CN115925518A - 一种微波与低共熔试剂协同水解虎杖苷制备白藜芦醇的方法 - Google Patents

一种微波与低共熔试剂协同水解虎杖苷制备白藜芦醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法。该方法将氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1:1‑1.5:1混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂，稀释；将虎杖苷溶解于稀释后的低共熔试剂，混匀；将溶解了虎杖苷的低共熔试剂放入进行微波处理，控制微波功率为300‑400W；往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入超纯水，冷藏，离心分离，沉淀洗涤后冻干，得到白藜芦醇。相较于酶解法，该方法不需要使用价格昂贵的糖苷酶，水解成本较低；相较于微生物转化法，该方法不需要长时间的发酵处理，水解效率高。此外，该方法的白藜芦醇转化得率高，平均得率超过98％，具有副产物少，产物分离操作简单等优点。

Description

一种微波与低共熔试剂协同水解虎杖苷制备白藜芦醇的方法
技术领域
本发明涉及白藜芦醇的制备，具体涉及一种微波与低共熔试剂协同水解虎杖苷制备白藜芦醇的方法。
背景技术
白藜芦醇(3,4',5-三羟基-1,2-二苯基乙烯)是一种非黄酮类多酚化合物，存在虎杖、葡萄及花生等植物中含量较高。大量研究表明白藜芦醇具有调节免疫、清楚自由基、抑制癌细胞增殖和清除自由基的能力，在食品、保健品、制药和化妆品行业中应用前景广阔。在自然界中，天然的白藜芦醇大多数结合葡萄糖以其糖苷的形式(虎杖苷)存在，故目前工业上主要还是通过水解虎杖苷来制备白藜芦醇。
现有关于水解虎杖苷制备白藜芦醇的方法主要有酶解法和微生物转化法。采用酶解法水解虎杖苷制备白藜芦醇条件温和、产物单一且无有毒废物产生，但酶解法所使用的糖苷酶制备成本高，价格较为昂贵，增加了水解虎杖苷的生产成本。例如中国发明专利CN104818262B中使用了一种来自嗜热袍菌属Thermotoga所产的一种β-葡萄糖苷酶来水解虎杖苷制备白藜芦醇，该方法能够高效水解虎杖苷的β-糖苷键使虎杖苷转化为白藜芦醇，但该方法所使用的糖苷酶需要经过微生物培养、富集、基因突变、提纯等多个步骤后才能制得，工艺复杂且生产成本较高，工业化生产实现难度较大。采用微生物转化法虽然能降低虎杖苷水解的成本，但是微生物转化法的效率较低，耗时较长。例如中国发明专利CN102199548B中使用了一种虎杖根内菌株(Penicillium oxalicu G3)去发酵降解虎杖苷制备白藜芦醇，该方法需要发酵96小时后才能够使虎杖苷水解，耗时较长。中国发明专利CN105296545A中也使用了一种虎杖内生菌去转化虎杖苷制备白藜芦醇。在该方法下，虎杖苷需要在该内生菌培养基中发酵144小时后才能水解，效率也较低。
酶解法中所使用的β-葡萄糖苷酶价格昂贵，市场上最常见的β-葡萄糖苷酶(来源于黑曲霉)价格至少为3333元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，而中国发明专利CN104818262B中所使用的产自非常见菌属的β-葡萄糖苷酶，其制备成本更高。中国发明专利CN102199548B和CN105296545A两种微生物转化法虽然能降低直接使用糖苷酶的成本，但是其效率较低，两种微生物转化法水解虎杖苷的效率仅为1.04％/h和0.69％/h。所以针对这些问题，本领域急需一种高效且成本低廉的方法来水解虎杖苷制备白藜芦醇。
发明内容
为了克服现有技术上的不足及缺陷，本发明的目的在于提供一种利用微波与低共熔试剂协同水解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，该方法成本低廉、水解效率高并且绿色环保，白藜芦醇转化得率超过98％，为白藜芦醇等苷元类物质的绿色高效制备提供了良好的指导。
本发明的目的通过以下步骤实现：
一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，包括如下步骤：
1)将氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1:1-1.5:1混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂，稀释；
2)将虎杖苷溶解于稀释后的低共熔试剂，混匀；
3)将溶解了虎杖苷的低共熔试剂放入进行微波处理，控制微波功率为300-400W；
4)往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入超纯水，冷藏，离心分离，沉淀洗涤后冻干，得到白藜芦醇。
为进一步实现本发明目的，优选地，步骤1)中，所述的搅拌是在90-100℃水浴中进行。
优选地，步骤1)中，所述的稀释是用超纯水进行。
优选地，所述的稀释至低共熔试剂在溶液中的体积浓度为85％-95％。
优选地，步骤3)中，所述的微波处理的时间为2-8分钟。
优选地，所述的微波处理的时间为3-5分钟。
优选地，步骤4)中，所述的超纯水加入量为低共熔试剂体积的12-14倍。
优选地，步骤4)中，所述的冷藏温度为3-5℃，冷藏时间为4-8小时。
优选地，步骤4)中，所述的洗涤是用超纯水洗涤3-4次。
优选地，步骤4)中，所述的离心分离后的溶液被收集，倒入旋转蒸发装置，50-60℃温度下旋转蒸发出水分；直至水分全部蒸干，收集得到的高黏度组分为回收成功的低共熔试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果。
1)本发明发现，针对虎杖苷降解制备白藜芦醇，仅仅微波与氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1:1-1.5:1组成的低共熔试剂存在协同效应，而其他的低共熔试剂和强化方法都不存在该协同效应，该协同效益不仅体现白藜芦醇转化得率超过98％，而且副产物少，处理时间非常短，成本很低。
2)利用微波与低共熔试剂协同的方法降解虎杖苷制备白藜芦醇，相较于传统酶解法，该方法不需要使用价格昂贵的糖苷酶，成本较低。
3)本发明利用微波与低共熔试剂协同的方法降解虎杖苷制备白藜芦醇，相较于微生物转化法，该方法不需要长时间的发酵处理，而且转化效率高。
附图说明
图1是本发明一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法的流程图。
图2是本发明微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)降解虎杖苷反应原理图。
图3是虎杖苷和白藜芦醇的标准品液相色谱图。
图4是本发明实施例1中虎杖苷未处理前的色谱峰图。
图5是本发明实施例1中虎杖苷经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后的色谱峰图。
图6是本发明实施例2中虎杖苷未处理前的色谱峰图。
