CN111499800A - 玉米赤霉烯酮表面印迹聚合物及其合成方法和在谷物检测中的应用 - Google Patents
玉米赤霉烯酮表面印迹聚合物及其合成方法和在谷物检测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属分析化学领域，涉及一种玉米赤霉烯酮表面印迹聚合物及其合成方法和在谷物检测中的应用。以香豆素‑3‑羧酸作为玉米赤霉烯酮替代模板，选取金属有机骨架MIL‑101(Cr)作为吸附材料载体，采用物理包裹和化学键接枝的方法合成MIL‑101(Cr)@MIPs。将其作为柱填料制备成固相萃取小柱，用于粮食样品中玉米赤霉烯酮的前处理。与固相萃取技术相结合，从而达到对复杂基质样品中痕量玉米赤霉烯酮的快速、灵敏提取以及准确的定量测定。
Description
技术领域
本发明属分析化学领域，涉及一种玉米赤霉烯酮表面印迹聚合物及其合成方法和在谷物检测中的应用。
背景技术
真菌毒素种类繁多，包括玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone,ZEN)、黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素、呕吐毒素等。真菌毒素存在范围广泛，在玉米、小麦、大豆、大米、燕麦等粮食作物中均有可能存在。在粮食的种植、运输、存储以及加工阶段，在一定的温度和湿度条件下，粮食作物会产生ZEN等真菌毒素。但是由于ZEN等具有很强的热稳定性，在一般的烹饪过程中(如煎、炸、蒸、煮)很难被降解或破坏，所以这些毒素被加工为食物或饲料后，通过直接或间接的方式进入人体内并在体内进行累积。由于具有高的致畸、致癌性质，低浓度水平的ZEN等真菌毒素也会对人体造成极大的危害。已有研究报道证明ZEN属于一种内分泌干扰物，它会与雌激素受体相互结合，还会与类固醇发生相互作用。ZEN的存在也是导致女孩性早熟的原因之一。同时ZEN具有遗传和生殖毒性，会对DNA造成损伤。而且ZEN会对肝功能有一定影响；促进雌激素依赖性肿瘤，引起消化道炎症。
由于ZEN的广泛存在和其低含量高毒性的特性，不同的国家、地区和组织制定了ZEN在粮食中的限量标准。其中我国的限量标准不得高于60μg kg-1。目前关于ZEN的报道中，对ZEN的检测定量方法主要有液相色谱-荧光检测器联用法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法以及薄层色谱法。这些检测方法利用ZEN和样品基质在色谱上的不同保留时间不同，而对ZEN进行分离，然后使用荧光或质谱检测器对ZEN进行定量检测，但是由于实际粮食样品中的ZEN含量为痕量级别，且样品基质非常复杂，实际样品的提取液会含有很多杂质和干扰物质。这不仅会对检测时，首先要对样品进行前处理，对样品中的ZEN进行分离和富集，减少样品基质对检测的干扰。
对样品中ZEN的检测常用的前处理手段主要包括：固相萃取法(Solid PhaseExtraction,SPE)，液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction,LLE)，免疫亲和层析法。SPE利用了目标物质和干扰物质之间在固定相填料和洗脱溶液中的保留能力不同，从而达到对目标物质和干扰物质分离的目的，但是对于含有复杂基质的粮食样品中的痕量ZEN，由于SPE柱的选择性不足，所以其提取效果仍然不能够满足要求。LLE又被称为溶剂萃取，其原理是利用混合溶液中不同组分在溶剂中的分配系数或溶解度不同，目标物质在两相中进行重新分配，从而达到对目标组分的分离与富集。LLE所需的操作装置简单，且只需寻找合适的萃取溶剂即可，但是其操作繁琐费时，而且在萃取过程中需要使用大量的有机溶剂，对环境不友好，不符合绿色化学的理念。免疫亲和层析法利用抗原-抗体间的高选择亲和能力对样品中的目标物质进行分离提取的方法即为免疫亲和层析法，方法中利用了抗原-抗体间的亲和能力达到了对目标组分高性能的分离与富积。使用IAC对样品进行前处理仍然具有一定的局限性，IAC的单价较为昂贵，而且需要低温保存且只能够单次使用，这些因素即导致在一些经济不发达或欠发达的地区使用IAC用于食品中ZEN的前处理仍然具有一定的困难。所以需要一种材料对粮食中的痕量ZEN前处理过程中，既能降低样品基质的干扰，对ZEN具有选择能力，能够对痕量的ZEN进行选择性的分离与富集，而且操作使用简便，省时省力，经济环保。
