CN115957219B

CN115957219B - M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用

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Publication number: CN115957219B
Application number: CN202211683999.5A
Authority: CN
Inventors: 罗建沅; 别俊涛; 李日东; 李雨桐; 李婷婷; 刘小云
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2042-12-27
Also published as: CN115957219A

Abstract

本发明提供了M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用，属于医药技术领域。本发明提供了M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用，所述M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂使M2亚型丙酮酸激酶处在非聚集状态。本发明首次提出M2亚型丙酮酸激酶凝聚体可以作为抗衰老药物的靶点，使该凝聚体解聚的化合物具有较好的抗衰老效果，将其用于制备抗衰老药物，在解决目前抗衰老靶点和药物缺乏现状中具有较好的应用前景。

Description

M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用。

背景技术

衰老一直都是生命科学研究的热门领域。衰老会伴随着身体机能的逐渐丧失，各个器官功能出现异常，容易患上癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病等。关于衰老的出现，目前已有超过上百种的理论。衰老通常具有以下九大特征：基因组不稳定、端粒缩短、表观遗传的改变、蛋白稳态失衡、营养感知异常、线粒体功能异常、细胞衰老、干细胞耗竭以及细胞间通讯改变(López-OtínC,BlascoMA,PartridgeL,SerranoM,KroemerG.Thehallmarksofaging.Cell.2013Jun6；153(6):1194-217.)。已有众多文献报道，蛋白质稳态会随着衰老进程而逐渐失衡。蛋白质稳态主要通过伴侣蛋白介导的蛋白折叠系统和溶酶体或者蛋白酶体介导的降解系统的协调运作来维持。任何一个系统出现问题都有可能会导致蛋白稳态失衡，进而导致细胞中某些蛋白质聚集，从而导致一些衰老相关的疾病。尽管蛋白质聚集已被认为是衰老的一个常见特征，然而何种蛋白的聚集会加剧衰老发生以及抑制这些蛋白聚集是否能延缓衰老却基本没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用，本发明中M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂具有较好的抗衰老效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用，所述M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂使M2亚型丙酮酸激酶处在非聚集状态。

优选地，所述M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂为氨基二硫代甲酸酯类化合物或其药学上可接受的盐，所述氨基二硫代甲酸酯类化合物具有式I所示结构：

所述式I中，R选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的杂芳基、噻吩基、萘基或乙烯基；所述杂芳基选自喹啉基或氮杂吲哚基；所述取代的苯基和取代的杂芳基中一个或多个取代基独立地选自氟、甲氧基或亚乙二氧基。

优选地，所述氨基二硫代甲酸酯类化合物为以下化合物中的任一种：

优选地，所述衰老包括细胞衰老或动物衰老。

优选地，所述细胞衰老包括复制性衰老或依托泊苷诱导的衰老。

优选地，所述动物衰老包括自然衰老或阿霉素诱导的早衰。

优选地，所述药物包括M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂以及药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物中M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂的含量为0.5～99wt％。

优选地，所述药学上可接受的辅料包括崩解剂、填充剂、助悬剂、絮凝剂和润滑剂中的一种或几种。

优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、丸剂、针剂、缓释制剂或控释制剂。

本发明提供了一种M2亚型丙酮酸激酶(PKM2)凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用，所述PKM2凝聚体的解聚剂使PKM2处在非聚集状态。本发明首次提出PKM2凝聚体可以作为抗衰老药物的靶点，使该凝聚体解聚的化合物(即PKM2凝聚体的解聚剂)具有较好的抗衰老效果，将其用于制备抗衰老药物，在解决目前抗衰老靶点和药物缺乏现状中具有较好的应用前景。

附图说明

图1为在HeLa细胞中过表达了sfcherry-PKM2后使用依托泊苷(ETO)诱导PKM2凝聚体生成，给予13种化合物处理后含有PKM2凝聚体的HeLa细胞占比统计图

图2为图1中K35和K27对应的图；

图3为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后的生存曲线；

图4为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后的抓力对比图；

图5为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后转棒时间对比图；

图6为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后血清中谷丙转氨酶(左)和谷草转氨酶(右)含量对比图；

图7为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝并制成切片后染SA-β-gal结果图；

图8为图7的统计图；

图9为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝脏并液氮研磨后用蛋白免疫印迹法测试结果图；

图10为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肺并液氮研磨后用蛋白免疫印迹法测试结果图；

图11为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝脏并液氮研磨后用荧光定量PCR检测p21和p16的mRNA水平结果图；

图12为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝脏并液氮研磨后用荧光定量PCR检测衰老相关分泌表型(SASP)基因的mRNA水平结果图；

