CN115927238A

CN115927238A - 甘草氧甲基转移酶及其应用

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Publication number: CN115927238A
Application number: CN202211302975.0A
Authority: CN
Inventors: 王瑛; 李勇青; 黄韵; 梁晓菊
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-10-24
Also published as: CN115927238B

Abstract

本发明属于基因工程技术和酶学领域，具体涉及甘草氧甲基转移酶及其应用。本发明首次公开了甘草氧甲基转移酶，该甘草氧甲基转移酶可用于催化类黄酮物质的甲基化。

Description

甘草氧甲基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术和酶学领域，具体涉及甘草氧甲基转移酶及其应用。

背景技术

黄酮类化合物是植物中广泛存在的一类次生代谢产物，在植物的生长发育及胁迫抵御方面发挥着重要作用。研究表明，许多黄酮类化合物具有优秀的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性，因此广泛应用于医疗、化妆品、食品等行业。

黄酮类化合物可以通过多种修饰反应，引入各种取代基，从而形成功能多样的衍生物。其中，甲基化修饰是最基本，也是最重要的一种。已有文献报道多甲基化修饰可以增加黄酮类化合物的生物活性和生物利用度，如白杨素的甲基化可以提高其在小肠内的抗炎能力，黄芩素的甲基化可以提高其抗癌能力，且抑癌活性随甲基化的程度增加而增加。

目前多甲基化类黄酮的获取主要依靠植物天然产物分离纯化和化学合成两种方法，但存在生产成本高、产量低且工艺复杂的问题。而使用生物工程技术的酶法合成在生产上具有成本更低、效率更高的优势。

在植物体内，甲基化修饰是由氧甲基转移酶(O-methyltransferase，OMT)完成的。目前，已报道的植物类黄酮OMT的催化位点主要以单甲基化(3、6、7、8、2'、3'和4'位)和二甲基化(3/5、3/7、6/7、7/3'、7/4'、3'/4'、3'/5'位)为主，极少数类黄酮OMT能催化三个及以上(7/3'/5'、3'/4'/5'、3/5/7/3'、5/6/7/8/3')的位点。据报道，柑橘CitOMT2能催化多种类黄酮的3'/5'位甲基化，以及黄芩素的7位甲基化，但不能连续催化7/3'/5'三甲基化；小麦TaOMT2能连续催化五羟黄酮生成3'/4'/5'三甲基化产物，但对黄酮醇类化合物的催化活性低，且产物未鉴定；柑橘CdOMT5能连续催化槲皮素的3/5/7/3'位四甲基化，是目前唯一报道具有连续催化类黄酮四甲基化活性的OMT；黄芩中PFOMT5可以催化2',5,7,8-tetrahydroxyflavone的8-OH单甲基化、催化木犀草素的3'-OH单甲基化，以及催化黄芩素生成6、7、6/7、5/7甲基化的产物，因此对黄酮的5/6/7/8/3'位均有催化活性，但无法连续催化底物生成多甲基化产物，且未对其它类型的类黄酮底物进行测试。甘草中含有300多种类黄酮，具有多种甲基化位点，说明存在多种具有不同催化特异性的OMT，因此从甘草中鉴定OMT进行氧甲基化类黄酮的酶法合成有着广阔的应用前景。但是尚未发现对具有连续催化黄酮醇类和二氢黄酮醇类化合物3'/4'/5'位三甲基化活性的甘草氧甲基转移酶。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供甘草氧甲基转移酶GiOMT4。

本发明第二方面的目的，在于提供与本发明第一方面的甘草氧甲基转移酶相关的生物材料。

本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的甘草氧甲基转移酶的制备方法。

本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的甘草氧甲基转移酶和/或本发明第二方面的生物材料和/或本发明第三方面的制备方法的应用。

本发明第五方面的目的，在于提供一种方法。

本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供甘草氧甲基转移酶GiOMT4，其氨基酸序列包含a1)～a3)中任一种：

a1)SEQ ID NO.1；

a2)将SEQ ID NO.1经过一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

a3)与SEQ ID NO.1具有99％或98％的同源性且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

