CN113929842A - 一种白僵菌素的磁性分子印迹材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白僵菌素的磁性分子印迹材料及其应用。通过在磁性Fe3O4纳米微球表面合成SiO2分子层，并且利用甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷进行双键化修饰，得到经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4‑SiO2磁性微球，再利用白僵菌素作为模板分子，在4‑乙烯基吡啶、经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4‑SiO2磁性微球、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的共同作用下，合成白僵菌素的磁性分子印迹材料。该磁性分子印迹材料能够特异性富集和净化白僵菌素，可用于白僵菌素检测样品的前处理，能够降低干扰，保证检测数据准确、可靠，具有操作方便，净化产物纯度高，易于自动化的优点。

Description

一种白僵菌素的磁性分子印迹材料及其应用
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种白僵菌素的磁性分子印迹材料及其应用。
背景技术
白僵菌素(Beauvericin，BEA)是由镰刀菌属(Fusarium)的部分菌种产生的六酯肽类化合物。已经发现有20余种镰刀菌属的细菌可以产生BEA，其中主要的产毒菌为黄色镰刀菌、燕麦镰刀菌和梨孢镰刀菌。
在化学结构上，BEA为典型的环状六酯肽类化合物，含有可变的羟基酸残基和N-甲基氨基酸残基，在N-甲基氨基酸残基上为苯丙酰胺残基。这些残基通过肽键或者分子内酯键链接形成六元环状缩酯肽结构。BEA的化学性质见表1。
表1：白僵菌素的化学性质
名称 分子式 分子量(g/mol) 熔点/℃ 旋光性(CHCl<sub>3</sub>溶液)
白僵菌素(BEA) C<sub>45</sub>H<sub>57</sub>N<sub>3</sub>O<sub>9</sub> 783.95 93-94 69
BEA的毒性作用与其离子载体抑制性相关，BEA能够提高阳离子穿过细胞膜的能力，由此干扰正常生理水平下的细胞阳离子水平，影响细胞膜的电化学梯度，而产生毒性反应。如细胞内钙离子浓度增加后，激活了钙依赖的内切酶活性而出现典型的凋亡特征，即DNA片段化。BEA对不同的细胞系均有毒性反应。在BEA的作用下，人结肠癌细胞内出现活性氧浓度上升和通过降低线粒体膜电位诱导线粒体依赖的细胞凋亡现象。POCSFALVI等发现，BEA可插入DNA双链而干扰DNA复制(POCSFALVIet.al.[J]Rapid Communication in MassSpectrometry,1997,11(3):265-272)。此外，研究发现，BEA在人淋巴细胞和动物中可诱导染色体畸变，姐妹染色单体交换和微核形成，最终引起细胞凋亡、线粒体功能异常和红细胞膜变形等现象。
白僵菌素的污染情况：李凤琴等在我国北京、安徽、宁夏等地市售的小麦及其制品中采集了17份样本，在这17份样本中均检出了白僵菌素BEA(韩小敏、李凤琴等,[J]中国食品卫生杂志,2017年,第29卷第6期p633-640)。根据文献报道，在挪威、丹麦、西班牙、意大利、突尼斯、摩洛哥等地收集的燕麦、小麦、玉米、玉米青贮饲料、黑麦、高粱以及相关的谷物制品中都检出了白僵菌素。
BEA的检测传统方法主要是依赖配合光电二极管阵列检测器的高效液相色谱(HPLC-DAD)检测法，但是由于单纯的色谱分析方法存在特异性不强，灵敏度不高的缺点，将高效液相色谱与质谱仪联用，开发了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测法。在我国，李凤琴和韩小敏等在2017年建立了玉米及其制品及小麦及其制品中白僵菌素和恩镰孢菌素的高效液相色谱-串联质谱检测法(中国食品卫生杂志，2017年第29卷第6期，633-640)。这是我国目前白僵菌素检测比较权威的方法。中国专利申请CN2017114086849公开了一种粮食及其制品中白僵菌素和恩镰孢菌素的协同检测方法，该方法包括以下步骤：S1，将粮食和粮食制品粉碎处理后溶解在有机溶液中涡旋、振荡并静置；S2，取静置后的上清液用超纯水进行稀释；S3，将稀释后的上清液固相萃取富集净化，并收集洗脱液；S4，将洗脱液进行高效液相色谱分离，流动相A选择为乙酸铵水溶液，流动相B选择为乙腈溶剂；梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：在第0-2分钟，流动相A与流动相B的体积比100:0；在第2-3分钟，流动相A与流动相B的体积比40:60；在第3-19分钟，流动相A与流动相B的体积比30:70；在第19-21分钟，流动相A与流动相B的体积比100:0；S5，对经过梯度洗脱后的进样液进行质谱检测。
无论是用HPLC-DAD或者LC-MS/MS，依赖仪器的白僵菌素检测方法中，都需要对样本中的白僵菌素进行提取和净化，净化后的毒素上机检测。样本前处理的效果直接影响了BEA检测的准确度。在上述李凤琴等建立的BEA检测的LC-MS/MS方法中，采用了一种C18的固相萃取柱进行毒素的净化。SORENSEN等采用乙腈-水提取毒素后，用滤纸过滤后进样进行检测(SORENSENet.al[J]Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,(21):10439-10443)。YOSHINARI等建立了小麦粉、全小麦粉和粗玉米粉中BEA的LC-MS/MS检测方法，样品经过乙腈-水(85:15，V/V)提取、离心、超纯水稀释、微孔滤膜过滤获得提取液，然后分别将提取液经5种固相萃取(SPE)柱净化：(1)Bond Elut C18(疏水性的键合硅胶C18吸附剂，500mg，美国Agilent Technolodies)；(2)InertSep C18(C18硅胶吸附剂，500mg，日本GLSciences)；(3)Isolute C18(C18吸附剂，200mg，瑞士Biotage)；(4)Oasis HLB(由两种基本单体：亲水性的N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯聚合而成，200mg，美国Waters)；(5)Sep-Park C18(单点式键合C18硅胶吸附剂，200mg，美国Waters)，净化后用ESI多反应监测模式在正离子模式下测定毒素的含量，其中净化效果相对较好的是Sep-Park C18(200mg)SPE柱，对小麦粉、全小麦粉和粗玉米粉中BEA的加标回收率范围为94.8％-111.3％(YOSHINARIT,SUZUKI Y,et al.Occurrence of beauvericin and enniatins in wheat flour andcorn grits on the Japanese market and their co-contamination with type Btrichothecene mycotoxins[J].Food Additives and Contaminants Part A ChemistryAnalysis Control Exposure and Risk Assessment，2016，33(10):1620-1626.)。现有BEA样本的前处理方法汇总见表2。
