CN115927481A - 一种乌鳢显微注射的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于水产动物遗传育种和功能基因验证研究领域，提供了一种乌鳢显微注射的方法及应用，其中，乌鳢显微注射的方法包括以下步骤：以靶基因的反义吗啉环寡核苷酸或外源mRNA作为注射试剂；将注射试剂与注射指示剂进行混合，得到混合物；在乌鳢卵子受精后的30分钟内向单细胞期的乌鳢受精卵进行显微注射，将混合物导入乌鳢受精卵中。该方法是第一次建立乌鳢胚胎的显微注射方法，并首次应用于反义吗啉环寡核苷酸基因敲降和构建外源mRNA表达模型，该技术既可用于研究乌鳢基因功能，又能用于精准修饰乌鳢内源基因，为乌鳢的基因改良遗传育种提供强有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于水产动物遗传育种和功能基因验证研究领域，尤其涉及一种乌鳢显微注射的方法及应用。
背景技术
乌鳢(Channa argus)隶属鲈形目(Perciformes)、鳢科(Channidae)、鳢属(Channa)，俗称黑鱼、生鱼、乌鱼、财鱼等，是我国重要的淡水经济鱼类，分布范围较广，北至黑龙江流域南至四川、云南、广东。乌鳢体色较深呈灰黑色，头部和体背侧对称排列的不规则斑块。金乌鳢(Albino Channa argus)是野生乌鳢体色相关基因突变产生的一种白化品系，与之前报道四川省嘉陵江中下游流域出现的白甲乌鳢不同的是金乌鳢体表呈金黄色，眼球为深红色，金乌鳢与野生乌鳢两者除体色以及眼球颜色差异外极其相似，金乌鳢因其通体金黄色具有较高的市场价值。
近年来，我国多种经济鱼类遗传育种工作相继开展，而乌鳢也培育出了多个新品种，如“玉龙1号”、“雄鳢1号”等。然而目前乌鳢的遗传育种工作还主要基于传统的人工选育方法，全基因组选择育种及分子辅助选择育种等技术在乌鳢遗传育种中还并未得到真正应用，这其中主要限制因素是大部分基因的功能尚不清楚。目前乌鳢中开展的基因功能研究，主要限于基因克隆和表达模式分析。
在高等动物和模式动物中，显微注射技术在基因功能研究中已得到广泛应用，从早期的TALENs、ZFNs基因编辑，到近几年的CRISPR/Cas9基因编辑技术。利用基因编辑和转基因技术研究者阐明了越来越多的基因功能，而显微注射技术是进行鱼类转基因或者基因编辑的经典手段，适合采用显微注射法的鱼卵具有卵壳柔软、透明、沉性卵，而且动物极清晰的特点。但是，乌鳢受精卵为浮性卵，卵内压较大，且动物极在下方难以翻转，存在不适宜进行胚胎显微操作的问题。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种乌鳢显微注射的方法，旨在解决背景技术中提出的问题。
针对上述问题，本发明提供了一种乌鳢显微注射的方法，可以利用该方法对乌鳢进行基因转移以及基因的精准编辑，为开展乌鳢基因的功能研究和乌鳢养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。
具体的，本发明实施例是这样实现的，一种乌鳢显微注射的方法，其包括以下步骤：
以靶基因的反义吗啉环寡核苷酸(MO)或外源mRNA作为注射试剂；
将注射试剂与注射指示剂进行混合，得到混合物；
在乌鳢卵子受精后的30分钟内向单细胞期的乌鳢受精卵进行显微注射，将混合物导入乌鳢受精卵中。
作为本发明的一个优选方案，外源mRNA为体外转录乌鳢slc45a2 mRNA；乌鳢slc45a2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的一个优选方案，靶基因的反义吗啉环寡核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
作为本发明的一个优选方案，所述注射指示剂为酚红溶液。
作为本发明的一个优选方案，所述混合物中，反义吗啉环寡核苷酸的终浓度为0.5-1.5mM，或外源mRNA的终浓度为150-250ng/μL。
作为本发明的一个优选方案，乌鳢受精卵的制备方法包括以下步骤：
挑选性成熟的雌雄乌鳢亲鱼分别暂养在养殖系统中，注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物混合物进行人工催产繁殖；
隔20-28小时，雌性乌鳢再注射双羟孕酮，注射20-28小时后，分别挤出精液和卵子到无菌干燥的环境中加入Danieau缓冲液进行人工授精，缓慢晃动混匀，静置，受精完成即可得到单细胞期的乌鳢受精卵。