所述甘草氧甲基转移酶GiOMT4来源于‘Gjj9’品种的胀果甘草，在甘草中首次发现，属于I类氧甲基转移酶。

本发明的第二个方面，提供与本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶相关的生物材料，所述生物材料为b1)～b8)中任一种：

b1)编码本发明第一方面的甘草氧甲基转移酶的核酸分子；

b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)包含b1)所述核酸分子的载体；

b4)包含b2)所述表达盒的载体；

b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；

b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；

b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；

b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。

优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

优选地，所述载体为pColdII。

优选地，所述转基因细胞为大肠杆菌细胞BL21(DE3)。

优选地，所述核酸分子的序列包含a1)～a3)中任一种：

a1)SEQ ID NO.2；

a2)将SEQ ID NO.2经过一个或多个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.2所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；

a3)与SEQ ID NO.2具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.2所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。

本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶的制备方法，通过培养本发明第二个方面中所述的转基因细胞系表达所述甘草氧甲基转移酶。

优选地，所述转基因细胞系为将pColdII-GiOMT4导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白的转基因细胞系，所述pColdII-GiOMT4为将载体pColdII的KpnI和SalI位点之间的序列替换为SEQ ID No.2所示的DNA片段得到的重组载体。

优选地，所述表达为诱导表达。

优选地，所述诱导表达通过IPTG诱导。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶和/或本发明第二个方面的生物材料和/或本发明第三个方面的制备方法的应用。

c1)～c3)中至少一种在d1)～d13)中至少一种中的应用；

c1)本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶；

c2)本发明第二个方面的生物材料；

c3)本发明第三个方面的制备方法；

d1)催化类黄酮物质的甲基化；

d2)制备催化类黄酮物质的甲基化的产品；

d3)合成物质A；

d4)制备合成物质A的产品；

d5)合成物质B；

d6)制备合成物质B的产品；

d8)合成物质C；

d9)制备合成物质C的产品；

d10)合成物质D；

d11)制备合成物质D的产品；

d10)合成物质E；

d11)制备合成物质E的产品；

d12)合成物质F；

d13)制备合成物质F的产品；

所述物质A包含：异鼠李素、怪柳黄素和五桠果素中的至少一种；

所述物质B包含：3'-O-甲基二氢槲皮素、二氢怪柳黄素和3',4'-O-二甲基二氢槲皮素中的至少一种；

所述物质C包含：金圣草黄素、香叶木素和3',4'-O-二甲基木犀草素中的至少一种；

所述物质D包含：高圣草酚、橙皮素和3',4'-O-二甲基圣草酚中的至少一种；

所述物质E包含：3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基黄酮、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基黄酮、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基黄酮、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基黄酮中的至少一种；

所述物质F包含：3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基二氢黄酮、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基二氢黄酮、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基二氢黄酮、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基二氢黄酮中的至少一种。