表2白僵菌素常见的样本前处理方式
Figure BDA0003358360820000031
Figure BDA0003358360820000041
从文献及市场产品的分析可以看出，在目前BEA的样本前处理方式中，有些研究者不做净化，在简单的乙腈-水提取以后，只做简单的过滤；除此以外，SPE柱是目前在检测过程中净化白僵菌素最常见的方法。常见的做法就是样本经过提取剂提取(通常是不同比例的乙腈-水溶液)得到提取液，提取液经过不同的固相萃取柱(SPE柱)净化，净化后的样本上机检测。但是SPE柱是一种广谱性的净化方法，在净化过程中，由于很多化合物都会在同一个结合和洗脱条件下被洗脱下来，容易造成净化产物中成分较多的情况，需要进一步借助具备较高分辨率的高效液相色谱将净化产物中的BEA和其它多种成分明显分离开。并且白僵菌素主要的检测样本多为粮食样本，构成比较复杂，所含的成份较多，基质效应严重，很容易影响净化效果，导致后续的检测结果受到影响。从现有技术的数据来看不同的样本净化方式对粮食样本中BEA的加标回收率范围往往有很大影响，容易造成BEA的加标回收率范围波动过大甚至可以达到68％-145％。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种白僵菌素的磁性分子印迹材料，能够特异性结合白僵菌素，降低其它物质的干扰。
本发明还提供了所述白僵菌素的磁性分子印迹材料作为吸附材料在富集净化样本中的白僵菌素中的应用，该磁性分子印迹材料能够特异性富集和净化白僵菌素，降低其它物质的干扰，保证检测数据准确、可靠。
一种白僵菌素的磁性分子印迹材料，采用包括如下步骤的制备方法制备：
(1)在Fe3O4磁性纳米微球表面合成SiO2分子层，得到Fe3O4-SiO2磁性微球；
(2)利用甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)对Fe3O4-SiO2磁性微球进行双键化修饰，得到经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球；
(3)利用白僵菌素作为模板分子，在4-乙烯基吡啶(4-VP)、经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)和偶氮二异丁腈(AIBN)中进行化学交联反应，得到磁性产物；
(4)将磁性产物用甲醇-乙酸混合液进行索氏提取，待模板分子洗脱完全后，将洗净的磁性产物干燥，得到白僵菌素的磁性分子印迹材料(BEAMIPS)即分子印迹聚合物。
本发明发现，以白僵菌素作为模板分子，选择TMPTMA作为单一交联剂，能够与4-乙烯基吡啶功能单体和经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球发生化学交联反应，生成特定结构的聚合物BEAMIPS，该特定结构的聚合物BEAMIPS能够特异性富集和净化白僵菌素。
为了达到更好的技术效果，进行以下优选：
步骤(1)中优选的操作步骤包括：取Fe3O4磁性纳米微球于盐酸水溶液中，超声处理后均匀分散于乙醇水溶液中，加入浓氨水和正硅酸四乙酯，搅拌反应，反应结束后分离出微球，经洗涤和干燥，得到Fe3O4-SiO2磁性微球。
所述盐酸水溶液的浓度为0.1mol/L-0.5mol/L；进一步优选为0.1mol/L-0.15mol/L。
所述Fe3O4磁性纳米微球的用量为每100mL盐酸水溶液中使用0.1g-0.5g；进一步优选为每100mL盐酸水溶液中使用0.1g-0.2g。
所述乙醇水溶液中乙醇与水的体积比在7:3-9:1；进一步优选为8:2。所述乙醇水溶液与盐酸水溶液的体积比可以为1-1.2:1。
所述浓氨水的质量百分浓度为22％-28％；进一步优选为28％。所述浓氨水的用量为每100mL盐酸水溶液中加入1mL-5mL；进一步优选为2mL。
所述正硅酸四乙酯的用量为每100mL盐酸水溶液中加入0.5mL-3mL；进一步优选为1mL。
所述搅拌反应的条件为22℃-25℃反应5小时-8小时；进一步优选为25℃反应6小时。
步骤(2)中优选的操作步骤包括：将Fe3O4-SiO2磁性微球分散在甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷-甲醇溶液中，搅拌，通过外加磁场收集所得到的经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球，洗涤干燥后备用。
所述甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷-甲醇溶液中甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的体积百分浓度在5％-15％，进一步优选为6％。
所述Fe3O4-SiO2磁性微球的用量为每100mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷-甲醇溶液中加入100mg-400mg；进一步优选为200mg。
所述搅拌的温度为40℃-60℃，搅拌至少24h。
步骤(3)中，所述化学交联反应优选在氮气保护下进行。进一步地，在氮气保护下将白僵菌素和4-乙烯基吡啶在无水乙腈中预反应，再加入经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、TMPTMA和AIBN-乙腈溶液在氮气保护下进行两步化学交联反应，得到磁性产物；所得磁性产物的结构更稳定。
步骤(3)中优选的操作步骤包括：取白僵菌素作为模板分子，加入4-乙烯基吡啶和无水乙腈混合均匀，在冰浴及氮气保护下搅拌均匀后在2℃-8℃预反应12h-20h；再加入经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、TMPTMA和AIBN-乙腈溶液，在氮气保护下先在40℃-80℃反应5h-10h，接着在50℃-80℃反应16h-30h，通过外加磁场分离出磁性产物，并将磁性产物洗净干燥待用。