分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)是一种采用分子印迹技术所合成的具有选择识别能力的高分子聚合物。有研究将MIPs与SPE或μ-SPE技术相结合，用于对复杂样品进行前处理除去样品基质的干扰。虽然MIPs具有良好的选择性、重复性等优点，但是传统的MIPs仍具有一些不足有待改进，传统的MIPs的合成多为本体聚合、沉淀聚合以及悬浮聚合等手段，合成后的传统MIPs模板分子会随机分布于聚合物的内部与表面，而存在于聚合物内部的模板分子由于位置的关系，难以去除，需要更多时间移除内部的模板分子，如果模板分子未去除完全，会对分离的结果与效率产生影响，也会造成模板分子的浪费，这些不足限制了MIPs发展与使用。
表面分子印迹聚合物(Surface Molecularly Imprinted Polymers，SMIPs)相较于传统MIPs具有更好的吸附性能，更高其传质速率，更短的吸附平衡时间等优势，用于前处理操作中能加快目标物质的分离与提取。而金属有机骨架(Metal Organic Framework，MOFs)是一种有机/无机杂化材料，是由金属离子与有机配体通过配位作用制备的多孔材料。通过改变有机连接配体可以达到对孔径尺寸大小的调节，具有更高比表面积和多孔性。所以MOFs与表面分子印迹聚合物相结合对粮食中的ZEN等真菌毒素进行前处理具有很好的前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种玉米赤霉烯酮表面印迹聚合物，对食品中玉米赤霉烯酮进行分离与富集，除去样品基质的干扰，更好地实现其准确、灵敏、低成本的检测。
为实现本发明目的，利用MIPs的选择识别以及再生等能力，对ZEN进行选择性的分离与吸附，制备表面印迹聚合物，并与SPE技术相结合制备固相萃取小柱，从而达到对复杂基质样品中痕量ZEN的快速、灵敏提取以及准确的定量。
具体技术方案如下：
由于ZEN毒性很大，价格昂贵，约500元/mg，而且合成后难以回收，而实际待检测的粮食样品中的ZEN含量水平很低，均为痕量级别，以ZEN为模板的MIPs可能会因为模板分子未洗脱完全、模板泄露等问题从而造成待检测样品的“假阳性”，对检测结果影响较大，而且ZEN也存在危害实验操作人员健康的隐患。考虑到ZEN直接作为模板分子而可能会导致的这些潜在因素，所以在实验中采用了替代模板技术，通过实验选取了与ZEN结构类似的香豆素-3-羧酸合成MIL-101(Cr)@MIPs。
如图2(a)所示，过量的功能单体(α-MAA)与载体(MIL-101(Cr))在超声作用下混合，促进α-MAA充分分散在载体当中，之后MIL-101(Cr)与α-MAA的混合物与替代模板分子混合，并在超声作用下通过氢键作用形成预聚物。预聚物与交联剂和引发剂通过原位聚合发方法形成MIL-101(Cr)@MIPs。
MIL-101(Cr)@MIPs的模板的移除和ZEN识别如图2(c)所示。模板分子通过索氏提取器移除后，SMIPs的识别位点和印迹孔穴及具有选择吸附能力。当SMIPs与样品溶液相互混合后，其识别位点和印迹孔穴即对溶液中ZEN和其结构类似物进行识别，并进行选择性吸附，从而达到对ZEN的吸附与分离的效果。
(1)合成MIL-101(Cr)
称Cr(NO3)9H2O和对苯二甲酸(H2BDC)，投入反应釜中，加入去离子水，磁力搅拌，加入HF，搅拌，旋紧不锈钢反应釜外套。采用水热合成法制备，控制烘箱温度由50℃升至220℃，保持220℃反应。反应结束后，冷却至室温，过滤得MIL-101(Cr)。