优选地，所述类黄酮物质包含：黄酮醇、二氢黄酮醇、黄酮、二氢黄酮中的至少一种。

优选地，所述黄酮醇包含：槲皮素、杨梅素中的至少一种。

优选地，所述二氢黄酮醇包含：二氢槲皮素、二氢杨梅素中的至少一种。

优选地，所述黄酮包含：木犀草素。

优选地，所述二氢黄酮包含：圣草酚。

优选地，所述合成物质A的原料包含：槲皮素；即催化槲皮素生成物质A。

优选地，所述合成物质B的原料包含：二氢槲皮素；即催化二氢槲皮素生成物质B。

优选地，所述合成物质C的原料包含：木犀草素；即催化木犀草素生成物质C。

优选地，所述合成物质D的原料包含：圣草酚；即催化圣草酚生成物质D。

优选地，所述合成物质E的原料包含：杨梅素；即催化杨梅素生成物质E。

优选地，所述合成物质F的原料包含：二氢杨梅素；即催化二氢杨梅素生成物质F。

优选地，所述催化类黄酮物质的甲基化包含e1)～e6)中任一种：

e1)催化槲皮素的以下位点中至少一个或两个发生甲基化：3'、4'；

e2)催化二氢槲皮素的以下位点中至少一个或两个发生甲基化：3'、4'；

e3)催化木犀草素的以下位点中至少一个或两个发生甲基化：3'、4'；

e4)催化圣草酚的以下位点中至少一个或两个发生甲基化：3'、4'；

e5)催化杨梅素的以下位点中的至少一个、两个或三个发生甲基化：3'、4'、5'；

e6)催化二氢杨梅素的以下位点中的至少一个、两个或三个发生甲基化：3'、4'、5'。

优选地，所述催化类黄酮物质的甲基化包含f1)～f16)中任一种：

f1)催化槲皮素的以下位点发生甲基化：3'；

f2)催化槲皮素的以下位点发生甲基化：3'和4'；

f3)催化二氢槲皮素的以下位点发生甲基化：3'；

f4)催化二氢槲皮素的以下位点发生甲基化：3'和4'；

f5)催化木犀草素的以下位点发生甲基化：3'；

f6)催化木犀草素的以下位点发生甲基化：3'和4'；

f7)催化圣草酚的以下位点发生甲基化：3'；

f8)催化圣草酚的以下位点发生甲基化：3'和4'；

f9)催化杨梅素的以下位点发生甲基化：4'；

f10)催化杨梅素的以下位点发生甲基化：3'和4'；

f11)催化杨梅素的以下位点发生甲基化：3'和5'；

f12)催化杨梅素的以下位点发生甲基化：3'、4'和5'；

f13)催化二氢杨梅素的以下位点发生甲基化：4'；

f14)催化二氢杨梅素的以下位点发生甲基化：3'和4'；

f15)催化二氢杨梅素的以下位点发生甲基化：3'和5'；

f16)催化二氢杨梅素的以下位点发生甲基化：3'、4'和5'。

本发明的第五个方面，提供如下g1)～g6)中任一种方法：

g1)一种合成物质A的方法，将槲皮素和本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质A；

g2)一种合成物质B的方法，将二氢槲皮素和本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质B；

g3)一种合成物质C的方法，将木犀草素和本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质C；

g4)一种合成物质D的方法，将圣草酚和本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质D；

g5)一种合成物质E的方法，将杨梅素和本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质E；

g6)一种合成物质F的方法，将二氢杨梅素和本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质F；

优选地，所述混合物中还包含：缓冲液、S-腺苷甲硫氨酸中的至少一种。

优选地，所述缓冲液包含Tris-HCl。

本发明的第六个方面，提供一种产品，包含：本发明第一个方面的甘草氧甲基转移酶和/或本发明第二个方面的生物材料；

所述产品包含试剂和试剂盒中的至少一种。

优选地，所述产品还包含：类黄酮物质。

优选地，所述黄酮醇包含：槲皮素、杨梅素中的至少一种。

优选地，所述黄酮包含：木犀草素。

优选地，所述二氢黄酮包含：圣草酚。

优选地，所述产品还包含：缓冲液、S-腺苷甲硫氨酸中的至少一种。

优选地，所述缓冲液包含Tris-HCl。

优选地，所述产品具有h1)～h6)中至少一种功能：

h1)合成物质A；

h2)合成物质B；

h3)合成物质C；

h4)合成物质D；

h5)合成物质E；

h6)合成物质F；

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了甘草氧甲基转移酶，该甘草氧甲基转移酶可用于催化类黄酮物质的甲基化。

进一步地，该甘草氧甲基转移酶可用于催化槲皮素、杨梅素等黄酮醇、二氢槲皮素、二氢杨梅素等二氢黄酮醇、木犀草素等黄酮、圣草酚等二氢黄酮的甲基化，制备得到3'-O-甲基槲皮素、4'-O-甲基槲皮素、3',4'-O-二甲基槲皮素、3'-O-甲基二氢槲皮素、4'-O-甲基二氢槲皮素、3',4'-O-二甲基二氢槲皮素、3'-O-甲基木犀草素、4'-O-甲基木犀草素、3',4'-O-二甲基木犀草素、3'-O-甲基圣草酚、4'-O-甲基圣草酚、3',4'-O-二甲基圣草酚、3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基黄酮、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基黄酮、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基黄酮、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基黄酮、3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基二氢黄酮、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基二氢黄酮、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基二氢黄酮、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基二氢黄酮等物质。