所述4-乙烯基吡啶作为功能单体，其用量为每1mg白僵菌素中加入6μL-15μL；进一步优选为10μL。
所述无水乙腈作为反应溶剂，以使白僵菌素完全溶解为宜，其用量没有特别的要求。为了避免浪费原料、维持反应原料适宜的浓度，所述无水乙腈的用量优选为每1mg白僵菌素中加入1mL-2mL；进一步优选为1.8mL。
所述经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球的用量为每1mg白僵菌素中加入5mg-8mg。
所述TMPTMA的用量为每1mg白僵菌素中加入100μL-200μL；进一步优选为180μL。
所述AIBN-乙腈溶液的用量为每1mg白僵菌素中加入1mL-2mL；进一步优选为1.8mL。所述AIBN-乙腈溶液中AIBN的浓度在100mg/mL-200mg/mL；进一步优选为160mg/mL。其中，AIBN作为引发剂。
步骤(4)中，所述甲醇-乙酸混合液中甲醇与乙酸的体积比为7:3-9:1；进一步优选为9:1。
所述索氏提取的时间为25小时-35小时；进一步优选为30小时。
本发明洗涤采用去离子水和无水甲醇交替洗涤。
本发明干燥的条件为在50℃-60℃干燥。
所述白僵菌素的磁性分子印迹材料能够特异性富集和净化白僵菌素，可作为吸附材料应用在富集净化样本中的白僵菌素，例如可用于白僵菌素检测时的样本前处理中。
所述样本包括食品样本，例如玉米、小麦等样本，包括但不限于小麦、小麦粉、玉米、玉米粉、玉米青贮饲料、燕麦、高粱等中的一种或两种以上。
采用所述白僵菌素的磁性分子印迹材料作为吸附材料从样本中富集净化白僵菌素的方法，包括步骤：
将样本用作为提取剂的乙腈水溶液提取得到样品提取液，样品提取液与平衡后白僵菌素的磁性分子印迹材料混匀后静置，磁性分离，弃上清液；经磁性分离的磁性分子印迹材料依次经质量百分浓度10％-15％的乙腈水溶液、质量百分浓度50％-60％的乙腈水溶液洗涤后再与质量百分浓度80％-95％的乙腈水溶液混匀后磁性分离，上清液即为从样本中富集净化的白僵菌素的溶液。
所述作为提取剂的乙腈水溶液的用量优选为每克样本使用5mL-10mL。所述作为提取剂的乙腈水溶液中乙腈质量百分浓度为80％-90％。
所述样品提取液可加水稀释后与平衡后白僵菌素的磁性分子印迹材料混匀后静置，加水稀释时水与样品提取液的体积比优选为1-2:1。
所述样品提取液与白僵菌素的磁性分子印迹材料的用量之比优选为4mL：5mg-10mg。
本发明所用的原料、试剂等均可采用市售产品。
所述从样本中富集净化的白僵菌素的溶液作为处理后样品，可直接作为检测样本中白僵菌素的测试样品，能够有效的克服样本中其他物质对白僵菌素检测的干扰。
所述白僵菌素的检测方法，采用从样本中富集净化的白僵菌素的溶液作为测试样品，直接采用现有白僵菌素的检测方法中的一种或者多种进行检测。所述的检测方法，具体包括：取测试样品，直接采用现有白僵菌素的色谱检测法检测测试样品中白僵菌素。
所述现有白僵菌素的色谱检测法包括现有配合光电二极管阵列检测器的高效液相色谱(HPLC-DAD)检测法、现有液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测法、现有高效液相色谱-高分辨率质谱(HPLC-HRMS)检测法、现有液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测法等中的一种。
本发明具有以下有益效果：
本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料是针对白僵菌素的分子印迹材料，此材料特异性的结合白僵菌素，与其他的毒素以及样本中的基质不产生结合。因此，用于样本中白僵菌素的净化，能够特异性的结合白僵菌素，得到纯度较高的白僵菌素净化产物。大大提高了检测的准确性，减少了检测设备的负担。
本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料能够直接在液相中反应，不需要装柱。相对于目前常用的固相萃取柱来说，液相反应的结合效率更高，需要的样本量更少。只需提供外加磁场例如磁铁，就能够完成毒素的净化，节省了SPE柱的过柱装置，相同的样本量下吸附材料使用量少，节省了成本和操作时间。本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料可以达到甚至优于目前优质的SPE柱的水平。
本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料使用方便快捷，有利于实现自动化，可以适用于全自动化的净化设备，节省了人工，大大提高了样本处理效率。
附图说明
图1为白僵菌素的化学结构；
图2为白僵菌素的三维结构；
图3为小麦粉中白僵菌素5ppb加标回收检测质谱图；
图4为小麦粉中白僵菌素10ppb加标回收检测质谱图；
图5为小麦粉中白僵菌素50ppb加标回收检测质谱图；
图6为玉米样本中白僵菌素5ppb加标回收检测质谱图；
图7为玉米样本中白僵菌素10ppb加标回收检测质谱图；
图8为玉米样本中白僵菌素50ppb加标回收检测质谱图；
图3-图8中，横坐标Time，min为时间，分钟，纵坐标Intensity为信号强度。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述。
实施例1白僵菌素的磁性分子印迹材料的制备
(1)取0.2g Fe3O4磁性纳米微球于100mL0.1mol/L的盐酸水溶液中，超声处理10min，然后均匀分散于100mL乙醇与水体积比为8:2的乙醇-水溶液中，加入2mL质量百分浓度为28％的浓氨水和1mL正硅酸四乙酯，200rpm、25℃搅拌反应6h，反应结束后外加磁场分离出磁性固体即微球，磁性固体依次用去离子水和甲醇洗涤，“依次用去离子水和甲醇洗涤”的步骤重复操作3次，经洗涤后的磁性固体放入真空干燥箱55℃干燥，得到Fe3O4-SiO2磁性微球。
(2)将步骤(1)得到的Fe3O4-SiO2磁性微球200mg分散在含有6mLMPS的100mLMPS-甲醇溶液中，在50℃机械搅拌24h后，通过磁铁收集所得到的经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球。经MPS修饰的Fe3O4-SiO2磁性微球依次用去离子水和甲醇洗涤，“依次用去离子水和甲醇洗涤”的步骤重复操作3次，经洗涤后微球放入真空干燥箱55℃干燥，得到经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球。
