CN115927763A - 同时检测a、b、c和h型猪轮状病毒核酸的引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物病毒学分子技术领域，具体涉及同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的引物探针组合、试剂盒及应用。本发明针对猪轮状病毒核酸血清型的多样性，设计了针对不同血清型的探针组合物如A型，B型，C型和H型基因的探针引物。各探针标记了荧光基团且荧光基团彼此互不相同且互不干扰，组合物以混合的形式存在。其中：A型探针PoRVA‑P的5’端用FAM修饰；3’端用BHQ1修饰；B型探针PoRVB‑P的5’端用ROX修饰，3’端用MGB修饰；C型探针PoRVC‑P的5’端用HEX修饰，3’端用BHQ1修饰；H型探针PoRVH‑P的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰。本发明灵敏度高、特异性强、操作简单方便。
Description
技术领域
本发明涉及动物病毒学分子技术领域，具体涉及一种同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科，是一种无包膜的RNA病毒，基因组由11个分节段的双链RNA组成，编码6种结构蛋白和5种非结构蛋白，根据国际病毒分类委员会定义，RV根据其VP6序列的多样性可以分为RVA-RVJ九个不同的类型，RV感染在养猪场非常普遍，是导致哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的主要肠道病原之一，临床上主要以水样腹泻、呕吐、体重下降为主要特征，严重可以导致死亡，各年龄段的猪均可感染，1周龄以下的仔猪最易感，致死率高。与猪腹泻的相关主要RV包括RVA、RVB、RVC和RVH。1975年英国首次报道了猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)，1980报道了猪轮状病毒B型和C型，2011年首次在西班牙发现了轮状病毒H型。目前研究表明RVA有12种G基因型和16种P基因型，RVB有19种G基因型，RVC有10种G基因型、5种P基因型和3种I基因型，RVH缺乏相关分型统计。猪轮状病毒在世界范围内均有流行，多种轮状病毒混合感染在猪中很常见，混合感染可加重仔猪腹泻的严重程度。
轮状病毒的血清型多样，基因可塑性强，世界范围内检测到了不常见的猪轮状病毒血清型，在不同的地区发现了新的猪轮状病毒型，猪轮状病毒的患病率和遗传多样性正在逐渐增加，对猪轮状病毒流行病学的研究变得更加复杂。现有技术中没有同时对4个基因型进行检测的方法。因此，对猪轮状病毒的分子诊断方法需要不断更新，针对轮状病毒多种类型混合感染的情况，建立一种灵敏度高、特异性强、操作简单方便，并能鉴定不同类型的轮状病毒的检测方法十分必要，以确保更准确地进行流行病学监测，从而更好地制订预防和控制策略。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的引物探针组合、试剂盒及应用。本发明使用方便、灵敏度高。
1.同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量组合物，其特征在于，所述组合物包括猪轮状病毒A型引物序列PoRVA-F、PoRVA-R，探针序列PoRVA-P；具体序列如下：
猪轮状病毒A型引物的序列：
PoRVA-F TGAATCGTCTTCTACAACGTCAAC(SEQ ID NO：1)
PoRVA-R TCGTTTGAAGCAGAATCAGATGG(SEQ ID NO：2)
PoRVA-P CTCTGGAGACTTCGACAACAT(探针序列SEQ ID NO：3)
猪轮状病毒B型引物序列为PoRVB-F、PoRVB-R，探针序列为PoRVB-P；
PoRVB-F GGATTAAATAR(A/G)CCCAACY(C/T)GR(A/G)CG(SEQ ID NO：4)；
其中R，Y，R为突变；
PoRVB-R TTB(G/T/C)AGATTY(C/T)GTR(A/G)TTTGGN(A/T/C/G)GCTA(SEQ ID NO：5)；其中B，Y，R，N为突变；
PoRVB-P AGCATGGATCTGATY(C/T)GAAACAGT(探针序列SEQ ID NO：6)；
其中Y为突变；
猪轮状病毒C型引物序列；
PoRVC-F CATGTAGCATGAK(G/T)TCACGAATGGG(SEQ ID NO：7)；
其中K为突变；
PoRVC-R ACATTTCATCCTCCTGGGGATC(SEQ ID NO：8)；
PoRVC-P GCGTAGGGGCAAATGCGCATGA(探针序列SEQ ID NO：9)；
猪轮状病毒H型引物的序列：
PoRVH-F ACTTCAATCGTTGCTGCAACAG(SEQ ID NO：10)；
PoRVH-R TY(C/T)CTTTTGCTTCTGAGATCAAATCG(SEQ ID NO：11)；
其中Y为突变；
PoRVH-P TCGCTCATCCTAAGGCAAGAGGTATCCA(探针序列SEQ ID NO：12)。