图13为给予水、K35或K27四个月后的自然衰老的小鼠(22月龄)抓力大小对比图；

图14为给予水、K35或K27四个月后的自然衰老的小鼠(22月龄)转棒时间对比图；

图15为在MCF-7细胞中使用依托泊苷(ETO)诱导细胞衰老后再给予K35或K27处理后用蛋白免疫印迹法检测细胞中p21蛋白量的结果图；

图16为不同代数的人胚肺细胞2BS在K35或K27处理后用蛋白免疫印迹法检测细胞中p21和p16蛋白量的结果图；

图17为年轻和复制性衰老的人胚肺细胞2BS在K35或K27处理后用蛋白免疫印迹法检测细胞中p21、p16以及衰老相关分泌表型(SASP)基因mRNA水平的结果图；

图18为复制性衰老的人胚肺细胞在给予一段时间的K35或K27处理后染SA-β-gal结果图；

图19为图18的统计图；

图20为HeLa细胞中用依托泊苷诱导细胞衰老再给予K35或K27处理后检测反映细胞增殖情况的EdU的结果图；

图21为图20的统计图。

具体实施方式

丙酮酸激酶是糖酵解中三个限速酶之一，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。哺乳动物细胞中存在四种亚型，这四种亚型由PKM和PKLR这两个基因编码。PKLR编码得到PKR或PKL，而PKM通过选择性剪接得到PKM1或PKM2。PKL是肝、肾以及红细胞中的主要亚型，PKR主要在红细胞中表达，PKM1主要分布在骨骼肌、心肌和脑组织中，而PKM2分布在癌细胞和正常组织中，比如脑和肝脏。PKM1通常以四聚体的形式存在，酶活性较高，而PKM2通过以二聚体的形式存在，酶活性较低。在接受了一些细胞内外的信号后，PKM2会迅速形成酶活性较高的四聚体。

目前针对PKM2的研究还主要集中在癌症领域，而关于PKM2在正常组织中的生理功能，比如细胞衰老却鲜有报道。并且在为数不多的报道中，PKM2有被报道为具有促进衰老作用的，也有被报道为具有抑制衰老作用的，其中的矛盾需要重新审视PKM2在衰老发生发展过程中的作用。

本发明研究显示PKM2在衰老细胞中的聚集变多，PKM2凝聚体的增加会导致PKM2酶活性下降，进而导致衰老发生。也就是说，PKM2所处的形式是调节衰老的关键，而不单纯通过蛋白量等调节衰老。因此采用PKM2凝聚体(直径可达到3μm左右)的解聚剂可以抑制PKM2的聚集，使PKM2处在非聚集状态，在此基础上能够恢复其酶活性以及糖酵解功能，从而实现改善衰老的效果。

在本发明中，所述M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂优选为氨基二硫代甲酸酯类化合物或其药学上可接受的盐，所述氨基二硫代甲酸酯类化合物具有式I所示结构：

在本发明中，所述氨基二硫代甲酸酯类化合物优选为以下任一种化合物：

本发明对以上各化合物的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法制备得到即可，具体可以采用本发明制备例中的方法制备得到。

在本发明中，所述衰老优选包括细胞衰老或动物衰老；所述动物优选包括小鼠。在本发明中，所述细胞衰老优选包括复制性衰老或依托泊苷诱导的衰老；所述动物衰老优选包括自然衰老或阿霉素诱导的早衰。如本发明实施例结果显示，本发明中PKM2凝聚体的解聚剂可以使PKM2凝聚体解聚，从而延缓细胞衰老以及小鼠的衰老表型，具体的，所述PKM2凝聚体的解聚剂可以改善依托泊苷诱导的细胞衰老表型以及复制性衰老细胞的衰老；还可以改善阿霉素诱导的小鼠的衰老表型，如延长阿霉素诱导的早衰小鼠的寿命、提高阿霉素诱导的早衰小鼠的运动能力、恢复阿霉素诱导的早衰小鼠中升高的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平、下调阿霉素诱导的早衰小鼠器官中升高的衰老指标，也可以改善自然衰老小鼠的身体机能，提高自然衰老小鼠的运动能力。

在本发明中，所述药物优选包括M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂以及药学上可接受的辅料。在本发明中，所述药物中M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂的含量优选为0.5～99wt％，更优选为2～90wt％，进一步优选为10～80wt％，更进一步优选为30～70wt％。在本发明中，所述药学上可接受的辅料优选包括崩解剂、填充剂、助悬剂、絮凝剂和润滑剂中的一种或几种。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、胶囊、丸剂、针剂、缓释制剂或控释制剂。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

制备例1

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(苯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，反应式如下所示：

