CN115944688B - 一种缓解疲劳的中药组合物、制剂与应用 - Google Patents

一种缓解疲劳的中药组合物、制剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缓解疲劳的中药组合物、制剂与应用。所述中药组合物由以下重量计的原料药组成：黄精14‑20g、当归10‑14g、淫羊藿5‑8g、西洋参5‑8g、茯苓5‑8g、红景天3‑5g。所述的中药组合物的应用为在制备缓解疲劳药物中的应用。本发明中药组合物具有显著抗疲劳功能，且效果显著优于西洋参单味药材，西洋参红景天组合，以及黄精当归组合，可作为一种潜在的可促进能量代谢和提高抗氧化能力而缓解肌肉疲劳的有效药物。

Description

一种缓解疲劳的中药组合物、制剂与应用
技术领域
本发明属于中药组合物技术领域，具体涉及一种缓解疲劳的中药组合物、制剂与应用。
背景技术
疲劳是一种常见的现象，造成的原因有以下原因：能量的消耗、代谢产物的产生和积累、免疫系统功能障碍、活性氧过量产生和细胞结构损坏等。疲劳会导致一系列生理变化，包括睡眠障碍、内分泌障碍、免疫功能紊乱和代谢紊乱。如果不治疗，长期疲劳会导致衰老、抑郁、癌症和其他疾病。许多研究试图找到能够抗疲劳成分，可以延缓疲劳，提高机体的运动能力。
本发明旨在提供一种能够缓解疲劳的中药组合物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种缓解疲劳的中药组合物，进一步的目的在于提供该中药组合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述缓解疲劳的中药组合物由以下重量计的原料药组成：黄精14-20g、当归10-14g、淫羊藿5-8g、西洋参5-8g、茯苓5-8g、红景天3-5g。
本发明进一步的目的是这样实现的，所述中药组合物的应用为在制备缓解疲劳药物中的应用。
本发明方中黄精具有补气养阴，健脾，润肺，益肾之功，归脾、肺、肾经，因兼具补气养阴及健脾益肾之功，因此为君药；当归有补血活血，调经止痛，润肠通便之功，归肝、心、脾经，因其为补血之要药，增强造血之功，为臣药；淫羊藿具有补肾阳，强筋骨之功，归肝、肾经，辅佐君药黄精补肾强筋之功，为佐药；西洋参具有补气养阴、清热生津之功，归肾、肺经，辅佐君药黄精补气之功，为佐药；茯苓具有利水渗湿，健脾，宁心之功，归心、肺、脾、肾经，辅佐君药黄精健脾之功，并兼具祛湿宁心之功，为佐药；红景天具有益气活血、通脉平喘之功，归肺、心、肝经，不仅使诸药补气之功增强，而且还使诸药补而不滞，是谓使药。因此，方中诸药直达病所，相得益彰，共奏健脾胃，补肝肾，益气血之功，补而不滞，可有效针对疲劳的发病机制，从而缓解疲劳相关症状。
本发明的有益效果为：本发明中药组合物具有显著抗疲劳功能，且效果显著优于西洋参单味药材，西洋参红景天组合，以及黄精当归组合，可作为一种潜在的可促进能量代谢和提高抗氧化能力而缓解肌肉疲劳的有效药物。
附图说明
图1为各组药物对小鼠游泳时间的影响；与模型组相比，* P<0.05, ** P<0.01,***P<0.001；
图2为各组药物对小鼠疲劳相关指标的影响；与模型组相比，*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001；
图3为各组药物对小鼠氧化应激指标的影响；与模型组相比，*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001；
图4为各组药物对小鼠肝脏线粒体能量代谢相关指标的影响（与模型组相比，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,****P<0.0001）；
图5 为血清质控样本总离子流图（同一个指控样本重复4次进样），其中，A为正离子模式；B为 负离子模式；
图6为骨骼肌质控样本总离子流图（同一个指控样本重复4次进样），其中，A为正离子模式；B为负离子模式；
图7为骨骼肌线粒体质控样本总离子流图（同一个指控样本重复4次进样），其中，A为正离子模式，B:为负离子模式；
图8为血清样本TIC图（A为正常组；B为模型组；C为阳性药组；D为实施例1给药组；Pos为正离子模式，Neg为负离子模式）；
图9为骨骼肌TIC图（A为正常组；B为模型组；C为阳性药组；D为实施例1给药组；Pos为正离子模式，Neg为负离子模式）；
图10为骨骼肌线粒体TIC图（A为正常组；B为模型组；C为阳性药组；D为实施例1给药组；Pos为正离子模式，Neg为负离子模式）；
图11为血清样本PCA散点图（CON为正常组， MOD为模型组， PQR为西洋参组，JZL为实施例1水提物组，P为 正离子模式，N为负离子模式）；