2.根据权利要求1所述的同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量检测组合物，其特征在于，所述检测引物探针组合物中的各探针标记了荧光基团且荧光基团彼此互不相同且互不干扰；所述组合物以混合的形式存在；所述猪轮状病毒A型探针序列PoRVA-P的5’端用FAM修饰；3’端用BHQ1修饰；所述猪轮状病毒B型探针序列PoRVB-P的5’端用ROX修饰，3’端用MGB修饰；所述猪轮状病毒C型探针序列PoRVC-P的5’端用HEX修饰，3’端用BHQ1修饰；所述猪轮状病毒H型探针序列PoRVH-P的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰.
本发明的核酸荧光定量检测组合物在制备同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的荧光定量试剂盒中的应用。
试剂盒包含有如权利要求1或2所述的猪轮状病毒检测引物和探针组合。
所述试剂盒中还包含有PCR预混液、酶预混液、无RNA酶水、阳性对照和阴性对照。
一种用于非治疗和非诊断目的A、B、C和H型猪轮状病毒病毒的核酸荧光定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1或2中任一项所述核酸荧光定量检测组合物或如权利要求4或5所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
7.根据权利要求6所述非治疗和非诊断目的的检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量检测方法，其特征在于：若阳性对照四个荧光通道Ct值＜30并出现S型扩增曲线，且阴性对照无Ct值，判定为结果成立；
当待测样本FAM通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒A型核酸为阳性；若无Ct值且无特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒A型核酸为阴性；
37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒A型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判判定为阳性，否则判定为阴性；
当待测样本HEX通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒C型核酸为阳性；如无Ct值且无特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒C型核酸为阴性；如37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒C型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判定为阴性；
当待测样本ROX通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒B型核酸为阳性；如无Ct值且无特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒B型核酸为阴性；如37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒B型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判为阴性。
当待测样本Cy5通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒H型的核酸为阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒H型核酸为阴性；如37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒H型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判为阴性。
在一些实施方案中本发明的组合物可以同时包括所述引物和探针中的一对或多对，在本发明中，“对”是指检测一个突变的互相匹配的上游(左引物)、下游(右引物)引物和探针。
举例来说，可以只包括轮状病毒A型检测引物探针组合物；可以只包括轮状病毒B型检测引物探针组合物；可以只包括轮状病毒C型检测引物探针组合物；可以只包括轮状病毒H型检测引物探针组合物。
再举例来说，本发明还可以只包括两对不同的检测引物探针组合物，例如轮状病毒A型检测引物探针组合物和轮状病毒B型检测引物探针组合物：轮状病毒A型检测引物探针组合物和轮状病毒C型检测引物探针组合物；轮状病毒A型检测引物探针组合物和轮状病毒H型检测引物探针组合物；轮状病毒B型检测引物探针组合物和轮状病毒C型检测引物探针组合物；轮状病毒B型检测引物探针组合物和轮状病毒H型检测引物探针组合物；轮状病毒C型检测引物探针组合物和轮状病毒H型检测引物探针组合物等等。
进一步举例来说，本发明还可以只包括三对不同的检测引物探针组合物，例如轮状病毒A型检测引物探针组合物、轮状病毒B型检测引物探针组合物和轮状病毒C型检测引物探针组合物；轮状病毒A型检测引物探针组合物、轮状病毒B型检测引物探针组合物和轮状病毒H型检测引物探针组合物；轮状病毒A型检测引物探针组合物、轮状病毒C型检测引物探针组合物和轮状病毒H型检测引物探针组合物；轮状病毒B型检测引物探针组合物、轮状病毒C型检测引物探针组合物和轮状病毒H型检测引物探针组合物等不同的组合物等等。
