紫外分光光度计测定其吸光度值，依据已绘制的标准曲线计算出相应的平均浓度。根据加入聚合物前后溶液浓度差，计算出MIPs与底物的结合量Q。对比Q值大小，决定最佳吸附溶剂类型，结果如图7所示(图中，a.10％乙腈-水；b.30％乙腈-水；c.50％乙腈-水；d.70％乙腈-水；e.乙腈)。由该图可知，选择30％乙腈-水溶液作为吸附溶剂时Q值最大，为44.5μmol/g。
8、吸附温度的影响
精确称取MIPs 10.0mg每份，分别称取15份MIPs加入到5.0mL离心管中，分别加入2.0mL浓度为80mg/L百菌清30％乙腈-水溶液，在温度分别为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃恒温振荡器中振荡(250r/min)3.0h。后分别取出以10000r/min离心10min，然后分别取上清液稀释后，在最大吸收波长为233nm下，使用紫外分光光度计分别测定其吸光度值，每个吸附温度设置3个平行试验。依据已绘制的标准曲线算出其相应的浓度，进而计算出MIPs与CHT的结合量Q值。根据百菌清(CHT)溶液浓度的变化，对比不同吸附温度对MIPs吸附量的影响，从而得出MIPs对百菌清吸附量Q随温度变化的趋势，确定最佳吸附温度，结果如图8所示。由该图可知，在温度为10℃-30℃时，随温度的不断上升，MIPs对CHT的吸附量渐渐变大，在30℃时，吸附量达到最大值51.8μmol/g；在30-50℃范围内，当温度继续升高时，MIPs对CHT的吸附量Q值开始下降。因此本论文的最佳吸附温度控制在30℃。
实施例2
本实施例的一种实施例1中百菌清分子印迹聚合物的评价。
1、扫描电镜分析
使用S-4800型扫描电子显微镜观察5万倍条件下CHT MIPs和NIPs的形貌特征，结果见图9(图中，a为MIPs形貌特征，b为NIPs形貌特征)。从该图可以看出，与MIPs相比，NIPs的表面相对平滑，孔径较小，约为40nm，分布相对均匀；MIPs表面粗糙，质地疏松，粒径较宽，约为160nm，并且散布大量空穴，所以具备较大的孔体积和比表面积，有利于底物与结合位点的接触，对百菌清及其降解产物有较高的吸附率。
2、吸附动力学试验
配制一系列浓度(0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、5mg/L)的百菌清标准溶液，并在最大波长233nm下测定其吸光度值。以百菌清标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制百菌清溶液的标准曲线。以相同方式绘制4-羟基百菌清、5-氯-1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈和2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈4种溶液的标准曲线，其最大吸收波长分别为243nm、212nm、218nm、225nm。
精确称取MIPs 10.0mg每份，称取24份聚合物粉末加入到5.0mL离心管中，分别加入2.0mL浓度为80mg/L百菌清30％乙腈-水溶液，在温度为30℃恒温振荡器中分别振荡(250r/min)0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h。接着依次取出以10000r/min离心10min，取上清液稀释后，利用紫外分光光度计分别测定其吸光度值，每个吸附时间设置3个平行试验。根据已绘制的标准曲线得出各自对应的浓度，计算出分子印迹聚合物与CHT的结合量Q值。根据百菌清溶液前后浓度变化，对比吸附时间对分子印迹聚合物吸附量的影响，从而得出MIPs对CHT吸附量Q随时间变化的趋势，确定最短的吸附平衡时间。
4-羟基百菌清、5-氯-1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈和2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈于不同作用时间下的吸附量Q的考察方法同上。分别计算MIPs对4-羟基百菌清、5-氯1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈和2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈的吸附量Q随时间变化的趋势，从而确定5种物质的最佳吸附平衡时间。