图12为血清样本OPLS-DA 散点图（CON为正常组， MOD为模型组， PQR为西洋参组，JZL为实施例1水提物组，P为 正离子模式，N为负离子模式）；
图13为骨骼肌样本PCA散点图（CON为正常组， MOD为模型组， PQR为西洋参组，JZL为实施例1水提物组，P为 正离子模式，N为负离子模式）；图14为骨骼肌样本OPLS-DA散点图（CON为正常组， MOD为模型组， PQR为西洋参组，JZL为实施例1水提物组，P为 正离子模式，N为负离子模式）；
图15为骨骼肌线粒体PCA散点图（CON为正常组， MOD为模型组， PQR为西洋参组，JZL为实施例1水提物组，P为 正离子模式，N为负离子模式）；
图16为骨骼肌线粒体OPLS-DA图（CON为正常组， MOD为模型组， PQR为西洋参组，JZL为实施例1水提物组，P为 正离子模式，N为负离子模式）；
图 17为模型组与实施例1组小鼠血清S-Plot图（P为正离子模式；N为负离子模式）；
图 18为模型组与实施例1组骨骼肌的S-Plot图（P为正离子模式；N为负离子模式）；
图19为模型组与实施例1组小鼠骨骼肌线粒体的S-Plot图；
图20为实施例1组药物调节的27条代谢通路。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：黄精14-20g、当归10-14g、淫羊藿5-8g、西洋参5-8g、茯苓5-8g、红景天3-5g。
所述缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：黄精15g、当归12g、淫羊藿8g、西洋参8g、茯苓8g、红景天5g。
所述中药组合物为各原料混合后的提取物或单独提取的水提物的总和。
具体提取方法为：将各原料打成均匀细粉，用10-12倍量的水加热回流两次，每次回流1-1.5 h，合并两次提取液，于55-65℃，转速100-150转/分下减压浓缩后冻干得到水提物。
本发明还提供了一种基于所述缓解疲劳的中药组合物的制剂，所述制剂是在所述水提物中加入医学上可以接受的辅料，制备成汤剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、膏剂、糖浆剂、粉剂和散剂中的任意一种。
所述制粒辅料为糊精、麦芽糊精或蔗糖中的一种或一种以上的组合。
本发明另外提供了所述中药组合物在制备缓解疲劳药物中的应用。
实施例1
一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：黄精15g、当归12g、淫羊藿8g、西洋参8g、茯苓8g、红景天5g。
黄精洗净后，切片，黄精：黄酒（用1：1的水和酒混溶）以5 ：1比例混合在常温下闷4h，高压灭菌锅 121℃ 2.5 h，取出后在70℃下烘干。
将各原料分别打成均匀细粉，混合均匀后用10倍量的水加热回流两次，每次回流1h，合并两次提取液，在65℃，转速100转/分下减压浓缩后，在冻干机上制成冻干粉得到水提物。
实施例2
一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：黄精20g、当归10g、淫羊藿5g、西洋参5g、茯苓5g、红景天3g。
黄精洗净后，切片，黄精：黄酒（用1：1的水和酒混溶）以5 ：1比例混合在常温下闷4h，高压灭菌锅 121℃ 2.5 h，取出后在70℃下烘干。
将各原料混合分别打成均匀细粉，混合均匀后用12倍量的水加热回流两次，每次回流1.5h，合并两次提取液，在55℃，转速150转/分下减压浓缩后，在冻干机上制成冻干粉得到水提物。
实施例3
一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：当归10g、黄精14g，淫羊藿6g、西洋参7g、茯苓8g、红景天4g。
将各原料分别打成均匀细粉，分别用10倍量的水加热回流两次，每次回流1.5h，合并两次提取液，最后合并两者的提取液，在60℃，转速120转/分下减压浓缩后，在冻干机上制成冻干粉得到水提物。
实施例4
一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：当归14g、黄精20g，淫羊藿6g、西洋参5g、茯苓8g、红景天5g。
实施例5
一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：当归12g、黄精18g，淫羊藿5g、西洋参6g、茯苓7g、红景天3g。
实施例6
一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：当归15g、黄精15g。