将哌嗪-1-羧酸叔丁酯(4.66g，25mmol)溶于在四氢呋喃(40mL)中，加入三乙胺(6.9mL，50mmol)，缓慢添加4-硝基苯甲酰氯(4.64g，25mmol)，将所得反应混合物在室温下搅拌12小时。反应完毕，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取混合物，合并有机相，用饱和食盐水(30mL×2)洗涤合并的有机相，洗涤后的有机相用无水Na₂SO₄干燥，并在真空下浓缩，得到粗产物。通过柱层析(洗脱液：石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1)纯化粗产物，得到化合物1(7.70g，产率：93％)，为淡黄色固体。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.31–8.28(m,2H),7.72–7.69(m,1H),3.63(s,1H),3.45(s,1H),3.33(s,1H),3.27(s,1H),1.41(s,9H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ167.26,153.77,147.81,142.03,128.32,123.74,79.22,46.65,41.39,27.97。

将化合物1(1.68g，5mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，缓慢添加浓度为4mol/L的HCl的二氧六环溶液(5mL，20mmol)，将所得反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完毕后滤出形成的固体，并在真空下干燥以得到化合物2，其直接使用而无需进一步纯化。

将化合物2(1.09g，4mmol)溶于DMF(20mL)中，加入Et₃N(2.8mL，20mmol)，将所得混合物搅拌5分钟后加入CS₂(0.46g，6mmol)，继续搅拌30分钟，加入3-(氯甲基)吡啶盐酸盐(0.66g，4mmol)，并在室温下搅拌反应4小时。反应完毕，加入水(50mL)，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取混合物，合并有机相，用饱和食盐水(30mL×2)洗涤合并的有机相，用无水Na₂SO₄干燥并浓缩洗涤后的有机相，剩余物通过柱层析(洗脱液：石油醚与乙酸乙酯体积比为3:1)纯化，得到化合物3(1.45g，产率：90％)，为灰白色固体。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.63(s,1H),8.47(d,J＝4.0Hz,1H),8.32–8.29(m,2H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.75–7.73(m,2H),7.35(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),4.61(s,2H),4.39–3.97(m,4H),3.78(s,2H),3.47(s,2H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.80,167.38,150.07,148.38,147.93,141.68,136.68,132.65,128.49,123.74,123.47,45.80,41.11,37.44。

将化合物3(1.21g，3mmol)加入H₂O(8mL)和EtOH(24mL)的混合溶液中，加Fe粉(0.84g，15mmol)和NH₄Cl(0.23g，4.2mmol)，将所得反应混合物加热回流2小时。反应完毕后将反应液趁热过滤，并在真空下浓缩滤液，得到粗产物，所述粗产物通过柱层析(洗脱液：石油醚与乙酸乙酯体积比为1:1)纯化，得到化合物4(1.06g，产率：94％)，为灰白色固体。

将化合物4(0.19g，0.5mmol)溶于THF(10mL)和DMF(5mL)的混合溶液中，加入吡啶(0.16mL，2mmol)，缓慢添加苯磺酰氯(0.5mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌反应12小时。反应完毕后加入水(50mL)，并用乙酸乙酯(10mL×3)萃取混合物，合并有机相，依次用浓度为1mol/L的盐酸(30mL×2)以及饱和食盐水(30mL×2)洗涤，洗涤后的有机相用无水Na₂SO₄干燥，并在真空下浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过柱层析纯化得到化合物K29，收率为74％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.64(s,1H),8.61(s,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.82–7.79(m,3H),7.62–7.55(m,3H),7.35(d,J＝7.2Hz,3H),7.16(s,2H),4.60(s,2H),4.27(s,2H),3.97(s,2H),3.57(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.65,168.72,150.03,148.34,139.44,139.24,136.73,133.10,132.68,130.26,129.37,128.67,126.61,123.46,118.68,50.98,49.83,37.40.HRMSm/z:calcdforC₂₄H₂₅N₄O₃S₃[M+H]⁺:513.1089；found:513.1086。

制备例2

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(2-甲氧基苯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用2-甲氧基苯磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为62％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.36(s,1H),8.60(d,J＝2.0Hz,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.84–7.78(m,2H),7.60–7.55(m,1H),7.36–7.29(m,3H),7.18–7.13(m,3H),7.06(t,J＝7.6Hz,1H),4.59(s,2H),4.26(s,2H),3.96(s,2H),3.86(s,3H),3.56(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.64,168.79,156.40,150.07,148.38,139.57,136.68,135.23,132.65,130.25,129.68,128.50,126.32,123.45,120.13,118.06,112.98,56.12,50.58,49.12,37.41.HRMSm/z:calcdforC₂₅H₂₇N₄O₄S₃[M+H]⁺:543.1194；found:543.1185。