结果见图10，从图中可以得出，MIPs对百菌清(CHT)及其4种降解产物的吸附容量Q值随振荡时间的延长而快速增加，当振荡时间达到3h时，MIPs对百菌清及其4种降解产物的吸附量Q值达到最大值，随后振荡时间继续增多，MIPS对底物的吸附容量Q值不再产生显著变化。以MIPs对百菌清的吸附容量为例，振荡时间为0.5h～3.0h时，Q值由8.4μmol/g到53μmol/g，3.0h～4.0h时Q值一直处于53μmol/g，未发生明显变化。
MIPs对5种底物的吸附量Q值随振荡时间变化出现这样趋势的原因主要是前期MIPs的表面含有大量的空穴，底物分子立即与聚合物表面的结合位点发生相互作用，所以刚开始吸附速率很快；后期表面的吸附位点被占据，表面孔穴达到吸附饱和，底物分子开始向聚合物内部吸附位点结合，然而向深层空穴传质会有一定的位阻，致使吸附速率降低；当聚合物表面和内部吸附位点都被占据后，吸附量Q值不再发生变化，随即达到吸附平衡状态。
3、静态吸附平衡试验
精确称取分子印迹聚合物(MIPs)10.0mg每份，分别取MIPs和NIPs聚合物粉末各30份，分别加入到相同规格5.0mL离心管内，分别加入2.0mL浓度依次为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L百菌清30％乙腈-水溶液，在温度为30℃恒温振荡器中分别振荡(250r/min)3.0h。振荡结束后分别取出以10000r/min离心10min，然后分别取其上清液稀释后使用紫外分光光度计在最大波长233nm下分别测定其吸光度值，每个吸附浓度设置3个平行，求出平均值。依据已绘制出的标准曲线计算出其相应的CHT平衡浓度。根据吸附前后溶液浓度差值，计算MIPs、NIPs对CHT的吸附量Q，绘制出MIPs和NIPs对CHT的吸附等温线。
MIPs和NIPs对4-羟基百菌清、5-氯1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈和2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈的吸附等温线绘制方法同上所述。
结果见图11，由图11可以看出，随着浓度的逐渐变大，CHT MIPs和NIPs对底物的吸附量呈非线性增加，并且MIPs的吸附量总是大于NIPs的吸附量，说明在聚合过程中，模板分子在CHT MIPs中留下了许多印迹孔穴，这些空穴对模板分子具有记忆识别功能，可以对模板分子特异性吸附。随着底物分子浓度的增加，CHT MIPs对底物的吸附量也随之变大，当底物浓度达到80mg/L时基本达到最大结合量。当浓度继续变大时，吸附量Q值不再产生较大变化。
以MIPs、NIPs对百菌清的吸附量为例：当浓度为10mg/L～80mg/L时，MIPs对百菌清的吸附量Q值由6.93μmol/g增加到49.9μmol/g；当浓度为80mg/L～100mg/L时，MIPs对百菌清的吸附量Q值由49.9μmol/g增加到52μmol/g，相比较变化不明显。当浓度为10mg/L～100mg/L时，NIPs对百菌清的吸附量Q值由0.8μmol/g到2.3μmol/g，且吸附量Q值一直低于MIPs。
4、底物选择性试验
选用CHT、CHT-OH、5-氯-1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈、2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈、联苯、葡萄糖作为底物进行选择性吸附试验。CHT、CHT-OH、5-氯-1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈、2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈、联苯分别在最大吸收波长为233nm、243nm、212nm、218nm、225nm、242nm下使用紫外分光光度计分别测定其吸光度值，根据标准曲线计算出各个底物吸附过后的浓度；利用HPLC进行葡萄糖浓度的测定。根据吸附前后浓度差值，计算出CHT MIPs对7种底物的吸附率，对比CHT MIPs对7种不同底物的吸附率，结果如图12(图中，a.百菌清；b.5-氯-1，3-间苯二腈；c.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；d.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；e.4-羟基百菌清；f.联苯；g.葡萄糖)。