(2)合成MIL-101(Cr)@MIPs模板
将MIL-101(Cr)分散在乙醇中，加入α-甲基丙烯酸(α-Methacrylic acid，α-MAA)混合超声，反应结束后冲洗，过滤。然后加入香豆素-3-羧酸和乙醇，超声混合，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，超声，加入偶氮二异丁腈(AIBN)，加热磁力搅拌下反应，经过滤，烘干，得MIL-101(Cr)@MIPs模板。
(3)模板分子的去除
使用乙腈:水(9:1,V/V)混合溶液和索氏提取器，对MIL-101(Cr)@MIPs模板洗脱，然后用甲醇继续洗脱，得到MIL-101(Cr)@MIPs。
MIL-101(Cr)@MIPs作为柱填料制备成固相萃取小柱，用于粮食样品中ZEN的前处理。
本发明优点及创新点：1.以MIL-101(Cr)为载体材料，甲基丙烯酸作为功能单体，香豆素-3-羧酸为玉米赤霉烯酮毒素的替代模板分子，采用原位聚合的方法合成香豆素-3-羧酸表面印迹聚合物MIL-101(Cr)@MIPs。2、使用替代模板技术以及多孔载体材料合成SMIPs，与SPE技术相结合，应用于粮食中的ZEN前处理，高灵敏度、高精密度、低检出限、低定量限，实际应用显示回收效果好，回收率稳定，能够用于粮食中ZEN的分析与检测，在保证高质量检测结果条件下，大大降低了前处理中的成本。3、MIL-101(Cr)@MIPs的吸附性能良好，对模板分子的最大吸附量为14.12mg g-1，并且可以在2min内达到吸附平衡。可重复使用，并保持回收率在90％以上。应用于玉米、小麦、大米三种样品中玉米赤霉烯酮毒素的前处理，方法的检出限分别为4.16μg kg-1,2.09μg kg-1,3.34μg kg-1；定量限分别为12.5μg kg-1,6.25μg kg-1,10.0μg kg-1；基质效应分别为1.32，1.10，1.37。在50ng g-1，80ng g-1和120ngg-1三个加标水平下，玉米样品中的回收率和相对标准偏差分别为84.8-87.5％，4.59-5.33％；小麦样品中的回收率和相对标准偏差分别为83.4-90.1％，3.95-5.17％；大米样品中的回收率和相对标准偏差分别为81.7-86.6％，4.35-5.56％。
能达到对复杂基质样品中痕量ZEN的快速、灵敏的提取，以及准确的定量。具有更高的传质与吸附能力，可以更快的对ZEN进行吸附，而且成本低廉。相较于IAC每支120元左右的价格，自制小柱的成本不到3元/支。具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明MIL-101(Cr)@MIPs柱的制备示意图；
图2为本发明原理示意图，其中(a)MIL-101(Cr)@MIPs的合成流程图，(b)MIL-101(Cr)@MIPs柱操作流程，(c)目标物识别原理；
图3为扫描电镜图(a：MIPs，b：MIL-101(Cr)，c、d：MIL-101(Cr)@MIPs)，透射电镜图(e，f)，表面元素含量(g：MIL-101(Cr)，h：MIL-101(Cr)@MIPs)；
图4为MIL-101(Cr)与MIL-101(Cr)@MIPs的X射线衍射图；
图5为MIL-101(Cr)与MIL-101(Cr)@MIPs的粒度分布图；a：MIL-101(Cr)，b：MIL-101(Cr)@MIPs)；
图6为MIL-101(Cr)@MIPs和MIL-101(Cr)@NIPs的静态吸附等温线。
图7为MIL-101(Cr)@MIPs静态吸附线性拟合图，a：Langmuir线性模型，b：Freundlich线性模型；
图8为MIL-101(Cr)@MIPs动态吸附曲线，其中，a：0-60min，b：0-5min；
图9为MIL-101(Cr)@MIPs动态吸附伪二级动力学线性拟合线；