制备例3

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(3-甲氧基苯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用3-甲氧基苯磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为70％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.60(d,J＝2.8Hz,1H),8.61(s,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.2Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.48(t,J＝8.0Hz,1H),7.37–7.29(m,5H),7.20–7.16(m,3H),4.60(s,2H),4.27(s,2H),3.95(s,2H),3.77(s,3H),3.59(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.67,168.72,159.37,150.06,148.37,140.62,139.21,136.70,132.66,130.60,130.40,128.67,123.45,118.88,118.80,118.68,111.69,55.58,50.69,49.20,37.41.HRMSm/z:calcdforC₂₅H₂₇N₄O₄S₃[M+H]⁺:543.1194；found:543.1191。

制备例4

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(4-甲氧基苯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用4-甲氧基苯磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为66％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.48(s,1H),8.60(d,J＝2.0Hz,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.81–7.72(m,3H),7.36–7.33(m,3H),7.14(d,J＝8.8Hz,2H),7.07(d,J＝8.8Hz,2H),4.60(s,2H),4.27(s,2H),3.97(s,2H),3.79(s,3H),3.58(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.66,168.78,162.56,150.08,148.38,139.50,136.69,132.66,131.01,130.02,128.90,128.66,123.45,118.45,114.49,55.63,50.79,49.44,37.42.HRMSm/z:calcdforC₂₅H₂₇N₄O₄S₃[M+H]⁺:543.1194；found:543.1191。

制备例5

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(2-氟苯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用2-氟苯磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为60％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.97(s,1H),8.60(d,J＝2.0Hz,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.92–7.88(m,1H),7.81–7.78(m,1H),7.74–7.68(m,1H),7.46–7.33(m,5H),7.15(d,J＝8.4Hz,1H),4.59(s,2H),4.26(s,2H),3.96(s,2H),3.57(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.66,168.67,158.13(d,J＝253.0Hz),150.07,148.37,138.75,136.67,136.13(d,J＝9.0Hz),132.64,130.40,130.31,128.68,126.97(d,J＝14.0Hz),125.06(d,J＝2.0Hz),123.43,118.27,117.37(d,J＝20.0Hz),50.85,49.24,37.41.HRMSm/z:calcdforC₂₄H₂₄FN₄O₃S₃[M+H]⁺:531.0995；found:531.0991。

制备例6

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(3-氟苯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用3-氟苯磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为67％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.73(s,1H),8.61(s,1H),8.46(d,J＝4.8Hz,1H),7.80(d,J＝7.2Hz,1H),7.65–7.62(m,3H),7.51(d,J＝4.4Hz,1H),7.39–7.33(m,3H),7.18(d,J＝3.2Hz,2H),4.60(s,2H),4.28(s,2H),3.97(s,2H),3.59(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.68,168.68,161.66(d,J＝247.0Hz),150.08,148.38,141.41(d,J＝6.0Hz),138.82,136.70,132.66,131.82,130.70,128.74,123.45,122.95(d,J＝3.0Hz),120.38(d,J＝21.0Hz),119.12,113.69(d,J＝24.0Hz),50.68,49.20,37.43.HRMSm/z:calcdforC₂₄H₂₄FN₄O₃S₃[M+H]⁺:531.0995；found:531.0989。

制备例7

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(4-氟苯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用4-氟苯磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为64％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.63(s,1H),8.60(d,J＝1.6Hz,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.86(dd,J＝8.8,5.2Hz,2H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(t,J＝8.8Hz,2H),7.37–7.33(m,3H),7.15(d,J＝8.0Hz,2H),4.60(s,2H),4.27(s,2H),3.97(s,2H),3.58(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.66,168.68,163.14,150.06,148.37,139.02,136.69,135.74,132.66,130.51,129.72(d,J＝10.0Hz),128.69,123.45,118.93,116.61(d,J＝22.0Hz),50.56,49.48,37.40(s).HRMSm/z:calcdforC₂₄H₂₄FN₄O₃S₃[M+H]⁺:531.0995；found:531.0992。

制备例8

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(萘-1-磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用萘-1-磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为71％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.04(s,1H),8.71(d,J＝8.4Hz,1H),8.59(d,J＝2.0Hz,1H),8.45(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),8.29(dd,J＝7.4,1.0Hz,1H),8.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.08(d,J＝7.6Hz,1H),7.80–7.73(m,2H),7.69–7.63(m,2H),7.33(dd,J＝7.8,4.2Hz,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.08(d,J＝8.8Hz,2H),4.58(s,2H),4.22(s,2H),3.92(s,2H),3.51(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.75,168.88,150.06,148.37,139.13,136.67,134.63,134.21,133.77,132.64,129.94,129.76,129.15,128.65,128.23,127.34,127.03,124.51,124.10,123.44,117.65,50.23,49.49,37.38.HRMSm/z:calcdforC₂₈H₂₇N₄O₃S₃[M+H]⁺:563.1245；found:563.1240。