(3)称取50mg白僵菌素作为模板分子，加入750μL4-乙烯基吡啶和90mL无水乙腈混合均匀，在冰浴及氮气保护下搅拌均匀后在4℃过夜(预反应16h)；在上述混合物中，加入0.3g经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、9mL的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)、90mL偶氮二异丁腈浓度为160mg/mL的偶氮二异丁腈-乙腈溶液，在氮气保护下先在50℃反应6h，接着在60℃下反应24h，通过外加磁场分离出磁性产物，并将磁性产物洗净干燥待用。
(4)将上述磁性产物，先用甲醇与乙酸体积比为9:1的甲醇-乙酸混合液进行索氏提取30h，待模板分子洗脱完全后，再用去离子水和甲醇反复洗涤，然后放入真空干燥箱55℃干燥，即得到白僵菌素的磁性分子印迹材料(BEAMIPS)
实施例2
利用白僵菌素的磁性分子印迹材料分离小麦粉中的白僵菌素，并且用LC-MS/MS检测
1.小麦粉样本前处理过程
取1份白僵菌素阴性小麦粉样本，按照每500g一份取3份，分三个梯度加入白僵菌素标准品，加标浓度分别为5μg/kg，10μg/kg和50μg/kg(即1kg白僵菌素阴性小麦粉样本中添加白僵菌素标准品的量分别为5μg，10μg和50μg)，得到加标样品，按照下列步骤操作。
1.1.分别称取5g加标浓度为5μg/kg加标样品、5g加标浓度为10μg/kg加标样品、5g加标浓度为50μg/kg加标样品、5g白僵菌素阴性小麦粉样本于50ml离心管中。
1.2.在各离心管中加入40mL样品提取剂乙腈水溶液(乙腈质量百分浓度为90％)，涡旋振荡60s，180rpm振荡提取20min后，室温静置5min。
1.3.分别准确移取各加标样品的10mL上清液于另一50mL离心管中，加入20mL水进行稀释，涡旋混匀60s，室温静置10min，得到稀释后的样品提取液，备用。
分别移取空白基质即白僵菌素阴性小麦粉样本的上清液3份于另三个50mL离心管中，每份10mL上清液，分三个梯度加入白僵菌素标准品，得到白僵菌素标准品加标浓度为5ppb、10ppb和50ppb三种基质匹配标准品，待检测。在基质匹配标准品中，最大限度的保留了样本基质中所有能溶于样本提取剂中的物质。
1.4.取10mg实施例1制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料，加入离心管中，先用无水甲醇平衡，在磁铁下磁性分离后，再用去离子水平衡，磁性分离后备用。
1.5.取4mL稀释后的样品提取液，加入预先装有10mg平衡后白僵菌素的磁性分子印迹材料的离心管中，振荡混匀后，静置2min，然后磁性分离，弃上清液。
1.6.在步骤1.5中经磁性分离的白僵菌素的磁性分子印迹材料中加入3mL质量百分浓度10％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；再在磁性材料中加入3mL质量百分浓度50％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；然后在磁性材料中加入2mL质量百分浓度90％的乙腈水溶液，振荡混匀后用磁铁磁性分离，上清液即从样本中富集净化的白僵菌素的溶液全部转移到洁净的离心管或相应容器中，以备检测。
2.仪器条件
质谱:选择电喷雾正离子扫描(ESI+)、多反应监测(MRM)模式，驻留时间为200毫秒(ms)。
色谱：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温35℃，样品室温度15℃，进样体积5μL，流速0.2mL/min。流动相A为含2mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：
0-2min流动相A体积百分比100％；
2min-3min流动相A体积百分比由100％降至40％，余量为流动相B；
3min-19min流动相A体积百分比由40％降至30％，余量为流动相B；
19min-20min流动相A体积百分比由30％升至100％，余量为流动相B；
20min-20.1min流动相A体积百分比100％。
3.结果计算
平均加标回收率(％)＝加标样品中白僵菌素的平均峰面积测定值/基质匹配标准品的平均峰面积×100％。
4.检测结果
检测的质谱图见附图3-5。
5μg/kg加标样品的平均加标回收率为100％±2％；10μg/kg加标样品的平均加标回收率为96％±2％；50μg/kg加标样品的平均加标回收率为102％±3％。
实施例3
利用本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料对玉米样本中白僵菌素的提取净化及LC-MS/MS检测。
1.玉米样本的前处理
取1份玉米样本，样本用高速粉碎机粉碎后得到玉米粉，按照每500g一份，取3份，按照5μg/kg，10μg/kg和50μg/kg的浓度，加入白僵菌素标准品(即1kg玉米粉中添加白僵菌素标准品的量分别为5μg，10μg和50μg)，得到加标样品，然后按照下列操作进行。
1.1.分别称取5g加标浓度为5μg/kg加标样品、5g加标浓度为10μg/kg加标样品、5g加标浓度为50μg/kg加标样品、5g白僵菌素阴性玉米粉样本于50ml离心管中。
1.2.在各离心管中加入40mL样品提取剂乙腈水溶液(乙腈质量百分浓度为90％)，涡旋振荡60s，180rpm振荡提取20min后，室温静置5min。
1.3.分别准确移取各加标样品的10mL上清液于另一50mL离心管中，加入20mL水进行稀释，涡旋混匀60s，室温静置10min，得到稀释后的样品提取液，备用。
分别移取白僵菌素阴性玉米粉样本的上清液3份于另三个50mL离心管中，每份10mL上清液，分三个梯度加入白僵菌素标准品，得到白僵菌素标准品加标浓度为5ppb、10ppb和50ppb三种基质匹配标准品，待检测。
1.4.取10mg实施例1制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料，加入离心管中，先用无水甲醇平衡，在磁铁下磁性分离后，再用去离子水平衡，磁性分离后备用。
1.5.取4mL稀释后的样品提取液，加入上述预先装有10mg平衡后白僵菌素的磁性分子印迹材料的离心管中，振荡混匀后，静置2min，然后磁性分离，弃上清液。
1.6.在步骤1.5中经磁性分离的白僵菌素的磁性分子印迹材料中加入3mL质量百分浓度10％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；再在磁性材料中加入3mL质量百分浓度50％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；然后在磁性材料中加入2mL质量百分浓度90％的乙腈水溶液，振荡混匀后用磁铁磁性分离，上清液即从样本中富集净化的白僵菌素的溶液全部转移到洁净的离心管或相应容器中，以备检测。