最后举例来说，本发明还可以包括四对不同的检测引物探针组合物，轮状病毒A型检测引物探针组合物、轮状病毒B型检测引物探针组合物、轮状病毒C型检测引物探针组合物和轮状病毒H型检测引物探针组合物等等。
进一步地，在本发明中检测引物探针组合物内的探针的荧光基团(常规材料)彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中的每个探针所用的荧光基团是属于不同的检测通道的，例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不相近，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物可用于荧光PCR程序。
在本发明中，荧光报告基团可以选择FAM、VIC、HEX、ROX、CY5、TAMARA、CY3和JOE等，但实施本发明不限于此。
进一步地探针的3’端还具有淬灭基团，例如BHQ1、BHQ2或MGB。
在一个具体的实施方案中，探针的3’端可以为BHQ1。
在一个具体的实施方案中，探针的3’端可以为为BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’端可以为MGB。
进一步地，所述猪轮状病毒A型引物对、猪轮状病毒A型探针、猪轮状病毒B型引物对、猪轮状病毒B型探针、猪轮状病毒C型引物对和猪轮状病毒C型探针、猪轮状病毒H型引物对、猪轮状病毒H型探针的终浓度可以为：0.2μM，0.2μM；0.4μM，0.3μM；0.2μM，0.2μM；0.3μM，0.3μM。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各构成部分分别存在于单独的包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各构成部分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备一种同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的检测试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括qRT-PCR预混液、酶预混液、无RNA酶水、阳性对照和阴性对照。
更进一步地，qRT-PCR预混液包括：荧光PCR buffer、dNTP；酶预混液包括：逆转录酶、Taq酶和RNA酶抑制剂；阳性对照包括：PoRVA、PoRVB、PoRVC、PoRVH的cDNA。阴性对照包括：无RNA酶水。
在一个具体的实施方案中，申请人提供了一种用于以非诊断目的的检测猪轮状病毒A、B、C和H型核酸的方法，该方法包括以下步骤：
提取或释放待测样本的核酸；
使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR程序包括55℃，10min；95℃，30s；95℃，5s；56℃，10s；60℃，20s；40个循环，每个循环的60℃时进行FAM、HEX、ROX、CY5荧光信号的采集。
更进一步地，上述待检样本的结果判定包括：若阳性对照四个荧光通道Ct值＜30并出现S型扩增曲线，且阴性对照无Ct值，可判定实验结果成立。
当待测样本FAM通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线时，判定为猪轮状病毒A型核酸阳性；若无Ct值且无特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒A型核酸阴性；当37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线时，判定为猪轮状病毒A型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，当复检结果若Ct值＜40判定为阳性，否则判定为阴性；
当待测样本HEX通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线时，判定为猪轮状病毒C型核酸阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒C型核酸阴性；37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒C型核酸可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值为＜40判定为阳性，否则判定为阴性。
当待测样本ROX通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线时，判定为猪轮状病毒B型核酸阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒B型核酸阴性；如37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒B型核酸可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，若复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判定为阴性。