附图说明

图1是蛋白凝胶电泳检测GiOMT4蛋白表达的结果图。

图2是HPLC检测GiOMT4催化山奈酚的结果图。

图3是HPLC检测GiOMT4催化槲皮素的结果图。

图4是HPLC检测GiOMT4催化杨梅素的结果图。

图5是HPLC检测GiOMT4催化二氢槲皮素的结果图。

图6是HPLC检测GiOMT4催化二氢杨梅素的结果图。

图7是HPLC检测GiOMT4催化芹菜素的结果图。

图8是HPLC检测GiOMT4催化木犀草素的结果图。

图9是HPLC检测GiOMT4催化柚皮素的结果图。

图10是HPLC检测GiOMT4催化甘草素的结果图。

图11是HPLC检测GiOMT4催化圣草酚的结果图。

图12是HPLC检测GiOMT4催化3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基二氢黄酮、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基二氢黄酮、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基二氢黄酮、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基二氢黄酮的结果图。

图13是质谱鉴定GiOMT4催化槲皮素的产物的结果图。

图14是质谱鉴定GiOMT4催化杨梅素的产物的结果图。

图15是质谱鉴定GiOMT4催化二氢杨梅素的产物的结果图。

图16是质谱鉴定GiOMT4催化二氢槲皮素的产物的结果图。

图17是质谱鉴定GiOMT4催化木犀草素的产物的结果图。

图18是质谱鉴定GiOMT4催化圣草酚的产物的结果图。

图19是¹H-NMR鉴定GiOMT4催化槲皮素、杨梅素、二氢杨梅素的产物的结果图。

图20是GiOMT4催化槲皮素、二氢槲皮素的反应示意图。

图21是GiOMT4催化木犀草素、圣草酚的反应示意图。

图22是GiOMT4催化杨梅素的反应示意图。

图23是GiOMT4催化二氢杨梅素的反应示意图。

图24是式(Ⅰ)～式(Ⅴ)的化学结构式图。

图25是式(Ⅵ)～式(Ⅻ)、式(ⅰ)～式(ⅷ)的化学结构式图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。下述实施例中的所用的操作方法，如未作特殊说明，均为常规试验方法，可参考《分子克隆实验指南》(第三版)。

实施例1GiOMT4基因CDS序列的克隆及载体构建

1、提取‘Gjj9’胀果甘草组培苗RNA

将‘Gjj9’胀果甘草组培苗(来自药用植物种质创新与利用研究组，中国科学院华南植物园)全株用液氮速冻并研磨至细小粉末，使用RNA提取试剂盒HiPure Plant RNAMini Kit C(购买自广州美津生物科技有限公司，品牌Magen，货号R4151-03C)提取RNA。提取的RNA样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测其是否降解(选择上下有两条清晰的条带，且亮度比约为2:1的RNA样品)。

2.cDNA合成

以步骤1提取的RNA为模板，用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser(购买自上海百赛生物技术股份有限公司，品牌Takara，货号RR047A)合成cDNA。

3.目的基因克隆

以步骤2合成的cDNA为模板，引物GiOMT4-F、GiOMT4-R(GiOMT4-F：GGggtaccATGGCAACCAACGAG，SEQ ID NO.3；GiOMT4-R：ACGCgtcgacTCACTTGATCCGAC，SEQ IDNO.4)用高保真PCR酶