2.仪器条件
同实施例2。
3.结果计算
同实施例2。
4.检测结果
检测的质谱图见附图6-8。
5μg/kg加标样品的平均加标回收率为97％±3％；10μg/kg加标样品的平均加标回收率为95％±3％；50μg/kg加标样品的平均加标回收率为101％±3％。
实施例4白僵菌素的磁性分子印迹材料的制备
(1)取0.1g Fe3O4磁性纳米微球于100mL0.15mol/L的盐酸水溶液中，超声处理12min，然后均匀分散于100mL乙醇与水体积比为7:3的乙醇-水溶液中，加入5mL质量百分浓度为22％的浓氨水和0.5mL正硅酸四乙酯，300rpm、22℃搅拌反应8h，反应结束后外加磁场分离出磁性固体即微球，磁性固体依次用去离子水和甲醇洗涤，“依次用去离子水和甲醇洗涤”的步骤重复操作3次，经洗涤后的磁性固体放入真空干燥箱60℃干燥，得到Fe3O4-SiO2磁性微球。
(2)将步骤(1)得到的Fe3O4-SiO2磁性微球100mg分散在含有5mLMPS的100mLMPS-甲醇溶液中，在40℃机械搅拌24h，通过磁铁收集所得到的经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球。经MPS修饰的Fe3O4-SiO2磁性微球依次用去离子水和甲醇洗涤，“依次用去离子水和甲醇洗涤”的步骤重复操作3次，经洗涤后微球放入真空干燥箱60℃干燥，得到经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球。
(3)称取50mg白僵菌素作为模板分子，加入300μL4-乙烯基吡啶和50mL无水乙腈混合均匀，在冰浴及氮气保护下搅拌均匀后在2℃预反应20h；在上述混合物中，加入0.25g经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、5mL的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)、50mL偶氮二异丁腈浓度为200mg/mL的偶氮二异丁腈-乙腈溶液，在氮气保护下先在40℃反应10h，接着在50℃下反应30h，通过外加磁场分离出磁性产物，并将磁性产物洗净干燥待用。
(4)将上述磁性产物，先用甲醇与乙酸体积比为7:3的甲醇-乙酸混合液进行索氏提取35h，待模板分子洗脱完全后，再用去离子水和甲醇反复洗涤，然后放入真空干燥箱60℃干燥，即得到白僵菌素的磁性分子印迹材料(BEAMIPS)
实施例5白僵菌素的磁性分子印迹材料的制备
(1)取0.5g Fe3O4磁性纳米微球于100mL0.5mol/L的盐酸水溶液中，超声处理8min，然后均匀分散于100mL乙醇与水体积比为9:1的乙醇-水溶液中，加入1mL质量百分浓度为25％的浓氨水和3mL正硅酸四乙酯，200rpm、25℃搅拌反应5h，反应结束后外加磁场分离出磁性固体即微球，磁性固体依次用去离子水和甲醇洗涤，“依次用去离子水和甲醇洗涤”的步骤重复操作3次，经洗涤后的磁性固体放入真空干燥箱50℃干燥，得到Fe3O4-SiO2磁性微球。
(2)将步骤(1)得到的Fe3O4-SiO2磁性微球400mg分散在含有15mLMPS的100mLMPS-甲醇溶液中，在60℃机械搅拌24h后，通过磁铁收集所得到的经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球。经MPS修饰的Fe3O4-SiO2磁性微球依次用去离子水和甲醇洗涤，“依次用去离子水和甲醇洗涤”的步骤重复操作3次，经洗涤后微球放入真空干燥箱50℃干燥，得到经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球。
(3)称取50mg白僵菌素作为模板分子，加入500μL4-乙烯基吡啶和100mL无水乙腈混合均匀，在冰浴及氮气保护下搅拌均匀后在8℃预反应12h；在上述混合物中，加入0.4g经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、10mL的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)、100mL偶氮二异丁腈浓度为100mg/mL的偶氮二异丁腈-乙腈溶液，在氮气保护下先在80℃反应5h，接着在80℃下反应16h，通过外加磁场分离出磁性产物，并将磁性产物洗净干燥待用。
(4)将上述磁性产物，先用甲醇与乙酸体积比为8:2的甲醇-乙酸混合液进行索氏提取25h，待模板分子洗脱完全后，再用去离子水和甲醇反复洗涤，然后放入真空干燥箱50℃干燥，即得到白僵菌素的磁性分子印迹材料(BEAMIPS)
实施例6
除了“1.2.在各离心管中加入25mL样品提取剂乙腈水溶液(乙腈质量百分浓度为85％)，涡旋振荡30s，200rpm振荡提取10min后，室温静置5min。
1.3.分别准确移取各加标样品的10mL上清液于另一50mL离心管中，加入20mL水进行稀释，涡旋混匀50s，室温静置10min，得到稀释后的样品提取液，备用。
分别移取白僵菌素阴性小麦粉样本的上清液3份于另三个50mL离心管中，每份10mL上清液，分三个梯度加入白僵菌素标准品，得到白僵菌素标准品加标浓度为5ppb、10ppb和50ppb三种基质匹配标准品，待检测。
1.4.取5mg实施例4制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料，加入离心管中，先用无水甲醇平衡，在磁铁下磁性分离后，再用去离子水平衡，磁性分离后备用。
1.5.取4mL稀释后的样品提取液，加入预先装有5mg平衡后白僵菌素的磁性分子印迹材料的离心管中，振荡混匀后，静置2min，然后磁性分离，弃上清液。
1.6.在步骤1.5中经磁性分离的白僵菌素的磁性分子印迹材料中加入3mL质量百分浓度15％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；再在磁性材料中加入3mL质量百分浓度60％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；然后在磁性材料中加入2mL质量百分浓度95％的乙腈水溶液，振荡混匀后用磁铁磁性分离，上清液即从样本中富集净化的白僵菌素的溶液全部转移到洁净的离心管或相应容器中，以备检测。”，其余操作同实施例2。
5μg/kg加标样品的平均加标回收率为100％±2％；10μg/kg加标样品的平均加标回收率为95％±3％；50μg/kg加标样品的平均加标回收率为103％±4％。