黄精洗净后，切片，黄精：黄酒（用1：1的水和酒混溶）以5 ：1比例混合在常温下闷4h，高压灭菌锅 121℃ 2.5 h，取出后在70℃下烘干。
将各原料分别打成均匀细粉，混合均匀后用10倍量的水加热回流两次，每次回流1h，合并两次提取液，在65℃，转速100转/分下减压浓缩后，在冻干机上制成冻干粉得到水提物。
实施例7
一种缓解疲劳的中药组合物，由以下重量计的原料药组成：当归12g、黄精18g。
黄精洗净后，切片，黄精：黄酒（用1：1的水和酒混溶）以5 ：1比例混合在常温下闷4h，高压灭菌锅 121℃ 2.5 h，取出后在70℃下烘干。
将各原料分别打成均匀细粉，用12倍量的水加热回流两次，每次回流1.5h，合并两次提取液，最后合并两者的提取液，在55℃，转速150转/分下减压浓缩后，在冻干机上制成冻干粉得到水提物。
实验例1
以下详细介绍本发明中药组合物的对运动性疲劳的干预作用药效实验情况：
实验试剂：乳酸测定试剂盒、尿素氮测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒、总蛋白测定试剂盒、还原型谷胱甘肽测定试剂盒、肌酸激酶测定试剂盒、乳酸脱氢酶测定试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司；呼吸链复合酶I、呼吸链复合酶II、ATP酶购自江苏酶免实业有限公司；ATP含量测定试剂盒购自苏酶免实业有限公司；黄芪、黄精及当归药材均购于云南文山圣农道地药材有限公司；阳性药材西洋参破壁饮片购于中山市中智中药饮片有限公司。
实验仪器：电热鼓风干燥箱（上海—恒科学仪器有限公司）；电子天平（常熟市双节测试仪器厂）；高压灭菌锅SX500（日本YOMY KOQYO公司）；冷冻干燥机（上海—恒科学仪器有限公司）；电热套（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；旋转蒸发仪（新加坡艺思高科技有限公司）；酶标分析仪（Molecular Devices；美国分子仪器公司）；台式高速冷冻离心机（美国塞默飞世尔公司）。
实验药物：
1、实施例1制备的水提物。
2、黄精当归复方提取液：将黄精和当归以1：1比例混合后打成均匀细粉，用10倍量的水加热回流两次，每次回流1h，合并两次提取液，在65℃，转速100转/分下减压浓缩后，在冻干机上制成冻干粉得到水提物。
3、西洋参红景天复方提取液：将西洋参和红景天以1：1比例混合后打成均匀细粉，用10倍量的水加热回流两次，每次回流1h，合并两次提取液，在65℃，转速100转/分下减压浓缩后，在冻干机上制成冻干粉得到水提物。
实验方法：
取雄性昆明小鼠（体重 (20±2) g, 由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，合格证号:SCXK(辽）2015-0001）120只，试验期间小鼠饲养于有通风装置的动物房，室内温度为（24 ± 2℃）；湿度为（65 ± 10%）；在12小时光照与12小时黑暗周期循环的条件下饲养并给予小鼠自来水和实验室专用动物饲料。
小鼠适应性饲养3天后，随机分为12个组，每组10只，包括正常对照组（CON），模型组（MOD），西洋参阳性药组(PQR)，黄精当归复方高剂量组（FFH）、中剂量组（FFM）、低剂量组（FFL），实施例1水提物高剂量组（JZH）、中中剂量组（JZM）、低中剂量组（JZL）；西洋参红景天复方高剂量组（DBTH）、中（DBTM）、低（DBTL）。高剂量组、中、低剂量组给药量分别为7.2 g/kg/d、3.6g/kg/d和1.8 g/kg/d（按生药量计)，阳性药组给药量为0.6 g/kg/d，阳性药和复方粉末均用生理盐水配制，对照组和模型组则灌胃给予相等体积的生理盐水（详见表1），各组按给药剂量连续灌胃30 d，1次/d。
表1小鼠分组及给药情况
第30天末次给药30 min后，除正常对照组外，用小鼠体重5%的铅块给小鼠负重，将其放入水温(25 ± 1℃)的水槽中使其游泳，开始计时，直至小鼠沉入水底8 S不再浮起，为力竭游泳结束，记录游泳时间。小鼠从水中取出，用纸巾擦干，通过去除左眼球将血液收集在离心管中，血清通过在4℃以3500 rpm离心15 min来制备。同时取下小鼠心、肝、脾、肾供脏器指数计算和后续指标测定。所有样本均在-80℃下保存直到使用。
检测指标：
1、血清和肝脏生化指标的检测
测定血清乳酸（LA），乳酸脱氢酶（LDH）、尿素氮（BUN）和血清肌酸激酶（CK）。肝脏匀浆液和上清液（通过BCA分析测定蛋白浓度）用于测定肝糖原（LG），丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH-PX)的水平。 所有参数测定均按试剂盒说明书操作，在SpectraMax Plus 384酶标仪上完成。