MAX DNA Polymerase进行目的基因的扩增。具体PCR体系和程序参考使用的PCR酶的使用说明。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小是否正确，及条带是否单一(选择条带大小正确，762bp，核酸序列为：GGGGTACCATGGCAACCAACGAGG ATCAAAAGCAAACTGAAGCTGGAAGGCACCAAGAGGTTGGTCACAAGAGTCTTCTGCAAAGTGATGCTCTTTACCA GTATATTCTGGAGACTAGTGTCTACCCAAGAGAACATGAAGCCATGAAAGAGTTGAGAGAGTTGACAGCAAAGCAC CCATGGAACATCATGACTACCTCTGCAGACGAAGGGCAATTTTTGAACATGCTCCTTAAGCTCATCAATGCCAAGA ACACCATGGAAATTGGTGTCTACACTGGCTACTCCCTTCTTGCTACTGCCCTCGCTCTTCCTGAGGATGGAAAGAT TTTGGCCATGGACGTTAATAGGGAGAATTACGAACTGGGTCTTCCTGTAATAAAAAAAGCTGGTGTTGCCCACAAA ATTGATTTCAGGGAAGGCCCTGCTCTTCCAGTTCTTGATGAAATGGTTAAAGACGAAAAGAATCATGGGAGCTTCG ATTTCATCTTCGTGGATGCAGACAAGGACAATTACCTCAACTACCACAAGAGGCTCATCGAGCTTGTTAAAGTGGG AGGTGTGATCGGGTACGACAACACCTTGTGGAACGGGTCTGTGGTGGCACCCCCTGATGCACCTCTCAGGAAGTAT GTTAGGTATTACAGGGATTTCGTGTTGGAGCTCAACAAGGCCTTGGCTGTGGACCCCAGGATTGAAATCTGCATGC TTCCGGTTGGTGATGGAATCACTATCTGCCGTCGGATCAAGTGAGTCGACGCGT，SEQ ID NO.5所示、单一的PCR产物；其中下划线部分的序列(SEQ ID NO.2)为GiOMT4的核酸序列)。

4.双酶切连接法构建目的载体

使用限制性核酸内切酶KpnI-HF和SalI-HF(购买自基因生物技术国际贸易有限公司，品牌NEB，货号R3142S和R3138S)，对步骤3得到的PCR产物和pColdII质粒进行双酶切，具体酶切体系参考使用的内切酶说明书。酶切后的PCR产物和pColdII质粒用T4 DNA ligase(购买自基因生物技术国际贸易有限公司，品牌NEB，货号M0202S)进行连接，具体连接体系参考使用的连接酶的说明书。连接产物用热激法转化到大肠杆菌DH5α中，通过氨苄青霉素(Amp)抗性和菌落PCR初步筛选阳性单克隆。对阳性单克隆进行培养，使用质粒提取试剂盒HiPure Plasmid Kits(购买自广州美津生物科技有限公司，品牌Magen，货号P1001-03)提取质粒，以提取的质粒为模板，使用双酶切法进行再次鉴定。酶切鉴定正确的质粒送至生工生物工程公司进行测序，测序正确的质粒保存在-20℃。即得到插入GiOMT4基因的pColdII载体。

实施例2GiOMT4重组蛋白表达与收集

1.目的基因重组细胞的构建

将实施例1得到的测序正确的质粒用热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过氨苄青霉素(Amp)抗性和菌落PCR筛选阳性重组细胞。筛选阳性的菌株保存在-80℃。

2.目的基因原核表达及重组蛋白检测

将阳性菌株在Amp抗性的LB培养基上划线培养过夜(37℃)，活化后挑单菌落于200μL含有Amp抗性的LB培养液中培养过夜(37℃，200rpm)，再以1:100接种于10mL含有Amp抗性的LB培养液中培养2h(37℃，200rpm)，此时OD₆₀₀≈0.6。取出菌液置于4℃冷却15min，加入IPTG至终浓度为0.1mM，诱导表达12～24h(16℃，140rpm)。取出诱导后的菌液，4℃离心收集菌体(可保存于-80℃)，加入5mL 50mM预冷Tris-HCl(pH＝7.5)，轻柔搅拌重悬菌体。用超声细胞破碎仪裂解菌体至菌液透亮(功率200W，超声5s，间隔5s，时间5min)，菌液全程冰水浴防止蛋白失活。裂解后的菌液4℃离心，取上清液保存于-20℃。

吸取12μL上述样品的上清液于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测(分离胶12％)。电泳结束后将蛋白胶置于考马斯亮蓝溶液中染色2h以上(60rpm)，然后用脱色液脱色过夜，期间更换2～3次脱色液至蛋白胶背景接近无色。脱色完成的蛋白胶拍照保存。结果如图1所示：纯化所得的蛋白样品大小约为29kDa，与GiOMT4重组蛋白理论计算值(29.96kDa，氨基酸序列为：MATNEDQKQTEAGRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREHEAMKELRELTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLINAKNTMEIGVYTGYSLLATALALPEDGKILAMDVNRENYELGLPVIKKAGVAHKIDFREGPALPVLDEMVKDEKNHGSFDFIFVDADKDNYLNYHKRLIELVKVGGVIGYDNTLWNGSVVAPPDAPLRKYVRYYRDFVLELNKALAVDPRIEICMLPVGDGITICRRIK，SEQ ID NO.1所示)一致，可用于下一步的酶活研究。