实施例7
除了“1.2.在各离心管中加入50mL样品提取剂乙腈水溶液(乙腈质量百分浓度为80％)，涡旋振荡45s，150rpm振荡提取60min后，室温静置3min。
1.3.分别准确移取各加标样品的10mL上清液于另一50mL离心管中，加入10mL水进行稀释，涡旋混匀30s，室温静置8min，得到稀释后的样品提取液，备用。
分别移取白僵菌素阴性小麦粉样本的上清液3份于另三个50mL离心管中，每份10mL上清液，分三个梯度加入白僵菌素标准品，得到白僵菌素标准品加标浓度为5ppb、10ppb和50ppb三种基质匹配标准品，待检测。
1.4.取8mg实施例5制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料，加入离心管中，先用无水甲醇平衡，在磁铁下磁性分离后，再用去离子水平衡，磁性分离后备用。
1.5.取4mL稀释后的样品提取液，加入预先装有8mg平衡后白僵菌素的磁性分子印迹材料的离心管中，振荡混匀后，静置2min，然后磁性分离，弃上清液。
1.6.在步骤1.5中经磁性分离的白僵菌素的磁性分子印迹材料中加入3mL质量百分浓度12％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；再在磁性材料中加入3mL质量百分浓度55％的乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；然后在磁性材料中加入2mL质量百分浓度80％的乙腈水溶液，振荡混匀后用磁铁磁性分离，上清液即从样本中富集净化的白僵菌素的溶液全部转移到洁净的离心管或相应容器中，以备检测。”，其余操作同实施例2。
5μg/kg加标样品的平均加标回收率为98％±2％；10μg/kg加标样品的平均加标回收率为96％±2％；50μg/kg加标样品的平均加标回收率为100％±3％。
对比例1
采用现有SPE柱净化方法净化玉米粉样本中的白僵菌素
1.玉米样本的前处理
取1份玉米样本(同实施例3)，样本用高速粉碎机粉碎后得到玉米粉，按照每500g一份，取3份，按照5μg/kg，10μg/kg和50μg/kg的浓度，加入白僵菌素标准品(即1kg玉米粉中添加白僵菌素标准品的量分别为5μg，10μg和50μg)，得到加标样品。采用现有SPE柱净化方法操作(参照文献：韩小敏等《中国食品卫生杂志》2017年第29卷第6期p633进行)。
固相萃取柱采用Sep-Pak Vac C18固相萃取柱(Waters，6cc Vac Cartridge，SKU：WAT043395)。
2.处理方法如下：
2.1提取：
称取5.0g样品(精确至0.01g)于50mL刻度离心管中，加入40mL样品提取液(乙腈：水＝85：15，V/V)，加盖密封后涡旋混匀60s；180r/min振荡提取30min，室温静置20min；
准确移取10mL上清液于另一50mL刻度离心管，加入20mL水进行稀释，加盖密封并涡旋混匀60s，室温静置20min备用，得到稀释后的样品提取液。
2.2净化：
SPE柱中加入3mL甲醇活化，继续加入3mL水活化，得到活化后SPE柱；
取4mL最终稀释后的样品提取液全部通过活化后SPE柱；
接着，SPE柱用3mL质量百分浓度10％乙腈水溶液淋洗；再用3mL质量百分浓度50％乙腈水溶液淋洗，并抽干SPE柱；最后用2mL质量百分浓度90％乙腈水溶液洗脱毒素；抽干SPE柱并收集洗脱液，涡旋混匀后备用。
3.仪器条件
质谱：选择电喷雾正离子扫描(ESI+)、多反应监测(MRM)模式，驻留时间为200毫秒(ms)。
色谱：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，柱温35℃，样品室温度15℃，进样体积5μL，流速0.2mL/min。流动相A为含2mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：
0-2min流动相A体积百分比100％；
2min-3min流动相A体积百分比由100％降至40％，余量为流动相B；
3min-19min流动相A体积百分比由40％降至30％，余量为流动相B；
19min-20min流动相A体积百分比由30％升至100％，余量为流动相B；
20min-20.1min流动相A体积百分比100％。
4.结果计算
平均加标回收率(％)＝加标样品的平均峰面积/基质匹配标准品的平均峰面积×100％。其中基质匹配标准品同实施例3。
5.检测结果
5.1回收率比较
5μg/kg加标样品的平均加标回收率为130％±5％；10μg/kg加标样品的平均加标回收率为115％±5％；50μg/kg加标样品的平均加标回收率为108％±6％。
与实施例3中回收率数据对比，本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料在回收率方面优于现有Sep-Pak Vac C18固相萃取柱，表明本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料用于样本中白僵菌素的净化，能够特异性的结合白僵菌素，得到纯度较高的白僵菌素净化产物，可以达到甚至优于目前优质SPE柱的水平，大大提高了检测的准确性，减少了检测设备的负担。
5.2操作时间比较
本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料能够直接在液相中反应，不需要装柱。相对于目前常用的固相萃取柱来说，液相反应的结合效率更高，需要的样本量更少。只需提供外加磁场例如磁铁，就能够完成毒素的净化，节省了SPE柱的过柱装置，节省了成本和操作时间。本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料用无水甲醇平衡，在磁铁下磁性分离后，再用去离子水平衡，磁性分离后备用，稀释后的样品提取液，加入上述预先装有平衡后白僵菌素的磁性分子印迹材料的离心管中，振荡混匀后，静置2min，然后磁性分离，弃上清液；经磁性分离的白僵菌素的磁性分子印迹材料中加入乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；再在磁性材料中加入乙腈水溶液，振荡混匀后磁性分离，弃上清液；然后在磁性材料中加入乙腈水溶液，振荡混匀后用磁铁磁性分离，上清液全部转移到洁净的离心管或相应容器中，以备检测；这一净化过程中磁性分子印迹材料振荡混匀的时间只要几秒钟，一般5-10秒钟就能振荡混匀，磁性分离的时间一般不到五秒钟，加上磁铁磁性分离材料能立即贴壁，直接可以将液体分离后吸出，整个净化过程所用的时间一般在5-6分钟。