由图可知，CHT MIPs对百菌清、5-氯-1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈、2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈、4-羟基百菌清、联苯、葡萄糖不同底物的吸附率分别为83.13％、77.1％、75.1％、76.83％、70.1％、27％、13％。由数据可知，聚合物对百菌清及其降解产物的吸附率比较高，对联苯和葡萄糖的吸附率偏低。说明以百菌清为模板分子合成的MIPs洗脱后所留下的空穴结构与百菌清相匹配，所以MIPs对CHT及其降解产物有较高的特异性吸附。由于联苯、葡萄糖与百菌清结构相差较大，与空穴中的识别位点不能发生作用，因此CHT MIPs对联苯和葡萄糖吸附率较小。该实验说明了CHT MIPs对CHT及其结构类似物具有特异性吸附功能。
实施例3
本实施例的一种百菌清分子印迹固相萃取柱(MISPE)的制备，将实施例1制得的百菌清分子印迹聚合物与硅藻土按1：1比例混合装柱，即得。其中，装柱过程中的各参数确定均通过研究获得，研究过程及结果如下：
1、硅藻土用量的确定
将3.0mL空的SPE柱作为发明固相萃取小柱，将聚乙烯筛板放入固相萃取柱的底部，称取5份60.0mg每份的百菌清MIPs，分别加入与CHT MIPs质量比为1:0、1:1、2:1、1:2、3:2的硅藻土，充分混合均匀后装入3.0mL空固相萃取(SPE)柱中，慢慢敲打以使其紧实，上层用筛板压紧。以样品溶液通过分子印迹固相萃取柱的速率和对目标分子的吸附值为指标，对比混合CHT MIPs与硅藻土的不同质量比对装填效果的影响，结果见表3。
表3MIPs与硅藻土的不同质量比对MISPE装填效果的影响
聚合物：硅藻土 1:0 1:2 1:1 2:1 3:2
流速(mL/min) 0 2.3 1.5 1 0.8
吸附量(μmol/g) 0 20.6 25.1 28.2 31.3
由上表可以看出：当百菌清MIPs与硅藻土比例为1:0时，样品无法通过；当比例为2：1、3：2时，MIPs对CHT的吸附效果比较好，但过样速度较慢；当百菌清MIPs与硅藻土的质量比为1：2时，尽管过样速度加快了，但吸附效果不佳。最后选择MIPs与硅藻土的质量比为1：1。
2、淋洗剂和洗脱剂的确定
称取60.0mg的CHT MIPs和硅藻土装柱，并用3.0mL甲醇和3.0mL水活化柱子，活化的目的主要是：第一为了浸润填充料、以便样品溶液能够流过固相萃取柱；第二是为了除去固相萃取柱上的干扰杂质以及溶剂残留。接着准确吸取1.0mL一定浓度的百菌清标准溶液过固相萃取柱，接着分别用5.0mL的乙腈、丙酮、50％甲醇-水、5％甲醇-水、二氯甲烷这5种溶剂淋洗，分别收集洗脱液，用氮吹仪吹干，用30％乙腈-水溶解定容到5.0mL，在最大吸收波长233nm下利用紫外分光光度计分别测定其吸光度值，计算得出洗脱液中百菌清(CHT)的含量，根据百菌清回收率确定MISPE所选用的淋洗剂和洗脱剂，结果见表4。
表4不同溶剂对目标分子回收率的影响
溶剂 乙腈 丙酮 50％甲醇-水 5％甲醇-水 二氯甲烷
回收率％ 80.3 86.9 47.9 2.6 72.2
由表可知：这五种溶剂对目标分子的洗脱能力大小依次为：丙酮＞乙腈＞二氯甲烷＞50％甲醇-水＞5％甲醇-水。当洗脱剂为丙酮时，百菌清的回收率为86.9％，洗脱效果达到固相萃取的要求；5％甲醇-水对目标分子的洗脱率很低，洗脱效果不理想，可以用作淋洗剂除去样品中的杂质。最后，选择5％甲醇-水为淋洗剂，丙酮为洗脱剂。
3、洗脱剂用量的确定
柱子经3.0mL甲醇和3.0mL水活化，上样，5％甲醇-水淋洗除杂后，然后用丙酮洗脱，洗脱剂每次用量为1.0ml，分次收集洗出液，氮吹仪吹干，接着用30％乙腈-水溶解定容到5.0mL，然后在最大吸收波长233nm下利用紫外分光光度计分别测定其吸光度值，计算得出洗脱液丙酮中百菌清的含量，最后得出每次收集液中百菌清的回收率并累积计算总回收率，以此确定洗脱剂丙酮的用量，结果见图13。由图能够得出，当洗脱次数不断增多时，单次收集液中百菌清的回收率渐渐降低；当洗脱次数为7时，百菌清已被完全洗脱下来，继续洗脱时，不再有百菌清被洗脱下来。当第6次洗脱时，洗脱剂对目标底物的总洗脱率达到最大值89.1％，所以最佳洗脱剂用量为6.0mL。
4、使用次数对分子印迹固相萃取柱吸附性能的影响
以洗脱剂用量为6.0mL研究MISPE柱洗脱后可重复利用性，随着使用次数的增加，吸附能力也会变差。因此，对本发明中分子印迹固相萃取柱进行6次重复性实验，研究分子印迹固相萃取柱的使用次数对模板分子回收率的影响，结果见表5。
表5使用次数对回收率的影响
使用次数 1 2 3 4 5 6