实施例3GiOMT4体外酶活测定

1.GiOMT4对不同底物的催化活性鉴定

以黄酮醇(山奈酚、槲皮素、杨梅素)、二氢黄酮醇(二氢槲皮素、二氢杨梅素)、黄酮(芹菜素、木犀草素)、二氢黄酮(柚皮素、甘草素和圣草酚)为底物，测定GiOMT4的催化活性。酶活反应体系为50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、终浓度为200μM的底物、终浓度为2mM的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、100μL粗酶(实施例2得到的上清液，负对照则加入等量的高温失活后的粗酶)，总体积200μL。反应液混匀后于37℃反应过夜后，加入600μL乙酸乙酯萃取，离心吸取500μL有机相于玻璃小瓶中旋转至乙酸乙酯蒸发完全，再加入200μL甲醇重新溶解，，过0.22μm滤膜后用于高效液相色谱(HPLC)检测。

HPLC分析条件：C18色谱柱(5μm,4.6x 150mm)；流速1mL/min；流动相为乙腈(A)：0.1v/v％甲酸水(B)；洗脱梯度15％～60％A(0～20min)，60％～95％A(20～22miin)，95％A(22～25min)，95％～15％A(25～27min)，15％A(27～30min)；进样量10μL；；检测波长280nm或370nm。

相对催化活性计算公式为：相对催化活性＝产物峰面积/(底物峰面积+产物峰面积)。

GiOMT4对黄酮醇(山奈酚、槲皮素、杨梅素)、二氢黄酮醇(二氢槲皮素、二氢杨梅素及其产物(P1～P4))、黄酮(芹菜素、木犀草素)、二氢黄酮(柚皮素、甘草素和圣草酚)的催化活性的结果如表1及图2～12所示：GiOMT4对山奈酚、芹菜素、柚皮素、甘草素、4'-O-甲基二氢杨梅素、3',4'-O-二甲基二氢杨梅素和3',4',5'-O-三甲基二氢杨梅素无催化活性，但对槲皮素、杨梅素、二氢槲皮素、二氢杨梅素、木犀草素、圣草酚和3',5'-O-二甲基二氢杨梅素有较高的催化活性。

表1GiOMT4对不同底物的催化活性

2、GiOMT4催化槲皮素、杨梅素、二氢杨梅素、二氢槲皮素、木犀草素、圣草酚的产物鉴定

使用一级质谱对GiOMT4催化槲皮素、杨梅素、二氢杨梅素、二氢槲皮素、、木犀草素、圣草酚的反应产物进行初步鉴定，然后使用半制备分离柱将GiOMT4催化槲皮素、杨梅素和二氢杨梅素的产物进行分离纯化，然后进行核磁氢谱鉴定。

GiOMT4催化槲皮素、杨梅素、二氢杨梅素、二氢槲皮素、木犀草素和圣草酚的反应产物的一级质谱图如图13～18所示，各产物的化学结构式如图24～25所示：槲皮素的催化产物包含异鼠李素(式(Ⅰ)，P1)、怪柳黄素(式(Ⅱ)，由于怪柳黄素和异鼠李素分子量一致，保留时间相近，，且怪柳黄素含量远低于异鼠李素，所以在图13中只能看到异鼠李素。)和五桠果素(式(Ⅲ)，P2)；杨梅素的催化产物包含：3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基黄酮(式(Ⅳ)，P1)、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基黄酮(式(Ⅴ)，P3)、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基黄酮(式(Ⅵ)，P2)、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基黄酮(式(Ⅶ)，P4)；二氢杨梅素的催化产物包含：3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基二氢黄酮(式(Ⅷ)，P1)、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基二氢黄酮(式(Ⅸ)，P3)、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基二氢黄酮(式(Ⅹ)，P2)、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基二氢黄酮(式(Ⅺ)，P4)；二氢槲皮素的催化产物包含：3'-O-甲基二氢槲皮素(式(Ⅻ))、二氢怪柳黄素(式(ⅰ))和3',4'-O-二甲基二氢槲皮素(式(ⅱ))；木犀草素的催化产物包含：金圣草黄素(式(ⅲ))、香叶木素(式(ⅳ))和3',4'-O-二甲基木犀草素(式(ⅴ))；圣草酚的催化产物包含：高圣草酚(式(ⅵ))、橙皮素(式(ⅶ))和3',4'-O-二甲基圣草酚(式(ⅷ))。