制备例9

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(噻吩-2-磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-碳二硫酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用噻吩-2-磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为65％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.75(s,1H),8.61(d,J＝2.0Hz,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.92(d,J＝4.8Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.62(dd,J＝2.6,1.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.34(dd,J＝7.8,5.0Hz,1H),7.21(d,J＝8.0Hz,2H),7.13(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),4.60(s,2H),4.28(s,2H),3.98(s,2H),3.60(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.66,168.72,150.06,148.37,139.82,138.96,136.71,134.32,133.63,132.68,130.63,128.65,127.70,123.46,119.02,50.51,49.07,37.41.HRMSm/z:calcdforC₂₂H₂₃N₄O₃S₄[M+H]⁺:519.0653；found:519.0642。

制备例10

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁烷-6-磺酰胺)苯甲酰基)哌嗪-1-碳二硫酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用2,3-二氢-1,4-苯并二氧-6-磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为63％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.71(s,1H),8.61(s,1H),8.46(d,J＝4.0Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.36–7.28(m,5H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),4.60(s,2H),4.28(dd,J＝8.6,4.6Hz,6H),3.98(s,2H),3.59(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.65,168.80,150.05,148.36,147.29,143.26,139.52,136.70,132.68,131.85,130.02,128.60,123.47,120.33,118.50,117.61,115.65,64.33,64.02,50.82,49.43,37.40.HRMSm/z:calcdforC₂₆H₂₇N₄O₅S₃[M+H]⁺:571.1144；found:571.1130。

制备例11

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(喹啉-8-磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用喹啉-8-磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为58％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.49(s,1H),9.13(dd,J＝4.4,1.6Hz,1H),8.59(d,J＝2.0Hz,1H),8.51(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),8.46–8.43(m,2H),8.29(d,J＝7.6Hz,1H),7.80–7.70(m,3H),7.33(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(d,J＝8.4Hz,2H),4.58(s,2H),4.22(s,2H),3.92(s,2H),3.51(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.63,168.72,151.47,150.06,148.36,142.70,139.47,136.97,136.65,135.17,134.41,132.63,132.23,129.76,128.40,125.62,123.42,122.63,118.33,50.62,49.08,37.42.HRMSm/z:calcdforC₂₇H₂₆N₅O₃S₃[M+H]⁺:564.1198；found:564.1185。

制备例12

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-碳二硫代酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为57％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.65(s,1H),10.55(s,1H),8.60(d,J＝2.0Hz,1H),8.45(dd,J＝4.6,1.4Hz,1H),8.34(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),8.21(s,1H),8.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.35–7.24(m,4H),7.17–7.15(m,2H),4.59(s,2H),4.24(s,2H),3.94(s,2H),3.56(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.63,168.79,150.06,148.37,147.96,144.67,139.69,136.69,132.66,131.80,129.56,128.55,127.47,123.45,117.88,117.61,115.48,111.84,50.52,49.99,37.39.HRMSm/z:calcdforC₂₅H₂₅N₆O₃S₃[M+H]⁺:553.1150；found:553.1146。

制备例13

制备吡啶-3-基甲基-4-(4-(乙烯基磺酰胺基)苯甲酰基)哌嗪-1-二硫代甲酸酯，结构式如下所示：

参照制备例1的方法制备，不同之处仅在于，采用乙烯基磺酰氯代替苯磺酰氯，收率为42％。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.35(s,1H),8.61(d,J＝2.0Hz,1H),8.46(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),7.18(d,J＝8.8Hz,2H),6.87–6.81(m,1H),6.18(d,J＝16.4Hz,1H),6.07(d,J＝10.0Hz,1H),4.60(s,2H),4.29(s,2H),3.99(s,2H),3.63(s,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ194.69,168.89,150.09,148.40,139.61,136.71,136.26,132.68,129.86,128.70,127.96,123.47,118.34,50.79,49.15,37.45.HRMSm/z:calcdforC₂₀H₂₃N₄O₃S₃[M+H]⁺:463.0932；found:463.0929。

