CN115957211B - 双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌转移中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，提供了双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌转移中的应用，所述双氢青蒿素的作用浓度为10～200μg/mL，所述黏菌素耐药基因为mcr‑1基因。本发明通过接合转移试验确证了双氢青蒿素在对细菌无生长影响的低浓度下可以显著抑制mcr‑1阳性质粒在大肠杆菌间的水平转移。本发明提出了双氢青蒿素对黏菌素耐药质粒传播的抑制作用，在医药、食品、兽医公共卫生等领域具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌转移中的应用。
背景技术
黏菌素耐药性是近年来备受关注的方向，2015年研究人员在猪源大肠杆菌中首次报道了质粒介导的可转移黏菌素耐药基因mcr-1，揭示了近年来动物源细菌黏菌素耐药性逐年上升的原因。目前发现mcr-1基因主要存在于大肠杆菌的IncI2、IncX4及IncHI2型质粒上，且已在全球6大洲超过60个国家广泛流行。IncI2型和IncX4型质粒依旧是流行最广的携带mcr-1基因的质粒类型，mcr-1基因的流行严重限制了黏菌素在临床以及畜禽养殖业中的应用，因此，急需找到控制携带mcr-1的黏菌素耐药质粒传播的药物，减少黏菌素耐药性的扩散。
双氢青蒿素(dihydroartemisininDHA)是青蒿素衍生物中活性较强的一种化合物，已作为疟疾特别是恶性疟疾一线治疗药物而受到广泛应用，其由青蒿素经四氢硼钠还原而成。分子量284.35，分子式为C15H24O5。目前发现DHA除了具有显著的抗疟疾效果外，其还具有抗肿瘤，抗寄生虫等作用，但未有文献报道DHA对携带黏菌素耐药基因mcr-1阳性质粒水平转移的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌转移中的应用，本发明双氢青蒿素在对细菌无生长影响的低浓度下可以显著抑制mcr-1阳性质粒在大肠杆菌间的水平转移，在医药、食品、兽医公共卫生等领域具有广泛的应用价值。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌间水平转移中的应用。
优选的，所述双氢青蒿素的作用浓度为10～200μg/mL。
优选的，所述黏菌素耐药基因为mcr-1基因。
优选的，所述细菌包括大肠杆菌。
优选的，所述大肠杆菌包括大肠杆菌ZJ28、大肠杆菌ZJ807和大肠杆菌J53。
优选的，所述耐药基因的转移为质粒介导的转移。
优选的，所述质粒包括IncI2型质粒和IncX4型质粒。
本发明还提供了双氢青蒿素在制备抑制黏菌素耐药基因在细菌间水平转移的试剂中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过接合转移试验证明了双氢青蒿素可以显著抑制携带黏菌素耐药基因mcr-1的质粒在大肠杆菌间的转移。由此可见，双氢青蒿素可以作为黏菌素耐药质粒转移的抑制剂，抑制黏菌素耐药性的扩散，为黏菌素耐药性的控制提供新的思路和来源，在医药、食品、兽医公共卫生等领域具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为双氢青蒿素降低携带mcr-1基因的IncI2质粒的接合转移频率；
图2为双氢青蒿素降低携带mcr-1基因的IncX4质粒的接合转移频率。
具体实施方式
本发明提供了双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌间水平转移中的应用。
在本发明中，所述双氢青蒿素的作用浓度为10～200μg/mL，优选为20～180μg/mL，进一步优选为50～150μg/mL。
在本发明中，所述黏菌素耐药基因优选为mcr-1基因。
在本发明中，所述细菌优选的包括大肠杆菌。
在本发明中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌ZJ28、大肠杆菌ZJ807和大肠杆菌J53。
在本发明中，所述耐药基因的转移优选为质粒介导的转移。
在本发明中，所述质粒优选的包括IncI2型质粒和IncX4型质粒。
本发明还提供了双氢青蒿素在制备抑制黏菌素耐药基因在细菌间水平转移的试剂中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因mcr-1在大肠杆菌间水平转移中的应用，以大肠杆菌ZJ28或大肠杆菌ZJ807作为供体菌、大肠杆菌J53作为受体菌，采用接合转移方法评价双氢青蒿素对携带mcr-1阳性质粒在大肠杆菌间的转移效果。
大肠杆菌ZJ807记载于如下文献中：Prevalence，risk factors，outcomes，andmolecular epidemiology of mcr-1-positive Enterobacteriaceae in patientsandhealthy adult sfrom China：an epidemiological and clinical study)，并上传基因组序列至NCBI，BioSample Accession Number：SAMN05437814。
大肠杆菌ZJ28记载于如下文献中：Prevalence，risk factors，outcomes，andmolecular epidemiology of mcr-1-positive Enterobacteriaceae in patientsand healthy adults from China：an epidemiological and clinical study，并上传基因组序列至NCBI，BioSample Accession Number：SAMN05437813。