现有的SPE柱纯化法中SPE柱净化白僵菌素的过程(即2.2净化过程)：各试剂和样品提取液通过SPE柱的时间一般为1ml流过SPE柱的时间在1-2分钟，因此，SPE柱净化白僵菌素的过程所用的时间一般在18-36分钟。
对比看出，本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料大大减少了样本前处理的时间，显著提高了检测效率。
5.3净化材料用量的比较
本对比例采用的SPE柱为Waters公司的Sep-Pak C18固相萃取柱：6cc VacCartridge,SKU：WAT043395；其SPE材料装量为500mg。现有技术中用到的净化白僵菌素的SPE柱信息如下：
Bond Elut C18(疏水性的键合硅胶C18吸附剂，500mg，美国AgilentTechnolodies)；
InertSep C18(C18硅胶吸附剂，500mg，日本GL Sciences)；
Isolute C18(C18吸附剂，200mg，瑞士Biotage)；
Oasis HLB(由两种基本单体：亲水性的N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性的二乙烯基苯聚合而成，200mg，美国Waters)；
Sep-Park C18(单点式键合C18硅胶吸附剂，200mg，美国Waters)；
可见，目前使用的SPE柱中的固相萃取材料用量从200mg-500mg不等；而本发明的磁性分子印迹材料，在处理同样的样本量时，用量在5mg-10mg。对比可得，本发明白僵菌素的磁性分子印迹材料在处理样本时的材料用量远远低于目前常用的固相萃取(SPE)材料。材料用量的节省往往意味着成本的降低，这对于白僵菌素的检测试验来说，是非常有利的。
对比例2交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯
经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球同实施例1。
取50mg白僵菌素作为模板分子，加入750μL4-乙烯基吡啶和90mL无水乙腈混合均匀后搅拌5h；在上述混合物中，加入0.3g经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、9mL乙二醇二甲基丙烯酸酯和90mL偶氮二异丁腈浓度为160mg/mL的偶氮二异丁腈-乙腈溶液，吹氮脱氧后在70℃下反应10h，通过外加磁场分离出磁性产物，并将磁性产物洗净干燥待用。
将上述磁性产物，先用甲醇与乙酸体积比为9:1的甲醇-乙酸混合液进行索氏提取30h，待模板分子洗脱完全后，再用去离子水和甲醇反复洗涤，然后放入真空干燥箱55℃干燥，即得到磁性分子印迹材料。
对比例3交联剂为TMPTMA和乙二醇二甲基丙烯酸酯
经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球同实施例1。
取50mg白僵菌素作为模板分子，加入750μL4-乙烯基吡啶和90mL无水乙腈混合均匀后搅拌5h；在上述混合物中，加入0.3g经MPS修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、9mL三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)、9mL乙二醇二甲基丙烯酸酯和90mL偶氮二异丁腈浓度为160mg/mL的偶氮二异丁腈-乙腈溶液，吹氮脱氧后在60℃下反应10h，通过外加磁场分离出磁性产物，并将磁性产物洗净干燥待用。
将上述磁性产物，先用甲醇与乙酸体积比为9:1的甲醇-乙酸混合液进行索氏提取30h，待模板分子洗脱完全后，再用去离子水和甲醇反复洗涤，然后放入真空干燥箱55℃干燥，即得到磁性分子印迹材料。
对比例4
除了将实施例2中“1.4.取10mg实施例1制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料”替换成“1.4.取10mg对比例2制备的磁性分子印迹材料”，其余操作同实施例2。
加标回收率结果如下表3：
表3
Figure BDA0003358360820000211
从结果可以看出，以乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，合成的磁性分子印迹材料在处理小麦样本的时候，回收率普遍偏高，并且变异较大。重复多次都显示了类似的结果，分析其原因，可能是由于以乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂的白僵菌素磁性分子印迹材料合成时的模板不能有效的洗脱干净，导致模板分子残留在分子印迹材料上。在进行小麦样本处理的时候，模板分子被随机的洗脱下来，洗脱下来的模板分子并没有明显的规律。由此导致在真正进行小麦样本处理的时候回收率偏高和变异较大。说明乙二醇二甲基丙烯酸酯不适合作为富集净化白僵菌素的磁性分子印迹材料的交联剂。
对比例5
除了将实施例2中“1.4.取10mg实施例1制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料”替换成“1.4.取10mg对比例3制备的磁性分子印迹材料”，其余操作同实施例2。
加标回收率结果如下表4：
表4
Figure BDA0003358360820000212
从结果看出，用两种交联剂共同反应后制备的磁性分子印迹材料，在处理小麦样本时，加标回收率普遍低，低于通常的回收率要求(80％-120％)，分析其原因，可能是由于在印迹反应中使用了两种交联剂，使反应变的更为复杂，影响因素更多，需要进行更多的更为复杂的设计和调整，除了考虑反应中单体、交联剂、引发剂的比例及反应条件外，还需要调整两种交联剂的相互之间的比例等等。单一的交联剂比例设定并不能得到优化的印迹效果，因此影响了样本处理时白僵菌素的结合和回收效率。在实际的生产过程中，两种交联剂的使用使得白僵菌素磁性分子印迹材料的合成更为复杂，因此并不是合适的白僵菌素磁性分子印迹材料的选择。
对比例6
除了将实施例3中“1.4.取10mg实施例1制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料”替换成“1.4.取10mg对比例2制备的磁性分子印迹材料”，其余操作同实施例3。
加标回收率结果如下表5：
表5
Figure BDA0003358360820000221