2、能量代谢相关指标的检测
先分离小鼠后腿骨骼肌的线粒体，将骨骼肌（0.1 g）样品置于冰冷的分离缓冲液（210 mM甘露醇，70 mM蔗糖，10 mM Tris base，1 mM EDTA和0.5 mM EGTA，pH 7.4）中以去除血液，切成1立方毫米，并在隔离缓冲液中匀浆。以1,000×g离心10分钟后，收集上清液，并以10,000×g离心10分钟。将沉淀物重悬于分离缓冲液中，并以10,000×g离心10分钟，获得线粒体。以上过程均在冰上或在4℃的冷藏室中进行。接着将线粒体重悬在生理盐水中。通过BCA分析确定蛋白质浓度后，将100μL线粒体悬液用于测定ATP酶，复合物I和II的水平。按照试剂盒说明书操作，在SpectraMax Plus 384酶标仪上检测相关指标。
称取0.1 g小鼠后腿骨骼肌，加0.9 mL的生理盐水用研磨仪研磨，3000×g离心10min，取上清。按试剂盒说明书操作，用SpectraMax Plus 384酶标仪在450nm波长处测定吸光度，计算样品中ATP含量。
实验结果
1、 各组药物对小鼠负重力竭游泳时间的影响
如图1所示，与模型组相比，实施例1水提物低剂量组、中剂量组及西洋参红景天复方高剂量组小鼠的负重游泳时间显著延长（P<0.05），结果表明该复方可以有效提高小鼠的机体能力，延长小鼠负重力竭游泳时间，具有显著的抗疲劳作用，且组合物复方效果优于西洋参红景天复方。黄精当归复方低、中、高剂量组与阳性药相比，延长小鼠的游泳时间，但没有显著性差异。
2、对小鼠疲劳相关生化指标的影响
如图2示，小鼠负重力竭游泳后，血清尿氮素（BUN）含量显著升高（P<0.05）；给予实施例1组药物后，血清BUN含量显著降低（P<0.05），表明实施例1可有效抑制疲劳小鼠血清中尿氮素的产生。而另外两组药物没有发生显著变化。小鼠负重力竭游泳后，小鼠血清中乳酸（LA）含量显著升高（P<0.01），给予实施例1低剂量组后，小鼠血清中LA水平显著下降（P<0.05)，说明该两组药物可减轻疲劳小鼠体内乳酸的堆积。进一步测定各组小鼠的乳酸脱氢酶活力（LDH），结果显示，小鼠负重力竭游泳后，小鼠血清中LDH降低，实施例1水提物的高、中、低剂量均显著提高小鼠的乳酸脱氢酶活力（P＜0.001；P<0.05），进一步说明实施例1水提物组能通过减少乳酸的生成和堆积，减缓小鼠运动后疲劳的病症。
此外，小鼠负重力竭游泳后，小鼠血清中肌酸激酶（CK）降低；给予实施例1水提物中、高剂量后，小鼠血清中CK水平显著升高（P<0.01；P<0.001）；而另外两组药物没有显著影响CK水平。表明实施例1组水提物可显著提高CK活力而促进肌肉组织中乳酸的代谢，有利于延缓疲劳导致的肌肉酸痛。
3、对小鼠氧化应激的影响
如图3所示，小鼠负重力竭游泳后，小鼠骨骼肌中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）水平显著降低（P<0.05；P<0.001），丙二醛（MDA）含量显著升高（P<0.05）；给予阳性药西洋参后，骨骼肌中MDA水平显著降低（P<0.05）；给予实施例1水提物低、高剂量组药物后，骨骼肌中MDA水平显著降低（P<0.05），GSH-Px和SOD水平均显著升高（P<0.01）；而西洋参红景天复方低剂量组可显著降低MDA和升高GSH-Px水平（P<0.05；P<0.01），黄精当归复方高剂量组可显著增加GSH-Px水平（P<0.01）。结果表明，三组药物提取物可有效抵抗小鼠游泳疲劳所致的氧化应激损伤，且实施例1组的效果最优。
4、 对小鼠能量代谢的影响
如图4所示，小鼠负重力竭游泳后，小鼠骨骼肌线粒体中呼吸链复合物Ⅰ（ComplexⅠ）活性、复合物Ⅱ（Complex Ⅱ）、Na+_K+_ATP酶活力和ATP含量水平均显著降低（P<0.05）；给予药物后，这些指标均显著升高（P<0.05；P<0.01；P<0.001），结果表明，三组药物可对运动过程中骨骼肌线粒体能量代谢具有调节作用，有利于ATP的合成，提高机体运动耐力，延缓疲劳的发生。
另外，小鼠长时间高强度运动中体力的衰竭与肝糖原（LG）含量降低有关，LG含量的增多可以为机体提供更多的能量。由实验结果可知，小鼠负重力竭游泳后，肝脏中LG水平显著降低（P<0.05）；给予西洋参红景天复方提取物低剂量组及实施例1水提物组药物后，LG水平均显著升高（P＜0.05），表明两组药物可以提高小鼠体内LG储备能力，维持小鼠运动时的血糖水平，延缓疲劳的产生。
综上所述，本发明中药组合物能通过促进能量代谢和抗氧化能力有效缓解肌肉疲劳，可作为一种可促进能量代谢和抗氧化能力而缓解肌肉疲劳的有效药物/营养素。