当待测样本Cy5通道Ct值为≤37并出现特异的S型扩增曲线时，判为猪轮状病毒H型核酸阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判为猪轮状病毒H型核酸阴性；当37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线时，判定为猪轮状病毒H型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，若复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判定为阴性。
附图说明
图1：A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量检测试剂盒最佳反应条件的标准曲线。
图2：特异性实验得到的荧光扩增曲线图。
图3：梯度稀释的猪轮状病毒A型模板荧光扩增曲线图。
图4：梯度稀释的猪轮状病毒B型模板荧光扩增曲线图。
图5：梯度稀释的猪轮状病毒C型模板荧光扩增曲线图。
图6：梯度稀释的猪轮状病毒H型模板荧光扩增曲线图。
图7：实施例6中舍弃的轮状病毒A型引物、探针组合物与本发明设计组合物的轮状病毒A型核酸荧光扩增曲线图。
图8：实施例6中舍弃的轮状病毒B型引物、探针组合物与本发明设计组合物的轮状病毒B型核酸荧光扩增曲线图。
图9：实施例6中舍弃的轮状病毒C型引物、探针组合物与本发明设计组合物的轮状病毒C型核酸荧光扩增曲线图。
图10：实施例6中舍弃的轮状病毒H型引物、探针组合物与本发明设计组合物的轮状病毒H型核酸荧光扩增曲线图。
图11：对比实施例1中文献提供的检测组合物与本发明设计组合物的轮状病毒A型核酸荧光扩增曲线图。
图12：对比实施例1中文献提供的检测组合物与本发明设计组合物的轮状病毒B型核酸荧光扩增曲线图。
图13：对比实施例1中文献提供的检测组合物与本发明设计组合物的轮状病毒C型核酸荧光扩增曲线图。
图14：对比实施例1中文献提供的检测组合物与本发明设计组合物的轮状病毒H型核酸荧光扩增曲线图。
图15：本发明设计的探针引物的核苷酸序列。附图标记说明，括号中为显示碱基替换序列。
图16：是图15的简并密码子对照。
具体实施方式
对序列表的说明：
说明：下述序列列表中涉及有突变碱基的，录入说明书序列表时的碱基是突变后的碱基(含对比文献中涉及的其他序列如SEQ ID:13-24所示序列)。
SEQ ID NO:1是本发明的猪轮状病毒A型引物序列的左引物PoRVA-F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是本发明的猪轮状病毒A型引物序列的右引物PoRVA-R的核苷酸序列，
SEQ ID NO：3是本发明猪轮状病毒A型引物的探针PoRVA-P的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是本发明猪轮状病毒B型引物的左引物PoRVB-F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是本发明猪轮状病毒B型引物的右引物PoRVB-R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是本发明猪轮状病毒B型引物的探针PoRVB-P的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是本发明猪轮状病毒C型引物的左引物PoRVC-F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是本发明猪轮状病毒C型引物的右引物PoRVC-R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是本发明猪轮状病毒C型引物的探针PoRVC-P的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是本发明猪轮状病毒H型引物的左引物PoRVH-F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是本发明猪轮状病毒H型引物的右引物PoRVH-R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是本发明猪轮状病毒H型引物的探针PoRVH-P的核苷酸序列。
实施例1猪轮状病毒A、B、C和H型荧光定量PCR引物、探针的设计与合成
使用DNAman 6.0(Lyu Q,Jiao HH,Yu QR,et al.Zhongguo Zhong Yao ZaZhi.2021；46(15):3838-3845.doi:10.19540/j.cnki.cjcmm.20210523.103)分别对已知的猪轮状病毒A、B、C和H型基因序列进行同源性比较，找出各种病原基因序列的特异性保守序列，在保守序列的基础上，用AlleleID 6.0(Ma Q,Song L,Niu Z,et al.Red LightRegulates the Metabolite Biosynthesis in the Leaves of"Huangjinya"ThroughAmino Acid and Phenylpropanoid Metabolisms.Front Plant Sci.2022；12:810888.)设计寡核苷酸引物和探针。得到多对特异性引物和探针，经过比对筛选，最终分别确定一组最佳引物和探针，4对引物和探针分别为：
表1引物和探针序列
SEQ ID NO：4(PoRVB-F)和SEQ ID NO：5(PoRVB-R)中的“R“是A/G的简并碱基，SEQID NO：5,6,7中Y/K/N为简并碱基。