图7是本发明实施例2中虎杖苷经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后的色谱峰图。
图8是本发明实施例3中虎杖苷未处理前的色谱峰图。
图9是本发明实施例3中虎杖苷经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后的色谱峰图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。
实施例中，所用的微波设备为山东霍尔德公司的HD-WB6H高通量智能型微波设备。
本发明中，氯化胆碱(Choline chloride，Ch)和苹果酸(Malic acid，Mal)形成的低共熔试剂(Ch/Mal)极性广，溶解性优于传统有机溶剂(甲醇、乙醇)。发明人发现，将氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1:1-1.5:1混合能很好的充当虎杖苷的溶剂，尤其是其质子提供能力要大于盐酸、硫酸等强酸，使该混合物形成的低共熔试剂具有在虎杖苷水解反应中完全替代酸性有机溶剂的能力。如图2所示，在该低共熔试剂中，虎杖苷在Ch/Mal中其糖苷键首先会被质子攻击发生质子化使其糖苷键断裂，生成苷元和糖的阳碳离子中间体(过渡态)，随后阳碳离子中间体溶剂化脱去质子形成糖分子。将溶于虎杖苷的Ch/Mal放入微波中进行处理时，反应体系中粒子在微波的作用下其扩散系数增加，增加了溶液中质子接触到虎杖苷糖苷键的几率，使糖苷键更容易发生质子化断裂。在微波作用下，虎杖苷分子发生振动，能显著降低虎杖苷脱糖苷以及形成过渡态产物所需的活化能，提高反应效率，实现虎杖苷的高效降解。待反应后，往低共熔试剂中加入水，使白藜芦醇析出。由于水即是氢键的受体也是氢键的供体，水的加入会破坏低共熔试剂的稳定性使其溶解性下降。而白藜芦醇因其水溶性较差，在低共熔试剂稳定性被破坏的情况下会被析出沉淀。待收集分离沉淀后的白藜芦醇后，将溶液旋蒸使水分分离后即又可对低共熔试剂实现回收再利用，从而实现整个反应过程无废液产生。
实施例1
如图1所示，一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1:1混合，随后置于90℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Mal，用超纯水将Ch/Mal稀释成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)水解虎杖苷：将20mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为3分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
分离样品与回收低共熔试剂：往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入8倍体积的超纯水，随后在3℃低温下冷藏4小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到白藜芦醇。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，50℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例1
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Cit)水解虎杖苷：将20mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为3分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例2
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Lev)水解虎杖苷：将20mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为3分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例3
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Tar)水解虎杖苷：将20mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为3分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例4
单独微波处理水解虎杖苷：将20mg虎杖苷标准品溶于60mL 90％的乙醇溶液中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为3分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例5
水热联用低共熔试剂水解虎杖苷：将20mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后置于95℃水浴锅中加热处理30分钟后采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例6
酶解法水解虎杖苷：将20mg虎杖苷标准品和β-葡萄糖糖苷酶(来源于黑曲霉)溶于60mL磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例7
微生物转化法水解虎杖苷：250g土豆削皮后粉碎，放入培养瓶中，随后加入1000mL纯净水煮沸后，过滤取滤液制作培养液。待培养液冷却后，向其中加入虎杖内生菌株(Penicillium oxalicu G3)40株、葡萄糖20g、硝胺酸20g、蛋白胨10g、酒曲100g混匀搅拌，随后将混合培养液pH调整为5-6。将20mg虎杖苷标准品和60mL混合培养液混匀后，35℃孵育144个小时后，随后取样采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
虎杖苷的转化情况和白藜芦醇的生成情况采用高效液相色谱法进行检测：吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。虎杖苷降解为白藜芦醇的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
虎杖苷转化率(％)＝消耗的虎杖苷质量/虎杖苷总质量×100
虎杖苷转化比＝消耗虎杖苷的摩尔质量/生成白藜芦醇的摩尔质量
图4是本发明实施例1中虎杖苷未处理前的色谱峰图。图5是本发明实施例1中虎杖苷经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后的色谱峰图。对比图3的虎杖苷和白藜芦醇的标准品液相色谱图，可以标定实施例中虎杖苷和白藜芦醇在液相色谱中的出峰位置。图4和图5显示了微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理前后的样品中虎杖苷和白藜芦醇变化情况。由图4和图5可知，经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后，样品中的虎杖苷信号峰都变成了白藜芦醇信号峰，这说明经过处理后，溶液中的虎杖苷都降解成了白藜芦醇。