实验例2 本发明中药组合物抗疲劳小鼠的代谢组学研究
实验材料：乙腈 （美国millipore 公司）；甲醇 （美国millipore 公司）；氨水 （德国Merck公司）；甲酸 （美国millipore 公司）；其余试剂均为分析纯。
实验仪器：Ultimate 3000 超高效液相色谱串联Q Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（美国赛默飞世尔科技），配有CBM-20A系统控制器，LC-20AD四元泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20A柱温箱及SPD-M20A PDA检测器；超声波系统（Diagenode生物科技有限公司）；真空离心浓缩仪（德国Eppendorf公司）；离心机（德国Eppendorf公司）。
实验方法
一、样品预处理
1、血清样品
采用实验例1中方法第29天给药（浓度为1.8g/kg）后，对实验大鼠禁食处理12 h，不禁水，第三十天最后一次给药后半小时内进行负重力竭游泳，摘除眼球进行取血，离心（3500 r.min-1,10 min）分离血清，分装去离心管中于-80℃保存备用。取冷冻储存的血清样本，置4℃下解冻，涡旋震荡5 s，取80 μL，加入200 μL预冷水和800 μL预冷的的甲醇/乙腈（1:1，v/v），混匀，冰浴中超声1 h，-20℃静置2 h，16000g 4℃离心20min，取上清。上清在高速真空浓缩离心机挥干。质谱检测时加入100 μL甲醇-水溶液（1:1,v/v）复溶，20000g 4℃离心20 min，取上清进样分析。
2、骨骼肌样本
采用实验例1中方法第29天给药（浓度为1.8g/kg）后，取骨骼肌样品液氮研磨后，每样称取80 mg，加入200 μL预冷水和800μL预冷的的甲醇/乙腈（1:1，v/v），混匀，冰浴中超声1 h，-20℃静置2 h，16000g 4℃离心20 min，取上清。上清在高速真空浓缩离心机挥干。质谱检测时加入100 μL甲醇-水溶液（1:1,v/v）复溶，20000g 4℃离心20 min，取上清进样分析。
3、骨骼肌线粒体样本
采用实验例1中方法第29天给药（浓度为1.8g/kg）后，取骨骼肌样品4℃解冻，每样称取0.1g组织，加入1.0mL提取液，用匀浆器于冰上匀浆，4 ℃ 600g 10 min 离心，上清液移至另一离心管中，4℃ 11000g 15 min 。在沉淀中加入400uL提取液，超声波破碎（功率20%，超声 5s,，间隔 10s，重复 15次）。由样品中的蛋白量为根据，推算不同样品中细胞量。每例样品取含有等量细胞量的上清液。上清在高速真空浓缩离心机挥干。质谱检测时加入30 μL 甲醇-水溶液（1:1, v/v）复溶，16000g 4℃离心 20 min，取上清进样分析。
4、质控样本
将1-3中所有复溶样本各取等量样本进行充分混匀，超声提取、离心后取上清于进样小瓶中待UPLC/MS分析。在检测过程中每隔5个待测样本插入一个质控样本。
二、UPLC/MS条件
采用色谱柱为 ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1×150 mm, 1.8 µm）色谱柱。其中进样量 6 μL，柱温 40℃，流速 0.3 mL/min；
色谱流动相 A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈。梯度程序设置如表2。
表2液相色谱程序
质谱条件：每例样品分别采用电喷雾电离（ESI）进行正离子（+）和负离子（-）模式检测。样品经 UPLC 分离后进行质谱分析，使用ESI 源进行离子化，其离子化条件如下：Spray Voltage：3.8kv（+）和 3.2kv（-）；Capillary Temperature：320（±）；Sheath Gas：30（±）；Aux Gas：5（±）；Probe Heater Temp：350（±）；S-Lens RF Level：50。
质谱采集设置如下：质谱采集时间：15min。母离子扫描范围：70-1050m/z，一级质谱分辨率：70,000@m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：100 ms。二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后触发采集 10 个最高强度母离子的二级质谱图谱（MS2scan），二级质谱分辨率：17,500 @ m/z 200，AGC target: 1e5，二级 Maximum IT：50 ms，MS2Activation Type: HCD，Isolation window：2 m/z，Normalized collisionenergy（Setpped）：20，30，40。