以下实施例中所用实验材料以及试剂来源如下：

实验动物：本实施例使用雄性C57BL/6J小鼠(8周龄)来构建阿霉素诱导早衰的模型，小鼠购买自北京大学医学部动物部，体重为22g左右。使用的自然衰老小鼠为18月龄的C57BL/6J小鼠，购买自南京艾菱菲公司，体重为35g左右。小鼠在合适的温度和湿度下饲养，每日交替光照和黑暗各12小时。

试剂：阿霉素购买自MCE公司，细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天公司，EdU增殖试剂盒购买自碧云天公司。

实施例1

利用依托泊苷诱导的细胞衰老表型筛选针对PKM2凝聚体解聚效果较好的化合物，具体步骤如下：

在稳定表达sfcherry-PKM2的HeLa细胞中为用2μM的依托泊苷(ETO)诱导PKM2凝聚体生成，再用制备例1～制备例13中制备的13种化合物一起处理细胞48小时后，用荧光显微镜观察并拍照，然后统计有PKM2凝聚体的细胞占视野里所有细胞的比例，每种化合物统计6个视野。

图1为在HeLa细胞中过表达了sfcherry-PKM2后使用依托泊苷(ETO)诱导PKM2凝聚体生成，给予13种化合物处理后含有PKM2凝聚体的HeLa细胞占比统计图；具体数据表1所示。图2为图1中K35和K27对应的图(标尺为5μm)。结果显示，13种化合物均能够减少细胞中依托泊苷诱导的PKM2凝聚体的生成，其中K35和K27对PKM2凝聚体的解聚效果最好。

表1含有PKM2凝聚体的细胞占所有细胞的比例(％)

实施例2

本实施例研究了K35和K27对阿霉素诱导的早衰小鼠生存率的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次，并记录小鼠的死亡情况。

图3为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后的生存曲线，结果显示，给食K35及K27可以显著延长阿霉素诱导的早衰小鼠的生存时间。

实施例3

本实施例研究了K35和K27对阿霉素诱导的早衰小鼠抓力的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，每组12只，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次，在第十天时使用抓力仪测试小鼠的抓力大小，具体是将小鼠的两只前爪放在仪器上，用手抓住小鼠的尾巴往后拉，直到小鼠松开前肢，读取机器上记录的最大抓力值；每只小鼠测试10次，取平均值。

图4为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后的抓力对比图，具体数据如表2所示。结果显示，阿霉素诱导的早衰小鼠抓力比同周龄的对照小鼠(生理盐水组)的抓力明显变小，而给食K35及K27可以恢复阿霉素诱导的早衰小鼠的抓力。

表2阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后的抓力对比数据

实施例4

本实施例研究了K35及K27对阿霉素诱导的早衰小鼠运动能力的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，每组8只，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次。使用转棒疲劳仪测试小鼠的运动能力，具体是在给阿霉素后的第10～13天将小鼠放在转棒仪的滚轴上，将转棒的转速调到合适的转速，让小鼠学习三天，第四天开始测量，转棒的转速为35r/min，记录每只小鼠从转棒上掉落的时间。每只小鼠测量三次，取平均值。

图5为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后转棒时间对比图，具体数据如表3所示，其中，小鼠从转棒上掉落的时间越短代表小鼠的运动能力越弱。结果显示，阿霉素诱导的早衰小鼠比同周龄的对照小鼠的运动能力明显减弱，而给食K35及K27可以恢复阿霉素诱导的早衰小鼠的运动能力。

表3阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后转棒时间对比数据

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实施例5

本实施例研究了K35及K27对阿霉素诱导的早衰小鼠肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次。在给阿霉素后的第20天，将小鼠的胡须剪掉后，摘眼球取血约0.5mL，然后37℃静置1h后在4℃、3000转/分条件下离心10分钟，取上清测定。

图6为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27之后血清中谷丙转氨酶(左)和谷草转氨酶(右)含量对比图，结果显示，阿霉素诱导的早衰小鼠血清里谷丙转氨酶和谷草转氨酶比同周龄的对照小鼠明显升高，意味着肝功能的损伤。而给食K35及K27可以将早衰小鼠血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶恢复至正常水平。

实施例6

本实施例研究了K35及K27对阿霉素诱导的早衰小鼠肝细胞SA-β-gal染色的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次。在给阿霉素后的第20天，处死小鼠，取出小鼠的肝脏，制作冰冻切片，然后根据碧云天SA-β-gal染色试剂盒的说明进行染色，同时用伊红进行染色来指示细胞。

图7为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝并制成切片后染SA-β-gal结果图(标尺为100μm)，图8为图7的统计图。结果显示，阿霉素诱导的早衰小鼠肝细胞的SA-β-gal染色阳性细胞明显比同周龄的对照小鼠多，而给食K35及K27可以使SA-β-gal染色阳性细胞占比减少。说明K35和K27可以使细胞变得更年轻。