平均回收率(％) 89.1 87.8 85.6 82 76 63.4
由上表可以看出：前5次的使用回收率下降变化不大，当使用到第6次时，回收率降低速率明显变大，由刚开始的回收率89.1％到第六次的63.4％，为了确保实验的准确性，本发明制备的CHT MISPE柱的使用次数不超过3次。
实施例4
本实施例用以说明高效液相色谱同时分离检测百菌清及其降解产物的方法建立。
1、检测波长的选择
对百菌清及其4种降解产物(4-羟基百菌清、5-氯1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈和2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈)在190～400nm波长范围内进行紫外全波长扫描，结果见图14(图中，a.5-氯1，3-间苯二腈；b.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；c.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；d.百菌清；e.4-羟基百菌清)。由图可知：百菌清、4-羟基百菌清、5-氯1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈和2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈的最大吸收波长分为233nm、243nm、212nm、218nm、225nm。其中，2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈、百菌清、4-羟基百菌清在236nm处均有较大吸收；5-氯1，3-间苯二腈和2，5-二氯-1，3-间苯二腈在220nm均有较大吸收。因此，这5种物质选择236nm，220nm为最佳检测波长。
2、HPLC色谱条件的选择
本发明采用乙腈-水为流动相，通过变动乙腈与水的比例来改变流动相的极性，使百菌清及其降解产物的色谱峰能达到良好的分离度。最佳色谱条件为色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；可变波长紫外检测器，检测波长为220nm、236nm；流动相B是乙腈，流动相C是水，进样量:20μL；柱温：25℃；流速：1mL/min；流动相梯度洗脱程序见表6，色谱图见图15-16(图15、16中，a.4-羟基百菌；b.5-氯1，3-间苯二腈；c.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；d.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；e.百菌清)。图15具体为236nm下5种标准品的高效液相色谱图，图16为220nm下5种标准品的高效液相色谱图。
表6百菌清及其降解产物分离梯度洗脱程序
Figure BDA0002468503780000121
Figure BDA0002468503780000131
由上图可见：百菌清、2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈、5-氯1，3-间苯二腈、4-羟基百菌清的保留时间分别约为29.6、25.9、22.9、19.5、9.4min。
实施例5
本实施例的一种分子印迹固相萃取技术联用高效液相色谱在小白菜检测中的应用，将实施例3制得的百菌清分子印迹固相萃取柱(CHT MISPE)用于小白菜样品前处理，最后联用实施例4的高效液相色谱进行小白菜样品中百菌清及其四种代谢产物的检测分析。其中，小白菜样品前处理的具体方法为：(1)采用HCl乙腈溶液作为提取剂提取目标小白菜的百菌清及其降解产物作为待测样品提取液；(2)利用甲醇溶液与水溶液活化百菌清分子印迹固相萃取柱；(3)将待测样品提取液，氮气吹干，有机溶剂复溶后用纯水稀释并以1mL/min的流速过柱上样；(4)5％甲醇-水淋洗除杂，然后用6.0mL丙酮洗脱，氮吹仪吹干，接着用30％乙腈-水溶解定容到1mL，HPLC测定。
其中，具体是通过研究小白菜样品的粗提方法、小白菜中百菌清及其降解产物的提取和净化过程以及实际样品的获取来确定相应参数，研究过程及结果如下：
1、小白菜样品的粗提方法优化