作为本发明的一个优选方案，雌性乌鳢的绒毛膜促性腺激素注射剂量为1800-2200IU/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的促黄体素释放激素类似物注射剂量为4-6μg/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的双羟孕酮注射剂量为1-3mg/kg体重。
作为本发明的一个优选方案，所述乌鳢包括乌鳢及其体色变异品系金乌鳢。
作为本发明的一个优选方案，导入的方法为：使用外径为1.0mm、内径0.75mm、尖端长度2.0-2.5mm、尖端内径为2-3μm的注射毛细管针进行注射。
本发明实施例的另一个目的在于提供一种上述方法在乌鳢基因敲降或乌鳢外源基因转入中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
显微注射技术是进行鱼类转基因或者基因编辑的经典手段，适合采用显微注射法的鱼卵具有卵壳柔软、透明、沉性卵，而且动物极清晰的特点。但是，乌鳢受精卵为浮性卵，卵内压较大，且动物极在下方难以翻转，存在不适宜进行胚胎显微操作的问题。针对上述问题，申请人发现从上方穿过卵黄可从动物极背侧导入，注射毛细管针尖端长度2.0-2.5mm，尖端内径2-3μm，可以成功实施显微注射操作。
目前没有任何乌鳢受精卵的显微注射相关技术报道，本发明提供了一种乌鳢显微注射的方法，利用显微注射方法成功的将MO或mRNA导入至乌鳢受精卵，并最终获得了乌鳢基因敲降和表型回救个体，首次建立了乌鳢的基因显微注射技术，为以后开展乌鳢基因的功能研究和遗传改良提供了强有力的技术基础。
附图说明
图1为乌鳢受精卵的显微注射示意图。
图2为体外转录slc45a2 mRNA用pcDNA3.1(+)载体的结构及序列连接的位置示意图。
图3的A为显微注射slc45a2的ATG-MO进行基因敲降后的阳性及对照组个体表型；
图3的B为显微注射slc45a2 mRNA对金乌鳢白化表型进行回救后的阳性及对照组个体表型。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的一个实施例中，提供了一种乌鳢显微注射的方法，其包括以下步骤：
以靶基因的反义吗啉环寡核苷酸或外源mRNA作为注射试剂；
将注射试剂与注射指示剂进行混合，得到混合物；
在乌鳢卵子受精后的30分钟内向单细胞期的乌鳢受精卵进行显微注射，将混合物导入乌鳢受精卵中。
具体的，外源mRNA为体外转录乌鳢slc45a2 mRNA；乌鳢slc45a2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
ATGACCCTGTTATCAGAGGACCAGTCTGCGAGGCCTCAACCCCATCGGCTCCCAGAGCCGGACAAACACATCAGCTCTTCCTTTCACCAGCACTCAACTGACTACACTGTCTCCAAAGGGGACTACGTGAACAGCGAGGAGGGTGCTGTGTTTGGAGCTGTGGAGCCCCCCAGGCGCTCTCTAGGCCGCCTAATCCTCCATGGCCTGGTCATGTTTGGAAGGGAATTCTGCTATGCCGTGGAGGCAGCATTCGTCACGCCAGTACTCCTGAGTGTGGGCCTTCCCCGCAGCCTCTACAGCTTGGTGTGGCTGATCAGCCCCATACTAGGCTTCTTGCTCCAGCCTATCATCGGCTTAGCCAGCGACCACTGCCGCTCAGCGTGGGGCAGGCGGAGGCCTTACATCCTTGCCCTGGGCATCCTTATGCTGGTGGGAACCACCCTGTTCTTAAACGGGGATGCTATCATCTCAGCACTAGTGAGTGACATCTCACTGAGGAGGATATGGGCCATAGTGGTGGTGATGTTTGGAGTCGTGCTGTTTGACTTTGCTGCGGACTTCATCGACGGGCCCATCAAGGCCTACCTGTTTGACGTGTGTTCACACCAAGACAAGGAACGAGGCCTGCACTGCCATGCTCTACTCACAGGTCTGGGCGGCGCATGTGGATACTTGGTGGGAGCTATGGACTGGGGACATTCTGTGTTGGGTCGACTGCTGGGCTCTGAGTACCAAGTCATCTACTTCTTCTCAGCGATGACTTGGGGCATCTTTCTCATTGTGCACCTCTTCAGTATCCCGGAGCAACCTCTGGGCAAGGATCGATGTGCCTCTGTGTCCTCACACACCAGTGCTCTGCACCTACTGGGCTCCCACAGCAATGGCTATGGAACACTGGCTAAAGAGCCCGTCTCTCCTGTAGTGCCAGCATCTTTACCGGACCTCAGACCAAGGTCTTTCTCTGCTCTGGGAGAGGCTAACTCAGTGACCTCCAGCGTCAAGCAGCCAAACA