实施例7

本实施例研究了K35及K27对阿霉素诱导的早衰小鼠肝或肺中衰老指标基因蛋白水平的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次。在给阿霉素后的第20天，处死小鼠，取出小鼠的肝脏或肺，液氮研磨后用RIPA裂解液裂解细胞并超声，然后用蛋白免疫印迹法来检测肝或肺细胞中衰老指标基因的蛋白水平。

图9为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝脏并液氮研磨后用蛋白免疫印迹法测试结果图，图10为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肺并液氮研磨后用蛋白免疫印迹法测试结果图。结果显示，给食K35及K27可以在一定程度上降低衰老指标蛋白的表达，说明K35和K27可以缓解细胞衰老。

实施例8

本实施例研究了K35及K27对阿霉素诱导的早衰小鼠肝细胞衰老指标基因mRNA水平的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次。在给阿霉素后的第20天，处死小鼠，取出小鼠的肝脏，液氮研磨后用TRIzol提取肝细胞的mRNA，然后用荧光定量PCR检测肝细胞中衰老指标基因的mRNA水平。

图11为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝脏并液氮研磨后用荧光定量PCR检测p21和p16的mRNA水平结果图，结果显示，阿霉素诱导的早衰小鼠的肝细胞的衰老指标基因mRNA水平明显比同周龄的对照小鼠高，而给食K35及K27可以在一定程度上降低这些基因的mRNA水平，说明K35和K27可以改善细胞衰老。

实施例9

本实施例研究了K35及K27对阿霉素诱导的早衰小鼠肝细胞衰老相关分泌表型基因mRNA水平的影响，具体步骤如下：

将8周龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，在第一天和第七天各腹腔注射10mg/kg剂量的阿霉素。在第一次给予阿霉素后的第三天开始灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，此后每隔一天就给小鼠灌胃一次。在给阿霉素后的第20天，处死小鼠，取出小鼠的肝脏，液氮研磨后用TRIzol提取肝细胞的mRNA，然后用荧光定量PCR检测肝细胞中衰老相关分泌表型基因mRNA水平。

图12为阿霉素诱导的早衰小鼠给予水、K35或K27后取肝脏并液氮研磨后用荧光定量PCR检测衰老相关分泌表型(SASP)基因的mRNA水平结果图，结果显示，阿霉素诱导的早衰小鼠的肝细胞的衰老相关分泌表型基因mRNA水平明显比同周龄的对照小鼠高，而给食K35及K27可以在一定程度上降低这些基因的mRNA水平，说明K35和K27可以改善细胞衰老。

实施例10

本实施例研究了K35及K27对正常衰老小鼠抓力的影响，具体步骤如下：

将18月龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，每组15只，分别灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，每五天灌胃一次，四个月后使用抓力仪测试小鼠的抓力大小，具体是将小鼠的两只前爪放在仪器上，用手抓住小鼠的尾巴往后拉，直到小鼠松开前肢，读取机器上记录的最大抓力值；每只小鼠测10次左右，取平均值。

图13为给予水、K35或K27四个月后的自然衰老的小鼠(22月龄)抓力大小对比图，具体数据如表4所示。结果显示，给食K35及K27可以增强正常衰老小鼠(22月龄)的抓力。

表4给予水、K35或K27四个月后自然衰老的小鼠(22月龄)抓力大小对比数据

实施例11

本实施例研究了K35及K27对正常衰老小鼠运动能力的影响，具体步骤如下：

将18月龄的雄性C57BL/6J小鼠分为三组，每组13只，分别灌胃水、K35(50mg/kg)或K27(50mg/kg)，每五天灌胃一次，四个月后使用转棒疲劳仪测小鼠的运动能力，具体是将小鼠放在转棒仪的滚轴上，将转棒的转速调到合适的转速，让小鼠学习三天，第四天开始测量，转棒的转速为20r/min，记录每只小鼠从转棒上掉落的时间；每只小鼠测量三次，取平均值。

图14为给予水、K35或K27四个月后的自然衰老的小鼠(22月龄)转棒时间对比图，具体数据如表5所示，其中，小鼠从转棒上掉落的时间越短代表小鼠的运动能力越弱。结果显示，给食K35及K27可以增强正常衰老小鼠的运动能力。

表5给予水、K35或K27四个月后自然衰老的小鼠(22月龄)转棒时间对比数据

实施例12

本实施例研究了K35及K27对依托泊苷诱导的衰老细胞中p21蛋白量的影响，具体步骤如下：

使用20μM的依托泊苷(ETO)处理乳腺癌(MCF-7)细胞24小时后，用PBS洗去残余的药物，再加入新鲜培养基继续培养3天。在这四天都有DMSO、K35或K27的处理。处理结束后，刮下培养皿里的MCF-7细胞，裂解后用蛋白免疫印迹的方法来检测细胞中p21蛋白量。