三、数据处理
原始数据采用 MSDIAL 软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（质量偏差 mass tolerance<20 ppm）和二级谱图匹配（质量偏差 mass tolerance<0.02 Da）的方式，检索 HMDB、MassBank 等公共数据库及我们自建的代谢物标准品库。对提取得到的数据，删除组内缺失值>50%的离子峰不参与后续统计分析；对正负离子数据分别进行总峰面积归一化，整合正负离子峰并应用 R 软件进行模式识别，数据经 Unit variance scaling（UV）预处理后，进行后续数据分析。
潜在生物标志物的筛选与鉴定: 以VIP>1为筛选标准，初步筛选出各组间的差异代谢物物。进一步采用单变量统计分析，验证代谢物是否具有显著性差异。选择同时具有多元统计分析VIP>1和单变量统计分析P value<0.05的代谢物（能够用OPLS-DA建模的比较组，采用OPLS-DA VIP>1且p<0.05进行筛选; 若无置换检验图或者置换检验图中R2或Q2拟合线中至少一条线的斜率小于零，表明OPLS-DA模型可靠性较差，则采用Fold Change>1.5且 p<0.05进行筛选），作为具有显著性差异的代谢物。
实验结果：
（一）质量控制
为了保证检测分析过程中液质联用仪的稳定性和重复性，每隔5个待测样本中加入一个质控样本，测试仪器在整个过程中的稳定性。图5至7分别为血清、骨骼肌、骨骼肌线粒体样本总离子流图（TIC）图。如图所示，各质控样本在正负离子模式下出峰时间及显著峰重叠良好，提示被检测样本的重复性良好，仪器稳定性较好，得出的数据结论可靠。
（二）各组小鼠样本总离子流图特征
为全面获取小鼠代谢物的基本代谢轮廓信息，对小鼠血清、骨骼肌、骨骼肌线粒体样本各组正负离子模式下的TIC图进行分析。图8至10为三种样本各组TIC图，结果显示各TIC图显著峰明显，信号强，各组代谢物分离明显，表明UHPLC/MS条件设置合理。三种样品的正常组、模型组、阳性药组和实施例1水提物组的色谱峰总离子流图存在显著差异，说明负重力竭游泳造模以及给药处理后，三种样本中的内源性代谢物的种类和含量发生了显著变化。
（三）多元统计分析
1、血清样本
（1）PCA分析
图11为血清样本正负离子模式下的PCA图，结果显示，正常组、模型组、西洋参阳性对照组和实施例1水提物组分别位于PCA散点得分图的四个不同区域，四组样本组内聚合，组间基本分开，说明不同组小鼠的代谢物组成和浓度不同，其中阳性药组较分散，其原因可能是代谢较多且识别噪音水平较高，对代谢物分离造成一定的干扰。
（2）OPLS-DA分析
OPLS-DA可在分析过程中尽量降低噪音信息，消除无关信息的干扰，最大限度显现各组代谢物的差异。如图12所示，正负离子模式下，四组组间区分，组内聚合，说明不同组小鼠的代谢物组成和浓度不同。与模型组比较，实施例1组水提物向正常组靠近，说明实施例1组水提物可有效逆转疲劳诱导的病理改变，且效果优于西洋参。
2、骨骼肌样本
（1）PCA分析
图13为各组骨骼肌样本正负离子模式下的PCA图。结果显示，模型组、正常组、阳性药组、实施例1水提物组有个别样本重叠，但总体上各组间样本的离散度清晰明确，说明不同组小鼠的代谢物组成和浓度不同。
（2）OPLS-DA分析
如图14所示为骨骼肌样本在正负离子模式下的OPLS-DA图，结果显示OPLS-DA模型大大提高了样本判别分类，在正负离子模式下，正常组、模型组、西洋参阳性药组和实施例1水提物组组内聚合明显，组间区分，实施例1水提物组向正常组靠近的趋势，说明实施例1组水提物可显著逆转疲劳诱导的病理改变，且效果优于西洋参。
3、骨骼肌线粒体样本
（1）PCA分析
图15为各组骨骼肌线粒体样本在正负离子模式下的PCA图。结果显示，正常组、模型组、西洋参阳性对照组和实施例1水提物组样本有个别样本重叠，但总体上各组间样本的离散度清晰，说明不同组小鼠的代谢物组成和浓度不同。其中模型组样本远离正常组，而实施例1水提物组样本点趋近于正常组，说明实施例1给药组可逆转疲劳诱导的病理改变。
（2）OPLS-DA分析
图16为骨骼肌线粒体样本在正负离子模式下的OPLS-DA分析，结果显示，正负离子模式下，正常组、模型组、阳性对照组和实施例1给药组组内聚集，组间区分明显，说明不同组小鼠的代谢物组成和浓度不同。与模型组比较，实施例1给药组向正常组趋近，说明实施例1组水提物可有效逆转疲劳诱导的病理改变，且效果由于西洋参。
4、模型验证
（1）模型参数评价