实施例2反应体系和反应条件的确定
筛选荧光定量PCR扩增反应的引物、探针最适浓度及反应最佳条件下的标准曲线如图1所示；通过优化筛选最终确定的荧光定量PCR检测方法的最佳引物、探针反应浓度分别为：
表2引物和探针浓度
| 引物、探针名称 | 序列编号 | 终浓度 |
| PoRVA-F | SEQ ID NO：1 | 0.2μM |
| PoRVA-R | SEQ ID NO：2 | 0.2μM |
| PoRVA-P | SEQ ID NO：3 | 0.2μM |
| PoRVB-F | SEQ ID NO：4 | 0.4μM |
| PoRVB-R | SEQ ID NO：5 | 0.4μM |
| PoRVB-P | SEQ ID NO：6 | 0.3μM |
| PoRVC-F | SEQ ID NO：7 | 0.2μM |
| PoRVC-R | SEQ ID NO：8 | 0.2μM |
| PoRVC-P | SEQ ID NO：9 | 0.2μM |
| PoRVH-F | SEQ ID NO：10 | 0.3μM |
| PoRVH-R | SEQ ID NO：11 | 0.3μM |
| PoRVH-P | SEQ ID NO：12 | 0.3μM |
表3PCR反应体系
| 体系组分 | 用量 |
| 2x qRT-PCR预混液 | 12.5μL |
| 酶预混液 | 1μL |
| 引物探针混合物 | 8μL |
| RNA | 2μL |
| 无RNA酶水 | 补齐至总体系25μL |
表4PCR反应条件
实施例3.引物、探针特异性的确定
以确定的反应体系和反应条件扩增猪常见病病原：其中包括：猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪瘟病毒；猪伪狂犬病毒；猪圆环病毒2型；猪圆环病毒3型；乙型脑炎病毒；猪细小病毒；猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；猪δ冠状病毒等以验证本发明的试剂盒的特异性，以猪轮状病毒A、B、C和H型标准品为对照。结果显示本发明的检测方法(试剂盒)只能特异性地扩增猪轮状病毒A、B、C和H型；而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒无特异性扩增信号(如图2所示)，说明本发明的检测方法具有良好的特异性。
实施例4敏感性检测
用已确定的反应体系和反应条件对倍比稀释的猪轮状病毒A、B、C和H型模板进行扩增，结果如图3-6所示。显示本发明的检测方法最低可以分别检测到4个拷贝的猪轮状病毒A型，10个拷贝的猪轮状病毒B型，5个拷贝的猪轮状病毒C型和10个拷贝的猪轮状病毒H型。表明本发明的检测方法的敏感性较为理想。
实施例5重复性试验
批内重复检测：将已知3个浓度的阳性样品在同一批试验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复试验：将已知3个浓度的阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。各选取3个已知浓度的猪轮状病毒A型、猪轮状病毒B型、猪轮状病毒C型和猪轮状病毒H型阳性样品，用已确定的反应体系和反应条件进行检测，检测结果如下：
表5批内和批间重复试验结果
实施例6本发明设计中效果不理想的引物和探针组合举例
发明人设计了一些不同靶标的引物和探针(序列未展示)组成组合物，用于检测猪轮状病毒检测，并与本发明最终筛选出的检测方法进行对比。具体检测结果见图7-10，由7-10中可以看出舍弃的组合物扩增曲线荧光强度低，灵敏度较差，甚至无扩增曲线。
对比实施例1本发明设计的引物和探针组合与已发表的文献中的引物探针组合使用效果比对
发明人通过合成《Assessing the Epidemiology of Rotavirus A,B,C and H inDiarrheic Pigs of Different Ages in Northern Italy》，4对引物和探针分别为：
表6参考引物和探针序列
R是A/G的简并碱基
上述4对引物和探针组成的引物和探针组合物与本发明最终筛选出的检测方法进行对比，具体检测结果如图11-14。由图11-14可以看出上述四组引物合探针组合物灵敏度低于本发明的检测方法，另外文献报道中的扩增反应是在2个反应体系中完成，而本发明是在1个反应体系中完成的。
Claims (7)
1.同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量组合物，其特征在于，所述组合物包括猪轮状病毒A型引物和探针序列,B型引物和探针序列,C型引物和探针序列以及H型引物和探针序列：
猪轮状病毒A型引物和探针序列：
PoRVA-F TGAATCGTCTTCTACAACGTCAAC(SEQ ID NO：1)
PoRVA-R TCGTTTGAAGCAGAATCAGATGG(SEQ ID NO：2)
PoRVA-P CTCTGGAGACTTCGACAACAT(探针序列SEQ ID NO：3)
猪轮状病毒B型引物和探针序列；
PoRVB-F GGATTAAATAR(A/G)CCCAACY(C/T)GR(A/G)CG(SEQ ID NO：4)；
其中R，Y，R为突变；
PoRVB-R TTB(G/T/C)AGATTY(C/T)GTR(A/G)TTTGGN(A/T/C/G)GCTA(SEQ ID NO：5)；其中B，Y，R，N为突变；