图15为在MCF-7细胞中使用依托泊苷(ETO)诱导细胞衰老后再给予K35或K27处理后用蛋白免疫印迹法检测细胞中p21蛋白量的结果图，结果显示，依托泊苷诱导的衰老细胞中p21的含量明显升高，而K35及K27可以降低依托泊苷诱导的衰老细胞中p21的蛋白水平，说明K35和K27可以缓解依托泊苷诱导的细胞衰老。

实施例13

本实施例研究了K35及K27对复制性衰老的人胚肺细胞2BS中衰老指标基因蛋白量的影响，具体步骤如下：

使用DMSO、K35(25μM)或K27(25μM)处理人胚肺细胞2BS，其中，每次传代后，等细胞贴壁后再加药，直到下一次传代；收集不同代数的细胞，裂解后用蛋白免疫印迹的方法来检测细胞中衰老指标基因蛋白的含量。

图16为不同代数的人胚肺细胞2BS在K35或K27处理后用蛋白免疫印迹法检测细胞中p21和p16蛋白量的结果图，结果显示，K35及K27可以降低复制性衰老的人胚肺细胞2BS中衰老指标基因蛋白量。说明K35和K27可以缓解人胚肺细胞的复制性衰老。

实施例14

本实施例研究了K35及K27对复制性衰老的人胚肺细胞2BS中衰老指标基因mRNA水平的影响，具体步骤如下：

使用DMSO、K35(25μM)或者K27(25μM)处理人胚肺细胞2BS。收集不同代数的细胞，裂解后用蛋白免疫印迹的方法来检测细胞中衰老指标基因mRNA的水平。

图17为年轻和复制性衰老的人胚肺细胞2BS在K35或K27处理后用蛋白免疫印迹法检测细胞中p21、p16以及衰老相关分泌表型(SASP)基因mRNA水平的结果图，结果显示，K35及K27可以降低复制性衰老的人胚肺细胞2BS中衰老指标基因mRNA的水平，说明K35和K27可以缓解人胚肺细胞的复制性衰老。

实施例15

本实施例研究了K35及K27对复制性衰老的人胚肺细胞2BS的SA-β-gal染色的影响，具体步骤如下：

使用DMSO、K35(25μM)或者K27(25μM)处理人胚肺细胞。将细胞以合适的密度接种在6孔板中，按照碧云天的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒使用说明进行染色。

图18为复制性衰老的人胚肺细胞在给予一段时间的K35或K27处理后染SA-β-gal结果图(标尺为100μm)，图19为图18的统计图。结果显示，K35及K27可以使复制性衰老细胞的SA-β-gal染色减弱，意味着K35和K27使细胞变得年轻了。

实施例16

本实施例研究了K35及K27对依托泊苷诱导的细胞增殖阻滞的影响，具体步骤如下：

将HeLa细胞以合适的密度接种在细胞爬片上，使用2μM的依托泊苷(ETO)诱导细胞增殖阻滞，同时使用DMSO、K35(25μM)或者K27(25μM)处理细胞48小时后，加入EdU孵育2小时后，对细胞进行固定，打孔之后用click反应液孵育细胞，然后用DAPI对细胞核进行染色，之后封片观察荧光强度。

图20为HeLa细胞中用依托泊苷诱导细胞衰老再给予K35或K27处理后检测反映细胞增殖情况的EdU的结果图(标尺为50μm)，图21为图20的统计图；结果显示，依托泊苷会导致HeLa细胞中EdU的染色减弱，代表着细胞增殖受到阻滞；K35及K27可以一定程度上恢复EdU的染色，表示细胞增殖阻滞的情况得到了恢复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂在制备抗衰老药物中的应用，所述M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂使M2亚型丙酮酸激酶处在非聚集状态；所述M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂为氨基二硫代甲酸酯类化合物或其药学上可接受的盐，所述氨基二硫代甲酸酯类化合物为以下化合物中的任一种：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述衰老包括细胞衰老或动物衰老。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞衰老包括复制性衰老或依托泊苷诱导的衰老。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述动物衰老包括自然衰老或阿霉素诱导的早衰。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂以及药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物中M2亚型丙酮酸激酶凝聚体的解聚剂的含量为0.5～99wt％。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括崩解剂、填充剂、助悬剂、絮凝剂和润滑剂中的一种或几种。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、丸剂、针剂、缓释制剂或控释制剂。