准确称取1.000g匀浆过后的小白菜样品，加入离心管中，分别加入3种不同提取剂(0.5％HCl，80％甲醇水溶液、0.5％HCl，100％甲醇溶液、0.5％HCl乙腈溶液)旋涡振荡2min，超声提取30min，10000r/min离心10min，取上清液，用氮吹仪吹干，并用乙腈溶解，纯水稀释，MISPE净化富集，待HPLC检测。通过研究不同提取剂对百菌清及其降解产物的回收率，确定小白菜样品的最佳提取剂。结果如下图17(图中，a.0.5％HCl，80％甲醇水溶液；b.0.5％HCl，100％甲醇溶液；c.0.5％HCl乙腈溶液)，由图可知：提取液c即0.5％HCl乙腈溶液对小白菜中的百菌清及其降解产物的提取效率明显高于提取液a(0.5％HCl，80％甲醇水溶液)和提取液b(0.5％HCl，100％甲醇溶液)。因此，本发明采用0.5％HCl乙腈溶液作为提取小白菜中的百菌清及其降解产物的提取剂。
2、小白菜中百菌清及其降解产物的提取和净化
准确称取1.000g(精确到0.001g)匀浆过后的小白菜样品，放入50.0mL离心管中，加入2.0mL 0.5％HCl乙腈溶液提取，接着旋涡振荡2min，超声波提取30min，10000r/min离心10min，取上清液；根据上述步骤将下层残渣再重复提取两次，合并3次上清液。用氮吹仪吹干，用有机试剂充分溶解再加入纯水稀释，过已活化的CHT MISPE小柱，先用5％甲醇-水淋洗除杂，然后再用丙酮洗脱吸附在固相萃取柱填料上的目标产物，收集洗脱液于氮吹仪吹干。最后用1.0mL 30％乙腈-水溶液使之充分溶解，过0.22μm有机相滤膜，收集滤液供HPLC检测(参照实施例4的色谱条件)。每个处理设置3个平行试验，同时设置空白对照组。
即，准确称取9等份空白小白菜匀浆样品，每份1.000g，分别添加1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg3个不同浓度的5种混合标准溶液，每个浓度做3个平行。按照上述步骤进行样品的前处理，在实施例4色谱条件下进行检测，每个样品重复测定3次，空白样品色谱图和加标样品色谱图结果如图18-19，加标回收率及精密度见表7。其中，图18具体为小白菜空白样品色谱图，图19为小白菜加标样品色谱图(图中，a.4-羟基百菌；b.5-氯1，3-间苯二腈；c.2，5-二氯-1，3-间苯二腈；d.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈；e.百菌清)。
表7 5种物质的加标回收率与相对标准偏差
Figure BDA0002468503780000141
Figure BDA0002468503780000151
3、实际样品的获取与测定
阳光房种植绿色小白菜和紫色小白菜，分别为五月慢和紫菘。根据农药用量常用推荐用量，75％百菌清可湿性粉剂推荐使用剂量1.65g/L施药，避光7d后，(75％百菌清可湿性粉剂的采收安全间隔期为7d)，按照上述前处理步骤处理这两种小白菜样品，在实施例4的HPLC方法下进行样品检测，每个样品做3个平行。两种小青菜中均检测到CHT，在紫色小白菜样品液相色谱图26min处存在一个很小的色谱峰，疑似为2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈，后经GC-MS的MRM模式测定为2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈，其他3种降解产物均未检测到。色谱图见图20-22，检测结果见表8。其中，图20具体为紫松实际样品液相色谱图，图21为五月慢实际样品液相色谱图，图22为紫松实际样品气质MRM图(图中，a.样品MRM图；b.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈保留位置；c.2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈对应的离子对图；d.百菌清离子对图)。
表8小白菜实际样品的测定
Figure BDA0002468503780000152
此外，还需说明的是，本实施例方法同样适用于GC进行蔬菜样品中百菌清及其还原残留物的检测分析。
实施例6
CHT及其氧化还原产物标准曲线的回归方程及相关系数(R2)见表9。由表可以看出，五种药物的峰面积(Y)与质量浓度(X)呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.9961～1.0000，计算可得峰面积的RSD(n＝6)小于5％；迁移时间的RSD(n＝6)小于0.65％，可以看出该方法具有良好的精密度。以3倍信噪比(S/N)计算方法检测限，HPLC检测中5种药物的LOD值均小于0.016mg/L。
表9 5种物质的标准曲线、精密度及检出限