PoRVB-P AGCATGGATCTGATY(C/T)GAAACAGT(探针序列SEQ ID NO：6)；
其中Y为突变；
猪轮状病毒C型引物和探针序列；
PoRVC-F CATGTAGCATGAK(G/T)TCACGAATGGG(SEQ ID NO：7)；
其中K为突变；
PoRVC-R ACATTTCATCCTCCTGGGGATC(SEQ ID NO：8)；
PoRVC-P GCGTAGGGGCAAATGCGCATGA(探针序列SEQ ID NO：9)；
猪轮状病毒H型引物和探针序列：
PoRVH-F ACTTCAATCGTTGCTGCAACAG(SEQ ID NO：10)；
PoRVH-R TY(C/T)CTTTTGCTTCTGAGATCAAATCG(SEQ ID NO：11)；
其中Y为突变；
PoRVH-P TCGCTCATCCTAAGGCAAGAGGTATCCA(探针序列SEQ ID NO：12)。
2.根据权利要求1所述的同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量检测组合物，其特征在于，所述检测引物探针组合物中的各探针标记了荧光基团且荧光基团彼此互不相同且互不干扰；所述组合物以混合的形式存在；所述猪轮状病毒A型探针序列PoRVA-P的5’端用FAM修饰；3’端用BHQ1修饰；所述猪轮状病毒B型探针序列PoRVB-P的5’端用ROX修饰，3’端用MGB修饰；所述猪轮状病毒C型探针序列PoRVC-P的5’端用HEX修饰，3’端用BHQ1修饰；所述猪轮状病毒H型探针序列PoRVH-P的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰。
3.权利要求1或2核酸荧光定量检测组合物在制备同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的荧光定量试剂盒中的应用。
4.同时检测A、B、C和H型猪轮状病毒核酸的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有如权利要求1或2所述的猪轮状病毒检测引物和探针组合。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含有PCR预混液、酶预混液、无RNA酶水、阳性对照和阴性对照。
6.一种用于非治疗和非诊断目的A、B、C和H型猪轮状病毒病毒的核酸荧光定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1或2中所述核酸荧光定量检测组合物或权利要求4或5所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析；
3)获得并分析结果。
7.根据权利要求6所述非治疗和非诊断目的的检测A、B、C和H型猪轮状病毒的核酸荧光定量检测方法，其特征在于：若阳性对照四个荧光通道Ct值＜30并出现S型扩增曲线，且阴性对照无Ct值，判定为结果成立；
当待测样本FAM通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒A型核酸为阳性；若无Ct值且无特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒A型核酸为阴性；
当37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定为猪轮状病毒A型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判判定为阳性，否则判定为阴性；
当待测样本HEX通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒C型核酸为阳性；如无Ct值且无特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒C型核酸为阴性；如37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒C型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判定为阴性；
当待测样本ROX通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒B型核酸为阳性；如无Ct值且无特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒B型核酸为阴性；如37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒B型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判为阴性。
当待测样本Cy5通道Ct值≤37并出现特异的S型扩增曲线，判定猪轮状病毒H型的核酸为阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒H型核酸为阴性；如37＜CT值＜40并出现特异的扩增曲线，判定猪轮状病毒H型核酸为可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，如复检结果Ct值＜40判定为阳性，否则判为阴性。
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