实施例1与对比例1-3的转化率和转化比结果如表1所示。由表1可知四种方法的虎杖苷转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的虎杖苷几乎都转化成了白藜芦醇。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，脉冲电场协同低共熔试剂(Ch/Mal)虎杖苷转化率最高(99.75％)。这可能是由于Ch/Mal相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
表1.不同低共熔溶剂对微波转化虎杖苷的影响
Figure BDA0004011196950000071
实施例1与对比例4-7共五种虎杖苷降解方法的转化率和转化比结果如表2所示。由表1可知五种方法的虎杖苷转化比都接近1，这说明五种降解方法中降解的虎杖苷几乎都转化成了白藜芦醇。五种方法中，微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)虎杖苷转化率最高(99.75％)。单独使用微波降解虎杖苷的效率较差，转化率仅为1.24％，而水热协同Ch/Mal的转化率较高，但耗时要显著高于微波协同Ch/Mal，该结果说明微波协同Ch/Mal在水解虎杖苷的效果上要显著强于微波和Ch/Mal单独应用。在降解同样体积浓度虎杖苷时，微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理时间最短，整个处理过程仅耗时3min，其处理时间要远低于水热协同Ch/Mal(30min)、酶解法(8h)和微生物转化法(144h)，其水解效率分别是这三种方法的10倍，160倍和2880倍。此外，微波协同Ch/Mal处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(来源于黑曲霉，3333元/g)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本低廉。
表2.不同虎杖苷降解方法的转化率和转化比结果
Figure BDA0004011196950000081
实施例2
如图1所示，一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1.25:1混合，随后置于95℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Mal，将Ch/Mal配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)降解虎杖苷：将40mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率350W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
分离样品与回收低共熔试剂：往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入10倍体积的超纯水，随后在4℃低温下冷藏6小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到白藜芦醇。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，55℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例8
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联合(Ch/Cit)水解虎杖苷：将40mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率350W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例9
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联合(Ch/Lev)水解虎杖苷：将40mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率350W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例10
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联合(Ch/Tar)水解虎杖苷：将40mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率350W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例11
单独微波处理水解虎杖苷：将40mg虎杖苷标准品溶于60mL 90％的乙醇溶液中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率350W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例12
水热协同低共熔试剂水解虎杖苷：将40mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后置于95℃水浴锅中加热处理30分钟后采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例13
酶解法水解虎杖苷：将40mg虎杖苷标准品和β-葡萄糖糖苷酶(来源于黑曲霉)溶于60mL磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例14
微生物转化法水解虎杖苷：250g土豆削皮后粉碎，放入培养瓶中，随后加入1000mL纯净水煮沸后，过滤取滤液制作培养液。待培养液冷却后，向其中加入虎杖内生菌株(Penicillium oxalicu G3)40株、葡萄糖20g、硝胺酸20g、蛋白胨10g、酒曲100g混匀搅拌，随后将混合培养液pH调整为5-6。将40mg虎杖苷标准品和60mL混合培养液混匀后，35℃孵育144个小时后，随后取样采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
虎杖苷的转化情况和白藜芦醇的生成情况采用高效液相色谱法进行检测：吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。虎杖苷降解为白藜芦醇的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