图10为MIL-101(Cr)@MIPs柱淋洗液与洗脱液的优化选择柱状图；
图11为MIL-101(Cr)@MIPs柱洗脱溶液用量的选择柱状图；
图12为色谱图对比图，(a)MIL-101(Cr)@MIPs柱处理后色谱图，(b)IAC处理后色谱图；
图13为MIL-101(Cr)@MIPs柱循环使用柱状图；
图14为基质匹配曲线，a：乙腈，b：玉米，c：小麦，d：大米。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明举实施例如下：
实施例1
1.2实验试剂
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)(98％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；九水合硝酸铬(III)(Cr(NO3)9H2O)(99％，AR，上海麦克林生化科技有限公司)；对苯二甲酸(H2BDC)(99％，麦克林)；香豆素-3-羧酸(98％，阿拉丁)；α-甲基丙烯酸(α-Methacrylicacid，α-MAA)(AR，阿拉丁)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene Glycol Dimethacrylate，EDMA)(AR，阿拉丁)；偶氮二异丁腈(AIBN，阿拉丁)；氢氟酸(HF)(天津富宇精细化工有限公司)；甲醇(AR，天津富宇)；乙酸(95％，天津富宇)；甲醇(GR，天津赛孚瑞科技有限公司)；乙腈(GR，天津赛孚瑞)；N-N二甲基甲酰胺(DMF)(AR，国药集团化学试剂有限公司)氟化铵(NH4F)(96％，AR，国药)。
1.2 MIL-101(Cr)@MIPs的制备
(1)MIL-101(Cr)的合成
称取4g(10mmol)Cr(NO3)9H2O和1.64g(9.87mmol)H2BDC于100mL特氟龙反应釜内衬中，并加入48mL去离子水，磁力搅拌10min，加入0.3mL HF，搅拌10min，旋紧不锈钢反应釜外套。使用水热合成法制备，控制温度在40min内，从50℃升至220℃，并保持220℃8h。待冷却至室温，过滤得深绿色产物并分别以乙醇、DMF和30mmol L-1的NH4F水溶液洗去未反应的H2BDC。在真空干燥箱烘干过夜，得浅绿色固体产物。
(2)MIL-101(Cr)@MIPs的合成
于250mL三口圆底烧瓶中，取上述步骤中合成的3g MIL-101(Cr)分散在5mL乙醇于50mL锥形瓶中，加入5mLα-MAA。混合溶液超声10min，并以10mL乙醇冲洗，过滤。加入0.38g(2mmol)香豆素-3-羧酸和120mL乙醇，超声混合10min，加入13mL EDMA，超声10min后，加入0.15g AIBN。88℃下磁力搅拌下6h，过滤并在80℃真空干燥箱中烘干，得浅绿色粉末。
MIL-101(Cr)表面非印记聚合物(MIL-101(Cr)@NIPs)的合成步骤为在上述合成过程中不添加香豆素-3-羧酸模板分子。
(3)模板分子的去除
使用滤纸将烘干后的MIL-101(Cr)@MIPs包成小包，使用乙腈:水(9:1,V/V)混合溶液和索氏提取器，洗脱24h后，使用甲醇继续洗脱，至索氏提取器上部分中的甲醇为中性且不含有模板分子。洗脱过程使用紫外-可见光谱仪对洗脱液中模板分子的含量进行监测。烘干洗脱完全的聚合物，并收集，备用。
MIPs、MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)@MIPs的形貌使用SEM与TEM表征。如图3(a)、(b)，MIPs与MIL-101(Cr)分别为粉末状和表面光滑八面体结构的晶体。如图3(c,d)所示，MIL-101(Cr)经过聚合反应形成的MIL-101(Cr)@MIPs同样具有八面体结构，但是可以看出表面明显蓬松，而且MIL-101(Cr)@SMIPs的TEM图，图3(e,f)中可以看出，在载体MIL-101(Cr)的外围有一层多孔聚合物存在。由此可知，MIL-101(Cr)成功地被MIPs所包裹，而且MIPs的厚度适当，MIL-101(Cr)@SMIPs成功合成。