Figure BDA0002468503780000161
用5种混标溶液配置浓度为10μg/L的水溶液100mL，经本发明CHT MISPE进行快速富集，百菌清及其氧化还原产物5-氯1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈、2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈和4-羟基百菌清的方法的检出限分别为0.15μg/L、0.14μg/L、0.13μg/L、0.17μg/L和0.06μg/L。
实施例7
利用太阳光对浓度为0.2mg/L百菌清溶液(以乙腈的5mg/L百菌清母液配置)进行光解，分成3组，每组50mL，设置平行样，置于石英管中进行光解5h。第一组百菌清直接进行光解，第二组加入0.2μmol花青素，第三组加入0.2μmol原花青素。百菌清水溶液光解后，经CHL-MIPs快速富集，丙酮洗脱，氮吹吹干，30％乙腈水溶液定容至1mL，HPLC检测。结果表明：第一组百菌清浓度为0.118mg/L，降解率达40.8％，4-羟基百菌清未检出，17.3min有未知峰出现，见图23。第二组百菌清浓度为0.074mg/L，降解率为62.83％，4-羟基百菌清浓度为6.83μg/L，2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈浓度为4.72μg/L，2，5-二氯-1，3-间苯二腈浓度为5.38μg/L，5-氯1，3-间苯二腈浓度为5.76μg/L，色谱图中16.78min有未知产物峰出现，如图24所示。第三组百菌清及其目标氧化还原产物均未检出，百菌清降解率为100％，色谱图中16.78min有未知产物峰出现，如图25所示，空白溶剂30％乙腈水溶液检测色谱图，如图26所示。
实施例8
本实施例的一种分子印迹固相萃取技术联用高效液相色谱在水体环境/蔬菜中百菌清及其残留物检测中的应用，其中，样品前处理的具体方法为：(1)获取水体环境中的水样，去除漂浮物质后，取100mL作为待测样品或小白菜0.5％HCl乙腈提取液20mL加纯水40mL稀至乙腈含量为30％；(2)向(1)中样品溶液中加入新制备的百菌清分子印迹聚合物0.1g，振荡吸附；(3)3000转/min离心后弃去上清液，收集分子印迹聚合物，加入5mL5％甲醇-水涡旋振荡10s，3000转/min再次离心弃去上清液；(4)然后用6mL丙酮洗脱，氮吹仪吹干，接着用30％乙腈-水溶解定容到1.0mL，HPLC待测。
此外，还需说明的是，本实施例方法同样适用于联用GC-MS进行水体样品中残留物的检测分析，需将步骤(4)改为5％甲醇-水淋洗除杂，然后用6mL丙酮洗脱，氮吹仪吹干，正己烷溶解，GC-MS测定百菌清及其还原产物。
本发明针对百菌清有机氯农药残留引发的食品安全问题，着眼于蔬菜与水体环境中的百菌清及其降解产物残留的分析检测。本发明上述实施例利用百菌清为模板分子制备百菌清分子印迹聚合物MIPs，并将聚合物粉末装填于固相萃取柱中制备成百菌清分子印迹固相萃取柱CHT MISPE，对蔬菜与水体样品中的百菌清及其降解产物进行富集，净化，结合色谱仪器进行检测，确立一种高效，简单的方法；相对传统方法，本发明的特异性更高、灵敏度更好、检测速度更快。具体研究结果总结如下：
1.利用本体聚合法确定制备百菌清分子印迹聚合物的最优条件：百菌清为模板分子，最佳溶剂为乙腈，功能单体为丙烯酰胺(AM)，对洗脱时间、吸附溶剂、吸附温度的选择，最终确定百菌清分子印迹聚合物的最佳制备条件：百菌清(CHT)：丙烯酰胺(AM)：乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)：偶氮二异丁腈(AIBN)的摩尔比为1:7:40:0.6；洗脱时间为30h。
2.百菌清分子印迹聚合物的评价：应用扫描电镜对MIPs的形貌粒径进行表征，扫描电镜结果表明，MIPs相比较NIPs表面粗糙，质地疏松，粒径较宽为160nm，并分布大量空穴，因此具有较大的孔体积和比表面积，有利于目标分子与结合位点的接触；通过吸附动力学试验、静态吸附平衡试验及底物选择性试验对CHT MIPs的吸附性能进行研究，其结果显示：最佳吸附时间为3h，MIPs对百菌清及其降解产物都具有良好的吸附效果，但对联苯和葡萄糖吸附率较小。
3.百菌清分子印迹固相萃取柱(CHT MISPE)的制备：本实施例最终确定硅藻土：MIPs的质量比为1:1，5％甲醇-水作为淋洗剂，丙酮作为洗脱剂，洗脱剂用量≥6.0mL，最佳使用次数为3次。