AAGAGGCTCAGAAGAGGATGACATTTAGGTCTCTGATGGAAGCTATCATCAACATGCCAAACCACTACCGCTGCCTGTGTGTCAGTCACCTGCTGGGATGGACAGCTTTCCTCTGCAATATGCTCTTCTTCACTGATTTTATGGGACAGATTGTATACAAGGGAAATCCTTATGCAGCCCACAACTCTACAGCTTATGCAACATATGAGAGAGGAGTCGAAATAGGCTGCTGGGGACTGTGCATTAATGCTGTTTCTTCTGCCCTCTACTCCTATGTGCAGCGGTTCCTTCTCCCCTACATTGGCCTGAAAGGATTATACTTTGTAGGCTATTTTGCCTTCGGCATGGGCACCAGCCTGATCGGCCTCTTCCCCAACATCATTGCCACGCTCATCCTCTGCAGCGTGTTCGGCATCATGTCCAGCACACTTTACACCATCCCATACAACCTGGTAGCAGAGTATCAACGTGAGGAGGAGGTACAACAGAAGCCACGAGGGAGCAACGAAAGCCTGCGAGGCTCCGGGGTAGACTGTGCGGCGCTCACCTGCATGGTCCAGCTGGCTCAGATTTTAGTGGGCGCAGGGCTCGGTGCTCTGGTCAACATGGCAGGAAGTGTAATTGTGGTGGTCCTCTCAGCCGCGACCGTGTCCTTGTTAGGCTGCATCTTCATCGCCCTCTTTGTCAGATATGTGGATTGA。
靶基因的反义吗啉环寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5'-GTCCTCTGATAACAGGGTCATGGT-3'。
优选地，所述注射指示剂为酚红溶液。
综上所述，上述显微注射的方法所采用的注射体系为注射试剂和注射指示剂；其中，注射试剂包括用于基因敲降的反义吗啉环寡核苷酸(MO)和用于白化表型回救的体外转录mRNA，MO浓度为1-3mM，mRNA浓度为300-500ng/μL；注射指示剂为0.1％的酚红溶液。
优选地，所述混合物中，反义吗啉环寡核苷酸的终浓度为0.5-1.5mM，或外源mRNA的终浓度为150-250ng/μL；也就是说，反义吗啉环寡核苷酸或外源m RNA可以与酚红溶液按照等体积比进行混合。
另外，每个受精卵注射所述混合物的体积为1-3nL。
优选地，乌鳢受精卵的制备方法包括以下步骤：
挑选性成熟的雌雄乌鳢亲鱼分别暂养在养殖系统中，注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物混合物进行人工催产繁殖；
隔20-28小时，雌性乌鳢再注射双羟孕酮，注射20-28小时后，分别挤出精液和卵子到无菌干燥的环境中加入Danieau缓冲液进行人工授精，缓慢晃动混匀，静置，受精完成即可得到单细胞期的乌鳢受精卵。
具体的，雌性乌鳢的绒毛膜促性腺激素注射剂量为1800-2200IU/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的促黄体素释放激素类似物注射剂量为4-6μg/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的双羟孕酮注射剂量为1-3mg/kg体重。
优选地，激素注射方法为胸鳍基部注射。
优选地，所述的Danieau缓冲液的组成如下：17mM NaCl，2mM KCl，0.12mM MgSO4，1.8mM Ca(NO3)2，1.5mM HEPES，pH＝7.6。
作为本发明的一个优选方案，所述乌鳢包括乌鳢及其体色变异品系金乌鳢。