同时分析了MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)@SMIPs表面元素含量，如图3(g,h)和表1，MIL-101(Cr)表面C、O和Cr元素的质量百分比分别为46.85wt％、14.73wt％、38.42wt％，MIL-101(Cr)@SMIPs为93.22wt％、5.51wt％、1.27wt％。由于MIPs中不含有Cr元素，MIL-101(Cr)中的主要元素Cr的含量在被MIPs包裹后有明显降低。这同样可以印证MIL-101(Cr)的外围被MIPs所包裹。
表1 MIL-101(Cr)与MIL-101(Cr)@MIPs表面元素含量
从图4可以看出MIL-101(Cr)的特征峰与文献中报道的相同。而MIL-101(Cr)@MIPs的特征峰相较于MIL-101(Cr)位置相同但峰的相对强度有所降低，这是由于MIPs的存在所产应的影响。
图5为MIL-101(Cr)与MIL-101(Cr)@MIPs的粒度分布，两者平均粒径分别为1.06μm和2.43μm。由于聚合物层的存在，MIL-101(Cr)@MIPs的粒径稍大于MIL-101(Cr)。
实施例2 MIL-101(Cr)@SMIPs吸附性能实验
2.1香豆素-3-羧酸标准溶液的配制
浓度分别为0.5、1.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10、15、20、30、40、45和50μg mL-1的香豆素-3-羧酸标准溶液，使用甲醇:水(1:9,V/V)配制，待用。
2.2 MIL-101(Cr)@MIPs静态吸附实验
准确称取10mg洗脱完毕并烘干的MIL-101(Cr)@SMIPs于10mL离心管中，分别加入5mL上述香豆素-3-羧酸标准溶液混合。将离心管置于振荡器振荡3h后，上清液过滤并计算香豆素-3-羧酸的浓度。根据公式2.1，计算MIL-101(Cr)@MIPs的吸附量：
Q＝(C0-Ct)*V/m (2.1)
其中，
Q为MIL-101(Cr)@MIPs的吸附量，(mg g-1)；
C0与Ct分别为吸附前和吸附后溶液中香豆素-3-羧酸的浓度，(μg mL-1)；
V为溶液体积，(mL)；
m为MIL-101(Cr)@MIPs的质量，(mg)。
由图6可知，在0.5-30μg mL-1内，随着待测液初始浓度的增加，两材料的吸附量也随之增大，MIL-101(Cr)@MIPs的增速更大，逐渐高于MIL-101(Cr)@NIPs。但初始浓度高于30μg mL-1后，两种材料的吸附量趋于稳定，不再继续增加，分别为14.12mg g-1和7.35mg g-1。在此过程中，吸附材料表面的印迹孔穴逐渐被利用完全。
如图7所示，Langmuir和Freundlich拟合模型线性良好。由表2可知，二者线性方程参数。通过比较二者R2，Langmuir线性方程R2更高，说明Langmuir吸附模型更加符合MIL-101(Cr)@MIPs的吸附过程，即说明其吸附过程属于单分子层吸附。这是由于在MIL-101(Cr)@MIPs的识别位点和吸附孔穴是分布在吸附材料的表面进而对溶液中的香豆素-3-羧酸进行快速吸附。
表2 Langmuir与Freundlich线性模型参数
2.3 MIL-101(Cr)@MIPs动态吸附实验
准确称取10mg洗脱完毕并烘干的MIL-101(Cr)@SMIPs于10mL离心管中，并加入5mL30μg mL-1的香豆素-3-羧酸溶液，使用振荡器分别振荡0.33、0.50、0.83、1.0、2.0、3.0、5.0、15、30、40、50和60min后，上清液过滤并计算香豆素-3-羧酸浓度。根据公式2.1，计算不同吸附时间后MIL-101(Cr)@SMIPs的吸附量。