4.建立百菌清及其降解产物同时分离检测的HPLC方法：在最佳色谱条件：色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；可变波长紫外检测器，检测波长为220nm、236nm；流动相B为乙腈，流动相C为水，进样量:20μL；柱温：25℃；流速：1mL/min，流动相使用梯度洗脱。5种药物在1mg/L～100mg/L范围内有良好的线性关系，相关系数(R2)分别为1.0000、1.0000、0.9999、1.0000、0.9961。此HPLC方法在30min内即可完成对5种物质的快速分离。
5.将CHT MISPE-HPLC应用于小白菜样品中：采用0.5％HCl乙腈溶液作为提取小白菜中的百菌清及其降解产物的提取剂。在1.0mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg的加标条件下，5种药物的加标回收率为80.1％～91.4％，RSD(n＝6)为1.70％～7.15％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备百菌清分子印迹聚合物；
S2、将所述百菌清分子印迹聚合物与硅藻土混合装柱制得百菌清分子印迹固相萃取柱；
S3、将制得的百菌清分子印迹固相萃取柱用于待测样品处理，得洗脱液；
S4、对步骤S3处理所得洗脱液，用色谱法检测洗脱液中的百菌清及其氧化还原产物含量。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，所述S3具体步骤如下：
S31、获得待测样品提取液；
S32、活化百菌清分子印迹固相萃取柱；
S33、将待测提取液过柱上样；
S34、对分子印迹固相萃取柱淋洗除杂，然后丙酮洗脱；得洗脱液。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，所述百菌清及其氧化还原产物包括4-羟基百菌清、5-氯1，3-间苯二腈、2，5-二氯-1，3-间苯二腈、2，4，5-三氯-1，3-间苯二腈。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，所述百菌清分子印迹聚合物制备方法如下：
以母体百菌清为模板分子，以乙腈为致孔剂，以丙烯酰胺为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，以偶氮二异丁腈分别为引发剂，并按照如下方法制备：
(1)称取百菌清，并溶解于乙腈中，然后加入丙烯酰胺，于室温下超声振荡30min，使百菌清与丙烯酰胺完全结合；接着，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯以及偶氮二异丁腈，继续超声振荡15min，使其充分混合均匀；充氮气排氧后密封，于60℃水浴锅中加热16h，得到白色固体聚合物；
(2)将步骤(1)得到的白色固体聚合物进行粉碎研磨，并过200目筛；
(3)用有机溶剂索氏提取以洗脱聚合物中的百菌清，接着再用超纯水洗脱至中性，最后将产物放于60℃烘箱中干燥24h，即得目标所需的以百菌清为虚拟模板的百菌清分子印迹聚合物MIPs。
5.根据权利要求4所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，百菌清：丙烯酰胺：乙二醇二甲基丙烯酸酯：偶氮二异丁腈的摩尔比为1：7：40：0.6。
6.根据权利要求4所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用有机溶剂索氏提取以洗脱聚合物中的百菌清过程中，洗脱时间为30h。
7.根据权利要求1所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，所述百菌清分子印迹固相萃取柱中，硅藻土：百菌清分子印迹聚合物的质量比为1：1-1：2。
8.根据权利要求1所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，所述待测样品包括水体、蔬菜、水果、粮食。
9.根据权利要求8所述的一种快速检测百菌清及其氧化还原产物的方法，其特征在于，当所述待测物为蔬菜、水果或粮食时，还包括待测液的制备，具体是将待测样品匀浆处理，然后加入0.5％HCl乙腈溶液提取，接着旋涡振荡2min，超声波提取30min，10000r/min离心10min，取上清液；用氮吹仪吹干，再用有机溶剂溶解，纯水稀释得待测溶液。
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