GiOMT4催化槲皮素、杨梅素和二氢杨梅素的反应产物的核磁共振氢谱如图19所示。上述分析结果表明GiOMT4重组蛋白可以在体外催化槲皮素生成异鼠李素、怪柳黄素和‘五桠果素；催化二氢槲皮素生成3'-O-甲基二氢槲皮素、二氢怪柳黄素和3',4'-O-二甲基二氢槲皮素；催化木犀草素生成金圣草黄素、香叶木素和3',4'-O-二甲基木犀草素；催化圣草酚生成高圣草酚、橙皮素和3',4'-O-二甲基圣草酚；连续催化杨梅素和二氢杨梅素，其中杨梅素的产物包含：3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基黄酮、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基黄酮、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基黄酮和3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基黄酮；二氢杨梅素的产物包含3,3',5,5',7-五羟基-4'-甲氧基二氢黄酮、3,5,5',7-四羟基-3',4'-二甲氧基二氢黄酮、3,4',5,7-四羟基-3',5'-二甲氧基二氢黄酮、3,5,7-三羟基-3',4',5'-三甲氧基二氢黄酮(各催化反应的示意图如图20、21、22、23所示)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.甘草氧甲基转移酶，所述甘草氧甲基转移酶的氨基酸序列包含a1)～a3)中任一种：

a1)SEQ ID NO.1；

2.与权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶相关的生物材料，所述生物材料为b1)～b8)中任一种：

b1)编码权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶的核酸分子；

b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)包含b1)所述核酸分子的载体；

b4)包含b2)所述表达盒的载体；

b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；

b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；

b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；

b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。

3.权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶的制备方法，通过培养权利要求2中所述的转基因细胞系表达所述甘草氧甲基转移酶。

4.c1)～c3)中至少一种在d1)～d13)中至少一种中的应用；

c1)权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶；

c2)权利要求2所述的生物材料；

c3)权利要求3所述的制备方法；

d1)催化类黄酮物质的甲基化；

d2)制备催化类黄酮物质的甲基化的产品；

d3)合成物质A；

d4)制备合成物质A的产品；

d5)合成物质B；

d6)制备合成物质B的产品；

d8)合成物质C；

d9)制备合成物质C的产品；

d10)合成物质D；

d11)制备合成物质D的产品；

d10)合成物质E；

d11)制备合成物质E的产品；

d12)合成物质F；

d13)制备合成物质F的产品；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述类黄酮物质包含：黄酮醇、二氢黄酮醇、黄酮、二氢黄酮中的至少一种；

优选地，所述黄酮醇包含：槲皮素、杨梅素中的至少一种；

优选地，所述二氢黄酮醇包含：二氢槲皮素、二氢杨梅素中的至少一种；

优选地，所述黄酮包含：木犀草素；

优选地，所述二氢黄酮包含：圣草酚。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述催化类黄酮物质的甲基化包含e1)～e6)中任一种：

7.g1)～g6)中任一种方法：

g1)一种合成物质A的方法，将槲皮素和权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质A；

g2)一种合成物质B的方法，将二氢槲皮素和权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质B；

g3)一种合成物质C的方法，将木犀草素和权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质C；

g4)一种合成物质D的方法，将圣草酚和权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质D；

g5)一种合成物质E的方法，将杨梅素和权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质E；

g6)一种合成物质F的方法，将二氢杨梅素和权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶混合，得到混合物，反应，得到物质F；

8.一种产品，包含：权利要求1所述的甘草氧甲基转移酶和/或权利要求2所述的生物材料；

所述产品包含试剂和试剂盒中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：

所述产品还包含：类黄酮物质；

10.根据权利要求8或9所述的产品，其特征在于：所述产品还包含：缓冲液、S-腺苷甲硫氨酸中的至少一种。