图8所示为MIL-101(Cr)@SMIPs的动态吸附曲线。前2min内，MIL-101(Cr)@SMIPs的吸附量与吸附时间成正比。在2-60min内，吸附剂的吸附量基本稳定在12.75mg g-1，不再继续增长。由此可知，2min内MIL-101(Cr)@MIPs即可达到吸附平衡，相较于传统MIPs 7h或更长的吸附平衡时间有了显著的缩短。MIL-101(Cr)@MIPs不同于传统的MIPs，其载体的表面包裹的印迹聚合物层，这些识别位点和印迹孔穴也分布在吸附剂的表面，可以更加快速接触溶液中的目标物，这也为MIL-101(Cr)@MIPs更高的传质速率提供了可能。
观察图9和表3中R2、k2等数据，可知拟合曲线线性良好，说明MIL-101(Cr)@MIPs的吸附过程属于伪二级动力学的吸附。说明MIL-101(Cr)@MIPs的吸附过程属于一种化学吸附，即吸附速率受识别位点和印迹孔穴与目标物质之间作用的影响，这也进一步印证了MIL-101(Cr)@MIPs在吸附过程中利用了分子印迹技术的选择与识别能力。
表3伪二级动力学线性模型参数
2.4 MIL-101(Cr)@SMIPs选择性实验
含有20ng mL-1ZEN、AFB1和溴氰菊酯的混合溶液使用甲醇:水(1:9,V/V)配制，待用。分别准确称取MIL-101(Cr)@MIPs和MIL-101(Cr)@NIPs于10mL离心管中，加入5mL混合溶液。振荡3h后，过滤并计算滤液中三种物质的浓度。根据公式2.1，计算两种材料对三种物质的吸附量，并根据两种材料的吸附量和公式2.2，计算MIL-101(Cr)@MIPs的印迹因子(Imprinted Factor,IF)：
IF＝QMIL-101@MIPs/QMIL-101@NIPs (2.2)
其中，
QMIL-101@SMIPs和QMIL-101@NIPs分别为MIL-101(Cr)@MIPs和MIL-101(Cr)@NIPs的吸附量，mg g-1。
通过对MIL-101(Cr)@MIPs吸附量的测定和IF的计算，如表4所示，ZEN、AFB1以及溴氰菊酯的IF值分别为4.98、3.27和1.23。MIL-101(Cr)@MIPs对ZEN的吸附量远大于MIL-101(Cr)@NIPs的，表明MIL-101(Cr)@MIPs对ZEN具有高的识别能力。
MIL-101(Cr)@MIPs对ZEN的吸附量高于AFB1，明显高于溴氰菊酯，而MIL-101(Cr)@NIPs对三种物质的吸附量则相差不大。这是由于负责识别与吸附的MIPs层中的识别位点和印迹孔穴与溴氰菊酯不匹配。
表4 MIL-101(Cr)@MIPs选择能力与印迹因子
实施例3实际样品中的应用
3.1实际样品预处理
实验中玉米、大米、小米、燕麦和小麦样品，均购买自当地超市(河南，郑州)，粉碎。称取40g过40目筛后的样品以及4g NaCl和100mL提取液(乙腈:水(9:1,V/V))并混合于250mL锥形瓶中混合。使用机械振荡器振荡60min后，过滤并收集滤液。移取20mL滤液并以蒸馏水稀释4倍，过滤混合溶液至澄清，并收集滤液，待用。
3.2 MIL-101(Cr)@MIPs柱的制备
如图1所示，称取100mg洗脱完毕并烘干的MIL-101(Cr)@MIPs，转移至具有下筛板的SPE小柱中，滴加5mL色谱甲醇浸湿MIL-101(Cr)@MIPs，使用毛细玻璃管搅拌除去吸附剂中的气泡，之后在上方覆盖筛板封装。加入10mL实际样品预处理提取液，控制流出液为1ds-1。分别用10mL去离子水淋洗，2.5mL(5×0.5mL)乙腈:水(9:1,V/V)的洗脱。收集洗脱液，氮吹近干。使用1mL HPLC流动相比例溶液溶解，过滤，待测。
在SPE操作过程中，其淋洗溶液、洗脱溶液以及洗脱溶液体积等因素都可能会对目标物质的回收率等产生影响，所以为了MIL-101(Cr)@MIPs柱应用过程中具有更高、更稳定的回收率，更灵敏与精确的结果。使用单因素优化实验对SPE的步骤进行了优化。
3.21淋洗与洗脱溶液的选择