大肠杆菌J53记载于如下文献中：Genome sequence of Escherichia coli J53，areference strain for genetic studies.GenBank accession number AICK00000000。
验证方法如下：
1、多黏菌素E储存液、双氢青蒿素储存液和叠氮钠储存液的制备
(1)取多黏菌素E(购自阿拉丁生化科技有限公司，有效含量为99％)，用去离子水稀释，得到浓度为2560μg/mL的多黏菌素E溶液，将多黏菌素E溶液用无菌滤膜(美国Pall公司，孔径为0.22μm)过滤，得到多黏菌素E储存液。
(2)取双氢青蒿素(购自上海陶素生物科技有限公司，有效含量为99.41％)，用DMSO稀释，得到浓度为2000μg/mL的双氢青蒿素溶液，将双氢青蒿素溶液用无菌滤膜过滤，得到双氢青蒿素储存液。
(3)取叠氮钠(购自卡迈舒(上海)生化科技有限公司，有效含量为99％)，用去离子水稀释，得到浓度为100mg/mL的叠氮钠溶液，将叠氮钠溶液用无菌滤膜过滤，得到叠氮钠储存液。
2、接合转移
(1)将供体菌(大肠杆菌ZJ28或大肠杆菌ZJ807)单克隆接种于2mL含多黏菌素E1μg/mL的BHI肉汤培养基(购自北京陆桥技术股份有限公司)，37℃、200rpm培养16h，得到供体菌溶液1；之后将200μL供体菌溶液1接种于2mLBHI肉汤培养基，37℃、200rpm培养4h，得到供体菌溶液2；用BHI肉汤培养基稀释供体菌溶液2，得到浓度为108CFU/mL的供体菌溶液3。
(2)将大肠杆菌J53(受体菌)单克隆接种于2mL含叠氮钠100μg/mL的BHI肉汤培养基，37℃、200rpm培养16h，得到受体菌溶液1；之后将200μL受体菌溶液1接种于2mLBHI肉汤培养基，37℃、200rpm培养4h，得到受体菌溶液2；用BHI肉汤培养基稀释受体菌溶液2，得到浓度为108CFU/mL的受体菌溶液3。
(3)将200μL步骤(1)得到的供体菌溶液3和200μL步骤(2)得到的受体菌溶液3混合，4000rpm离心5min，收集沉淀。
(4)完成步骤(3)后，将沉淀重悬于培养基(含10μg/mL双氢青蒿素的BHI肉汤培养基、含25μg/mL双氢青蒿素的BHI肉汤培养基、含50μg/mL双氢青蒿素的BHI肉汤培养基、含100μg/mL双氢青蒿素的BHI肉汤培养基和含200μg/mL双氢青蒿素的BHI肉汤培养基)中，37℃静置16h，得到混合菌液。
(5)完成步骤(4)后，将100μL混合菌液用无菌水进行稀释，然后涂布于双药板(含2μg/mL多黏菌素E和200μg/mL叠氮钠的BHI琼脂培养基)和单药板(含200μg/mL叠氮钠的BHI琼脂培养基)上，37℃静置24h。统计接合子数量和受体数量。双药板上生长的菌落即为接合子，单药板上生长的菌落为受体菌和接合子。
同时，分别将100μL步骤(1)得到的供体菌溶液3和100μL步骤(2)得到的受体菌溶液3用无菌水进行稀释，然后涂布于双药板。如果双药板上未出现任何菌落生长，则说明供体菌与受体菌均无自发突变。
结果表明，供体菌(大肠杆菌ZJ28或大肠杆菌ZJ807)与受体菌(即大肠杆菌J53)均无自发突变。
(6)完成步骤(5)后，计算接合转移频率。接合转移频率＝接合子数量/(受体数量+接合子数量)
接合转移试验进行三个生物学重复，结果取平均值。
统计结果见图1和图2(图1为供体菌大肠杆菌ZJ807，图2为供体菌为大肠杆菌ZJ28，DHA为双氢青蒿素)，以双氢青蒿素浓度为0时作为对照组，当双氢青蒿素浓度为10μg/mL时，IncI2质粒和IncX4质粒的接合转移频率相对对照组分别被降低了约3倍和6倍；当双氢青蒿素浓度为25μg/mL时，IncI2质粒和IncX4质粒的接合转移频率相对对照组分别被降低了约21倍和12倍；当双氢青蒿素浓度为50μg/mL时，IncI2质粒和IncX4质粒的接合转移频率相对对照组分别被降低了25倍和37倍；当双氢青蒿素浓度为100μg/mL时，IncI2质粒和IncX4质粒的接合转移频率相对对照组分别被降低了57倍和84倍；当双氢青蒿素浓度为200μg/mL时，IncI2质粒和IncX4质粒的接合转移频率相对对照组分别被降低了185倍和158倍。结果表明，在双氢青蒿素的作用下，携带mcr-1的IncI2质粒和携带mcr-1的IncX4质粒的接合转移频率均显著下降，并呈现浓度依赖性(p<0.0001)。
上述结果表明，双氢青蒿素可以显著降低IncI2质粒和IncX4质粒的接合转移频率。这一结果提示双氢青蒿素可以作为黏菌素耐药质粒转移的抑制剂，抑制黏菌素耐药性的扩散。
由以上实施例可知，本发明提供了双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌转移中的应用，本发明双氢青蒿素在对细菌无生长影响的低浓度下可以显著抑制mcr-1阳性质粒在大肠杆菌间的水平转移，在医药、食品、兽医公共卫生等领域具有广泛的应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.双氢青蒿素在制备抑制黏菌素耐药基因在细菌间水平转移的试剂中的应用；
所述双氢青蒿素在抑制黏菌素耐药基因在细菌间水平转移中的作用浓度为10~200ug/mL；
所述黏菌素耐药基因为mcr-1基因；
所述耐药基因的转移为质粒介导的转移；所述质粒包括IncI2型质粒和IncX4型质粒；
所述细菌为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌ZJ28、大肠杆菌ZJ807和大肠杆菌J53。
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| mcr基因介导的多黏菌素耐药机制研究进展;张琳慧等;动物医学进展;第43卷(第3期);第99页左栏"1.1 mcr-1基因的发现及分布"项下 * |
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