作为本发明的一个优选方案，导入的方法为：使用外径为1.0mm、内径0.75mm、尖端长度2.0-2.5mm、尖端内径为2-3μm的注射毛细管针进行注射；具体的，使用注射毛细管针从上方穿过卵黄可从动物极背侧进行注射导入。
在本发明的一个实施例中，还提供一种上述方法在乌鳢基因敲降或乌鳢外源基因转入中的应用。
下面结合具体的实施例以及实验对本发明的技术方案作进一步说明，但不构成对本发明的限制。
实施例1
该实施例提供了一种单细胞期的乌鳢受精卵的制备方法，具体包括以下步骤：
挑选性成熟的雌雄乌鳢亲鱼(雌性亲鱼体重～2kg，雄性亲鱼体重～1.5kg)分别暂养在养殖系统中，注射绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体素释放激素类似物(LHRH-A3)混合物进行人工催产繁殖；雌鱼注射剂量为2000IU HCG+5μg LHRH-A3/kg体重，雄鱼剂量减半；隔24小时左右，雌性乌鳢再注射双羟孕酮(DHP)2mg/kg体重，注射24小时后，分别挤出精液和卵子到无菌干燥的烧杯中加入Danieau缓冲液进行人工授精，缓慢晃动混匀，静置10min受精完成即可得到单细胞期的乌鳢受精卵，备用。
实施例2
该实施例提供了一种乌鳢显微注射的方法在基因敲降中的应用，具体包括下述步骤：
S1、显微注射用反义吗啉环寡核苷酸(MO)的制备：
利用乌鳢slc45a2的全长序列，序列信息如SEQ ID NO：1所示，在5’AT G翻译起始位点设计了一个特异性铸锻mRNA翻译ATG-MO，靶向slc45a2的A TG-MO和标准对照MO均来自Gene Tools(https://www.gene-tools.com/)。序列设计如下：slc45a2_atg MO:5'-GTCCTCTGATAACAGGGTCATGGT-3'(如SE Q ID NO.2所示)，标准对照MO：5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTATTA-3'(如SEQ ID NO.3所示)。将1mM反义吗啉环寡核苷酸(MO)与0.1％酚红溶液等体容积混合后，MO终浓度为1mM，用于显微注射。
S2、以1mM浓度显微注射反义吗啉环寡核苷酸(MO)进行基因敲降：
将获得受精卵置于显微注射培养皿上(实施例1制备)，在体式显微镜下用显微注射仪对受精卵进行显微注射(如图1所示)，将反义吗啉环寡核苷酸(sl c45a2 MO)和0.1％的酚红溶液的等体积比混合液导入到受精卵中；其中，导入方法为：使用外径为1.0mm、内径0.75mm、尖端长度2.0mm、尖端内径为2μm的注射毛细管针从上方穿过卵黄可从动物极背侧进行注射导入，MO注射浓度为1mM，每颗受精卵注射注射体积为2nL，对照组注射等体积标准对照MO。注射后，将胚胎在26℃培养至出膜。从受精后24h黑色素开始出现时，开始观察胚胎的表型，并用SZ810体视显微镜(CNOPTEC，China)拍摄记录并统计存活率和阳性率，实验组(slc45a2 MO)存活率约为80％，阳性率为65％；对照组(标准对照MO)存活率约为76％，阳性率为0％(具体如图3的A所示)。
实施例3
该实施例提供了一种金乌鳢单细胞期受精卵的制备方法，具体包括以下步骤：
挑选性成熟的金乌鳢雌雄亲鱼(雌性亲鱼体重～2kg，雄性亲鱼体重～1.5kg)分别暂养在养殖系统中，注射绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体素释放激素类似物(LHRH-A3)混合物进行人工催产繁殖；雌鱼注射剂量为2000IU HCG+5μg LHRH-A3/kg体重，雄鱼剂量减半；隔24小时左右，雌性乌鳢再注射双羟孕酮(DHP)2mg/kg体重，注射24小时后，分别挤出精液和卵子到无菌干燥的烧杯中加入Danieau缓冲液进行人工授精，缓慢晃动混匀，静置10min受精完成即可得到金乌鳢单细胞期的受精卵，备用。
实施例4
该实施例提供了一种乌鳢显微注射的方法在外源mRNA回救表型的应用，具体包括下述步骤：
S1、显微注射用slc45a2 mRNA制备：