不同比例的甲醇:水与乙腈:水作为淋洗、洗脱溶液的流出液经过检测定量与计算，回收率如图11所示。通过观察比较，当溶液中甲醇或乙腈的比例较低时，流出液中ZEN的回收率很低，几乎趋近于0。然而当乙腈与水体积比在9:1时，溶液中ZEN的回收率最高。为了尽量减少有机溶剂的使用，本实验确定了去离子水与乙腈:水(9:1,V/V)分别为SPE步骤中的淋洗溶液和洗脱溶液。
3.2.2洗脱溶液用量的选择
检测定量并计算不同体积下ZEN的回收率，如图11所示，随体积的增加，洗脱液中ZEN的回收率也在逐渐增加，当洗脱溶液体积为2.5mL或更多时，ZNE回收率趋于100％。由此可知2.5mL的乙腈:水(9:1,V/V)可以将MIL-101(Cr)@MIPs柱中的ZEN洗脱完全。所以为了得到更高的精密度，以及更少有机溶剂的使用，使用2.5mL乙腈:水(9:1,V/V)对MIL-101(Cr)@MIPs柱中的ZEN目标物进行洗脱，并氮吹近干，使用1mL流动相比例混合溶液溶解。
3.3 MIL-101(Cr)@MIPs柱性能评价
3.31 MIL-101(Cr)@MIPs柱与IAC性能的对比
为了评估MIL-101(Cr)@MIPs柱对实际样品中ZEN的分离与富集性能，分别使用MIL-101(Cr)@MIPs柱和IAC对制备的加标玉米样品的提取液进行处理。MIL-101(Cr)@MIPs柱和IAC进过上样、淋洗、洗脱等步骤，收集并过滤后的洗脱液使用HPLC-FLD检测，结果如图12。对比二者的液相色谱图，保留时间在前5min内IAC相较于MIL-101(Cr)@MIPs柱的杂质峰个数更少、强度更低。但在7.5min左右的ZEN目标峰，两色谱图中峰高度相近，IAC中的目标峰高度相较于MIL-101(Cr)@MIPs柱的更高，且附近杂质峰更少。可知IAC对样品中杂质的净化效果以及ZEN的分离与富集效果更加优异，但是相较于IAC，MIL-101(Cr)@MIPs柱的对样品基质的净化效果稍弱，但是对ZEN的分离与富集能力仍然有良好的表现，而且MIL-101(Cr)@MIPs柱可以循环再生使用，操作和保存相较于IAC也更加容易。所以综合来看，MIL-101(Cr)@MIPs柱可以代替IAC应用于实际样品中对ZEN前处理步骤中。
3.3.2基质效应
基质效应(Matrix Effects,ME)通过基质匹配曲线和校准曲线二者斜率之比所得。基质匹配曲线和校准曲线(如图14)分别由一系列浓度ZEN与空白样品提取液和有机溶剂乙腈配制而成。表5所列为三种实际样品的基质匹配曲线的线性方程和斜率，经过计算可知三种实际样品的基质效应的范围为1.10-1.36。由此可知，使用MIL-101(Cr)@MIPs作为MIL-101(Cr)@MIPs柱的吸附材料对实际样品中的ZEN进行分离和富集的效果良好。
表5基质匹配曲线
通过对三种实际样品的测定，可以确定在玉米、小麦和大米中方法的线性范围分别为12.50-250μg kg-1、6.25-250μg kg-1、10.00-250μg kg-1。在线性范围较宽，可以对实际样品中的ZEN含量进行定量。
通过基质匹配曲线计算了该方法在三种样品中的LODs和LOQs分别为信噪比的3倍和10倍。如表6所示，该方法在不同样品中的LODs和LOQs分别为2.09-4.16μg kg-1和6.25-12.50μg kg-1。方法具有较低的检出限和定量限，可以达到对样品中的痕量ZEN进行检测的效果，且具有较高的灵敏度。
3.3.3准确度与精密度
日内与日间的检测实验用于评估方法的准确度与精密度。日内检测实验中分别对三种加标实际样品在一天时间内连续检测六次，日间检测实验则是对其进行连续六天的检测。通过检测每次实验中ZEN的回收率计算回收率的相对标准偏差(RSDs)，结果如表5所示。经过计算，方法在三种样品中的日内实验RSDs为5.17-5.56％，日间实验中RSDs为7.26-7.58％。两种实验方法回收率计算得到的RSDs值均小于8％，可以看出方法在日内和日间的实验中均能保持较好的稳定性，而且相较于日间检测日内检测的检测结果更加稳定。