为了避免多元统计分析结果出现过拟合的情况。需要对本文所有PCA和OPLS-DA模型进行评价和验证。如表3所示，PCA模型通过拟合度（R2X）和预测度（Q2）对模型准确性进行评价，其中R2X表示模型对X变量差异的解释性，Q2表示模型可预测度。如表所示，质控样本正负离子模式下模型评价参数，R2X和Q2均为1，表明建立的数字模型可靠。其余样本的R2X均大于0.4，表明模型可解释率高，能很好的揭示个样本在X变量的差异。和质控样本PCA模型的Q2相比，其余样本的Q2较低，可能是由于其余样本包含多个实验组的代写数据，PCA判别能力有限。
OPLS-DA模型着重强调组间的差异，通过拟合度（R2X、R2Y）和预测度（Q2）对模型准确性进行评价，一般R2Y较大，Q2大于0.5表明该模型较好。如表4所示，OPLS-DA得分图的模型参数表，各样本正负离子模式下R2X均大于0.25（血清样本除外），R2Y接近于1，Q2均大于0.2（骨骼肌线粒体除外），提示模型预测能力较好，可用于差异代谢物识别和通路分析。
表3各样本PCA模型评价参数
注：R2X表示模型对X变量差异的解释性，Q2表示模型可预测度。R2和Q2越接近1，表明模型越稳定可靠；Q2大于0.5，表明模型的预测能力较好。
表4 各样本OPLS-DA模型评价参数
注：R2X表示模型对X变量差异的解释性，Q2表示模型可预测度。R2和Q2越接近1，表明模型越稳定可靠；Q2大于0.5，表明模型的预测能力较好。
四、差异性代谢物筛选鉴定
为进一步确定给药后体内代谢物的变化情况，采用OPLS-DA对模型组和实施例1给药组的血清样本、骨骼肌样本和骨骼肌线粒体样本进行分析后得到s-plot载荷图（17-19）。根据OPLS-DA模型得到的变量权重值（Variable Importance for the Projection, VIP）来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物学意义的差异代谢物。从血清样本中筛选到142种代谢物，其中正离子模式下72种，负离子模式下70种（表5）；从骨骼肌样本中筛选到173种代谢物，其中正离子模式下100种，负离子模式下73种（表6）；从骨骼肌线粒体样本中筛选到59种代谢物，其中正离子模式下40种，负离子模式下19种（表7）。这些化合物包括碳水化合物类，氨基酸类等，生物碱类等，给予实施例1组水提物后能调节对上述代谢物。
表5 血清正负离子模式下JZL/MOD差异代谢物汇总
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表6骨骼肌正负离子模式下JZL/MOD差异代谢物汇总
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表7骨骼肌线粒体样本JZL/MOD差异代谢物汇总
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（五）代谢通路分析
为进一步对疲劳造成小鼠体内代谢紊乱及实施例1组水提物对相关通路与网络调控进行研究，对小鼠的血清、骨骼肌、骨骼肌线粒体中的差异代谢物进行通路分析，并以P<0.05的相关通路作为疲劳病理状态下及实施例1组水提物干预作用最相关的代谢通路。将142种血清中差异代谢物进行代谢通路富集分析，与差异代谢物相关的代谢通路有 6条（表8）；将173种骨骼肌中差异代谢物进行代谢通路富集分析，与差异代谢物相关的代谢通路有15 条（表9）；将59种骨骼肌线粒体中差异代谢物进行代谢通路富集分析，与差异代谢物相关的代谢通路有7条（表10）。结果表明实施例1组水提物通过调节上述代谢通路缓解疲劳。
表8实施例1组水提物干预后血清样本代谢通路分析结果
表9实施例1组水提物干预后骨骼肌样本代谢通路分析结果
表10实施例1组水提物干预后骨骼肌线粒体样本代谢通路分析结果
代谢组学通过动态观察体内代谢物的变化，与中医学“整体观念”以及中医“证”的动态演变过程契合，代谢产物的改变可以反映人体的生理病理状态，有望作为明确中医药干预疾病疗效的客观指标。
本发明采用UHPLC/MS技术对小鼠血清、骨骼肌、骨骼肌线粒体进行代谢组学分析，收集机体完整的代谢信息，全面揭示实施例1组水提物通过调节内源性代谢物进而改善疲劳的作用机制。其中，血清可表征机体整体代谢情况；骨骼肌可表征收缩耦联的代谢情况；线粒体作为“发动机”，其功能转态与疲劳的发生发展密切相关。因此，本研究采用上述三种样本进行代谢组学分析。
代谢组学的准确性在于代谢物的定性定量。因此，本研究设置了QC样本对检测分析过程中液质联用仪的稳定性和重复性进行监测；通过模型参数和置换检验对多变量分析方法进行评价。结果表明，在本实验中，仪器稳定性良好，实验建立的数字模型未出现拟合情况，说明实验数据真实可靠，可进行后续分析。