从结果可以看出，以乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，合成的磁性分子印迹材料在处理玉米样本的时候，回收率普遍偏高，并且变异较大。重复多次都显示了类似的结果，分析其原因，可能是由于以乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂的白僵菌素磁性分子印迹材料合成时的模板不能有效的洗脱干净，导致模板分子残留在分子印迹材料上。在进行玉米样本处理的时候，模板分子被随机的洗脱下来，洗脱下来的模板分子并没有明显的规律。由此导致在真正进行玉米样本处理的时候回收率偏高和变异较大。说明乙二醇二甲基丙烯酸酯不适合作为富集净化白僵菌素的磁性分子印迹材料的交联剂。
对比例7
除了将实施例3中“1.4.取10mg实施例1制备的白僵菌素的磁性分子印迹材料”替换成“1.4.取10mg对比例3制备的磁性分子印迹材料”，其余操作同实施例3。
加标回收率结果如下表6：
表6
Figure BDA0003358360820000231
从结果看出，用两种交联剂共同反应后制备的磁性分子印迹材料，在处理玉米样本时，加标回收率普遍低，低于通常的回收率要求(80％-120％)，分析其原因，可能是由于在印迹反应中使用了两种交联剂，使反应变的更为复杂，影响因素更多，需要进行更多的更为复杂的设计和调整，除了考虑反应中单体、交联剂、引发剂的比例及反应条件外，还需要调整两种交联剂的相互之间的比例等等。单一的交联剂比例设定并不能得到优化的印迹效果，因此影响了样本处理时白僵菌素的结合和回收效率。在实际的生产过程中，两种交联剂的使用使得白僵菌素磁性分子印迹材料的合成更为复杂，因此并不是合适的白僵菌素磁性分子印迹材料的选择。
本发明所述范围内各参数的变化并不影响白僵菌素的磁性分子印迹材料制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现白僵菌素的磁性分子印迹材料的制备。在此不再赘述。

Claims (10)

1.一种白僵菌素的磁性分子印迹材料，其特征在于，采用包括如下步骤的制备方法制备：
(1)在Fe3O4磁性纳米微球表面合成SiO2分子层，得到Fe3O4-SiO2磁性微球；
(2)利用甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷对Fe3O4-SiO2磁性微球进行双键化修饰，得到经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球；
(3)利用白僵菌素作为模板分子，在4-乙烯基吡啶、经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈中进行化学交联反应，得到磁性产物；
(4)将磁性产物用甲醇-乙酸混合液进行索氏提取，待模板分子洗脱完全后，将洗净的磁性产物干燥，得到白僵菌素的磁性分子印迹材料。
2.根据权利要求1所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(3)包括：在氮气保护下将白僵菌素和4-乙烯基吡啶在无水乙腈中预反应，再加入经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈-乙腈溶液在氮气保护下进行两步化学交联反应，得到磁性产物。
3.根据权利要求2所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(3)包括：取白僵菌素作为模板分子，加入4-乙烯基吡啶和无水乙腈混合均匀，在冰浴及氮气保护下搅拌均匀后在2℃-8℃预反应12h-20h；再加入经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈-乙腈溶液，在氮气保护下先在40℃-80℃反应5h-10h，接着在50℃-80℃反应16h-30h，通过外加磁场分离出磁性产物，并将磁性产物洗净干燥待用。
4.根据权利要求1、2或3所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(3)中，白僵菌素与4-乙烯基吡啶、经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的用量比例为1mg：6μL-15μL：5mg-8mg：100μL-200μL。
5.根据权利要求1所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(1)包括：取Fe3O4磁性纳米微球于盐酸水溶液中，超声处理后均匀分散于乙醇水溶液中，加入浓氨水和正硅酸四乙酯，搅拌反应，反应结束后分离出微球，经洗涤和干燥，得到Fe3O4-SiO2磁性微球。
6.根据权利要求5所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(1)中，所述盐酸水溶液的浓度为0.1mol/L-0.5mol/L；
所述Fe3O4磁性纳米微球的用量为每100mL盐酸水溶液中使用0.1g-0.5g；
所述乙醇水溶液中乙醇与水的体积比在7:3至9:1；
所述浓氨水的质量百分浓度为22％-28％；
所述正硅酸四乙酯的用量为每100mL盐酸水溶液中加入0.5mL-3mL；
所述搅拌反应的条件为22℃-25℃反应5小时-8小时。
7.根据权利要求1所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(2)包括：将Fe3O4-SiO2磁性微球分散在甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷-甲醇溶液中，搅拌，通过外加磁场收集所得到的经甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的活性Fe3O4-SiO2磁性微球，洗涤干燥后备用。
8.根据权利要求7所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(2)中，所述甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷-甲醇溶液中甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的体积百分浓度在5％-15％；
所述Fe3O4-SiO2磁性微球的用量为每100mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷-甲醇溶液中加入100mg-400mg。
9.根据权利要求1所述的磁性分子印迹材料，其特征在于，步骤(4)中，所述甲醇-乙酸混合液中甲醇与乙酸的体积比为7:3至9:1；
所述索氏提取的时间为25小时-35小时。
10.根据权利要求1-9任一项所述的磁性分子印迹材料作为吸附材料在富集净化样本中的白僵菌素中的应用。
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