为了评估方法准确度和精密度，对三种实际样品(玉米、小麦、大米)进行了加标回收实验。三种样品进行了50、80和120ng g-1的加标处理并制备提取液，使用提取液上样后，对MIL-101(Cr)@MIPs柱洗脱液进行检测并计算回收率。如表6所示，在50、80和120ng g-1加标水平下，玉米样品的回收率分别为87.5％、84.8％、85.7％，小麦样品分别为88.4％、90.1％、83.4％，大米样品分别为86.6％、82.9％、81.7％，且三种样品回收率稳定，具有较低的RSDs，在玉米样品中RSDs分别为5.33％、4.59％、4.97％，小麦样品中分别为5.17％、4.84％、3.95％，大米样品中分别为5.56％、4.62％、4.35％，均小于国标中规定的15％。由此可知方法具有较高的稳定性和准确度，说明所开发的前处理方法能够应用于实际样品中ZEN的前处理中。
表6加标回收率(n＝6)
3.4实际样品中ZEN的检测
将MIL-101(Cr)@MIPs柱应用于对本地市场购买的实际样品中的前处理与检测中。检测结果如表7所示，在燕麦、大麦和小米中均没有ZEN的检出。在两个超市所购买的玉米、大米和小麦样品中能够检出ZEN对其具有不同程度的污染，但是样品中ZEN的含量并没有超出我国国标中的限量。
表7实际样品中的定量(n＝6)
nd：未检出(含量低于检出限)
X：不确定度
实施例4 MIL-101(Cr)@MIPs柱再生性能的测定
MIL-101(Cr)@MIPs柱经甲醇活化和水洗后，上样10mL ZEN溶液(10ng mL-1)，加入10mL水淋洗，2.5mL乙腈:水(9:1,V/V)洗脱，收集洗脱液，编号1。然后向MIL-101(Cr)@MIPs柱加入20mL甲醇，完全洗脱柱内残留物质并活化柱内吸附剂活性位点，加入10mL去离子水，洗去柱内残留甲醇。此过程即为MIL-101(Cr)@MIPs柱的使用-再生过程。重复上述循环步骤10次，收集每次洗脱液并编号，待测。
如图13所示，MIL-101(Cr)@MIPs柱在前5次的循环中ZEN的回收率几乎可以稳定在90％左右。在接下来的两次循环中，ZEN的回收率有所下降，但仍然高于85％。七次循环后，ZEN回收率降低至70％左右，这可能是活性识别位点在多次的循环使用过程中有一定程度的破坏。从MIL-101(Cr)@MIPs柱多次的循环再生使用实验结果可以得知，MIL-101(Cr)@MIPs柱具有令人满意的循环再生能力，并且可以使用5次以上。
Claims (2)
1.一种玉米赤霉烯酮表面印迹聚合物，其特征在于，通过如下方法制备而成，
（1）合成MIL-101(Cr)
将Cr(NO3) 9H2O和对苯二甲酸（H2BDC）投入反应釜中，加入去离子水，磁力搅拌，加入HF，搅拌，旋紧不锈钢反应釜外套，采用水热合成法制备，控制烘箱温度由50 ℃升至220℃，保持220 ℃反应；反应结束后，冷却至室温，过滤得MIL-101(Cr)；
（2）合成MIL-101(Cr)@MIPs模板
将MIL-101(Cr)分散在乙醇中，加入α-甲基丙烯酸混合超声，反应结束后冲洗，过滤；然后加入香豆素-3-羧酸和乙醇，超声混合，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），超声，加入偶氮二异丁腈（AIBN），加热磁力搅拌下反应，经过滤，烘干，得MIL-101(Cr)@MIPs模板；
（3）模板分子的去除
使用乙腈、水混合溶液和索氏提取器对MIL-101(Cr)@MIPs模板洗脱，然后用甲醇继续洗脱，得到MIL-101(Cr)@MIPs。
2.如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮表面印迹聚合物，其特征在于，步骤（3）所述乙腈与水体积比为9:1，混合溶液用量2.5 mL。
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