利用引物slc45a2-HindⅢF:5′-CTAGCGTTTAAACTTAAGCTTATGACCCTGTTATCAGAGGACCA-3′(如SEQ ID NO.4所示)和slc45a2-BamHⅠR:5′-C CACACTGGACTAGTGGATCCTCAATCCACATATCTGACAAAGAGG-3′(如S EQ ID NO.5所示)从乌鳢cDNA中扩增出slc45a2的全长序列。如图2所示，使用ClonExpress Ultra One-Step克隆试剂盒(Vazyme，中国)将产物连接到pc DNA3.1(+)载体上。通过Sanger测序验证得到的质粒，使用T7 High YieldRNA Transcription试剂盒(Vazyme，中国)体外转录出mRNA。测得浓度为1650n g/μL，取部分slc45a2 mRNA稀释至400ng/μL与0.1％酚红溶液等体容积混合后，mRNA终浓度为200ng/μL，用于显微注射。
S2、以200ng/μL浓度显微注射slc45a2 mRNA进行金乌鳢表型回救：
将获得金乌鳢受精卵置于显微注射培养皿上(实施例3制备)，在体式显微镜下用显微注射仪对受精卵进行显微注射，将slc45a2 mRNA和0.1％的酚红溶液的等体积比混合液导入到受精卵中；其中，导入方法为：使用外径为1.0mm、内径0.75mm、尖端长度2.5mm、尖端内径为3μm的注射毛细管针从上方穿过卵黄可从动物极背侧进行注射导入，mRNA注射浓度为200ng/μL，每颗受精卵注射注射体积为2nL，对照组注射为等体积生理盐水。注射后，将胚胎在26℃培养至出膜。从受精后24h黑色素开始出现时，开始观察胚胎的表型，并用SZ810体视显微镜(CNOPTEC，China)拍摄记录并统计存活率和阳性率，实验组存活率约为72％，阳性率为54％；对照组存活率约为70％，阳性率为0％(具体如图3的B所示)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以靶基因的反义吗啉环寡核苷酸或外源mRNA作为注射试剂；
将注射试剂与注射指示剂进行混合，得到混合物；
在乌鳢卵子受精后的30分钟内向单细胞期的乌鳢受精卵进行显微注射，将混合物导入乌鳢受精卵中。
2.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，外源mR NA为体外转录乌鳢slc45a2 mRNA；乌鳢slc45a2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，靶基因的反义吗啉环寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，所述注射指示剂为酚红溶液。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，所述混合物中，反义吗啉环寡核苷酸的终浓度为0.5-1.5mM，或外源mRN A的终浓度为150-250ng/μL。
6.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，乌鳢受精卵的制备方法包括以下步骤：
挑选性成熟的雌雄乌鳢亲鱼分别暂养在养殖系统中，注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物混合物进行人工催产繁殖；
隔20-28小时，雌性乌鳢再注射双羟孕酮，注射20-28小时后，分别挤出精液和卵子到无菌干燥的环境中加入Danieau缓冲液进行人工授精，缓慢晃动混匀，静置，受精完成即可得到单细胞期的乌鳢受精卵。
7.根据权利要求6所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，雌性乌鳢的绒毛膜促性腺激素注射剂量为1800-2200IU/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的促黄体素释放激素类似物注射剂量为4-6μg/kg体重，雄性乌鳢剂量减半；雌性乌鳢的双羟孕酮注射剂量为1-3mg/kg体重。
8.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，所述乌鳢包括乌鳢及其体色变异品系金乌鳢。
9.根据权利要求1所述的一种乌鳢显微注射的方法，其特征在于，导入的方法为：使用外径为1.0mm、内径0.75mm、尖端长度2.0-2.5mm、尖端内径为2-3μm的注射毛细管针进行注射。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述方法在乌鳢基因敲降或乌鳢外源基因转入中的应用。
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