本发明对各组样本TIC和多元统计分析。TIC初步提供了各组样本代谢物的基本信息，结果显示血清、骨骼肌、骨骼肌线粒体中各组TIC轮廓明显不同，表明造模及给药后各组小鼠内源性代谢物的种类和含量不同。研究中对各组代谢物信息进行无监督识别模式PCA分析和有监督模式的OPLS-DA分析，进一步放大代谢差异。结果显示，负重力竭游泳后，模型组和给药组明显分离，表明小鼠负重游泳导致体内代谢物发生病理改变。与模型组比较，实施例1水提物组向正常组趋近，且比阳性药西洋参更接近正常组，表明实施例1组水提物可显著逆转疲劳造成的内源性代谢物的变化，使机体恢复正常，且效果优于西洋参。
为进一步说明本发明中药组合物通过调节内源性代谢物抗疲劳的作用机制，本发明对给药组和模型组中的显著性差异代谢物和代谢通路进行分析。结果发现，实施例1组水提物对血清样本中亚牛磺酸、金丝桃素等142种内源性代谢物进行调节，这些代谢物主要参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；色氨酸代谢；牛磺酸和亚牛磺酸代谢；苯丙氨酸代谢；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；氨基糖和核苷酸糖代谢。实施例1组水提物能对骨骼肌样本中L-精氨酸琥珀酸酯、丝氨酸等173种内源性代谢物进行调节，这些代谢物主要参与β-丙氨酸代谢；谷胱甘肽代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；氨基酸生物合成；辅助因子生物合成。Neg:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；辅助因子生物合成；氧化磷酸化；苯丙氨酸代谢；TCA循环；不饱和脂肪酸生物合成；碳代谢；丁酸盐代谢；嘧啶代谢。实施例1组水提物水提物对骨骼肌线粒体中异卦酸、黄素腺嘌呤二核苷酸等59种内源性代谢物进行调节，这些代谢物主要参与丙氨酸、天冬氨酸盐和谷氨酸盐代谢；酪氨酸代谢；嘌呤代谢；核黄素代谢；淀粉和蔗糖代谢；α-亚麻酸代谢；半乳糖代谢。
综上所述，本发明中药组合物可有效调节小鼠血清、骨骼肌、骨骼肌线粒体样本中374种代谢物恢复正常水平，这些代谢物共参与了27条通路（图20）。
下面介绍本发明方临床疗效情况：
1、治疗方法
采用补气养血、健脾益肾法治疗运动疲劳，给予组合物：黄精15g、当归12g、淫羊藿8g、西洋参8g、茯苓8g、红景天5g。水煎服，分早晚2次服用。10天为1个疗程，连续治疗3个疗程。随访6个月。
2、疗效标准
显效：治疗后疲劳感完全消除，且血清乳酸、尿素氮恢复正常水平，乳酸脱氢酶、肌酸激酶水平有显著提升，并6个月后复查均无升高。
有效：治疗后，疲劳感有所缓解，且血清乳酸、尿素氮明显降低，但比正常水平略高，继续用药还有下降趋势，同时乳酸脱氢酶和肌酸激酶水平有升高趋势。
无效：治疗后疲劳感没有明显减轻，同时血清乳酸、尿素氮水平无显著降低。
3、结果
149例疲劳综合征患者经3个疗程的治疗，患者疲劳综合征轻、中、重度均有不同程度的疗效变化，其显效率为62.4%。同时复查肝、肾功能及血尿常规均属正常，并且半年后复查除无效者，其余疲劳均无反跳现象。见表11。
表11 149例患者的治疗效果（例 %）
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Claims (5)

1.一种缓解疲劳的中药组合物，其特征在于，按黄精14~20g、当归10~14g、淫羊藿5~8g、西洋参5~8g、茯苓5~8g、红景天3~5g计量配合的原料药制成，具体提取方法为：将各原料打成均匀细粉，用10~12倍量的水加热回流两次，每次回流1~1.5h，合并两次提取液，于55~65℃，转速100~150转/分下减压浓缩后冻干得到水提物。
2.根据权利要求1所述缓解疲劳的中药组合物，其特征在于，按黄精15g、当归12g、淫羊藿8g、西洋参8g、茯苓8g、红景天5g计量配合的原料药制成。
3.根据权利要求1或2所述缓解疲劳的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物为各原料混合后的提取物或单独提取的水提物的总和。
4.一种基于权利要求1所述缓解疲劳的中药组合物的制剂，其特征在于，所述水提物中加入医学上可以接受的辅料，制备成汤剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、膏剂、糖浆剂、粉剂中的任意一种。
5.一种权利要求1~3中任一所述缓解疲劳的中药组合物在制备缓解疲劳药物中的应用。
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