虎杖苷转化率(％)＝消耗的虎杖苷质量/虎杖苷总质量×100
虎杖苷转化比＝消耗虎杖苷的摩尔质量/生成白藜芦醇的摩尔质量
图6是本发明实施例2中虎杖苷未处理前的色谱峰图。图6是本发明实施例2中虎杖苷经过微波与低共熔试剂协同处理后的色谱峰图。图6和图7显示了微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理前后的样品中虎杖苷和白藜芦醇变化情况。由图6和图7可知，经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后，样品中的虎杖苷信号峰都变成了白藜芦醇信号峰，这说明经过处理后，溶液中的虎杖苷都降解成了白藜芦醇。
实施例2与对比例8-10的转化率和转化比结果如表3所示。由表3可知四种方法的虎杖苷转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的虎杖苷几乎都转化成了白藜芦醇。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，脉冲电场协同低共熔试剂(Ch/Mal)虎杖苷转化率最高(98.75％)。这可能是由于Ch/Mal相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
实施例2与对比例11-14共五种虎杖苷降解方法的转化率和转化比结果如表4所示。由表4可知五种方法的虎杖苷转化比都接近1，这说明五种降解方法中降解的虎杖苷几乎都转化成了白藜芦醇。五种方法中，微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)虎杖苷转化率最高(98.75％)。单独使用微波降解虎杖苷的效率较差，转化率仅为0.85％，而水热联合Ch/Mal的转化率较高，但耗时要显著高于微波协同Ch/Mal，该结果说明微波协同Ch/Mal在水解虎杖苷的效果上要显著强于微波和Ch/Mal单独应用。在降解同样体积浓度虎杖苷时，微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理时间最短，整个处理过程仅耗时4min，其处理时间要远低于水热协同Ch/Mal(30min)、酶解法(8h)和微生物转化法(144h)，其水解效率分别是这三种方法的7.5倍，120倍和2160倍。此外，微波协同Ch/Mal处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(来源于黑曲霉，3333元/g)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本低廉。
表3.不同低共熔溶剂对微波转化虎杖苷的影响
Figure BDA0004011196950000111
表4.不同虎杖苷降解方法的转化率和转化比结果
Figure BDA0004011196950000112
Figure BDA0004011196950000121
实施例3
如图1所示，一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1.5:1混合，随后置于100℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Mal，将Ch/Mal配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)降解虎杖苷：将60mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为5分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
分离样品与回收低共熔试剂：往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入12倍体积的超纯水，随后在5℃低温下冷藏8小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到白藜芦醇。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，60℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例15
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂协同(Ch/Cit)水解虎杖苷：将60mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为5分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例16
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂协同(Ch/Lev)水解虎杖苷：将60mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为5分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例17
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂协同(Ch/Tar)水解虎杖苷：将60mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为5分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例18
单独微波处理水解虎杖苷：将60mg虎杖苷标准品溶于60mL 90％的乙醇溶液中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为5分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例19
水热协同低共熔试剂水解虎杖苷：将60mg虎杖苷标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后置于95℃水浴锅中加热处理30分钟后采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例20
酶解法水解虎杖苷：将60mg虎杖苷标准品和β-葡萄糖糖苷酶(来源于黑曲霉)溶于60mL磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
对比例21
微生物转化法水解虎杖苷：250g土豆削皮后粉碎，放入培养瓶中，随后加入1000mL纯净水煮沸后，过滤取滤液制作培养液。待培养液冷却后，向其中加入虎杖内生菌株(Penicillium oxalicu G3)40株、葡萄糖20g、硝胺酸20g、蛋白胨10g、酒曲100g混匀搅拌，随后将混合培养液pH调整为5-6。将60mg虎杖苷标准品和60mL混合培养液混匀后，35℃孵育144个小时后，随后取样采用高效液相色谱法测定虎杖苷和白藜芦醇含量变化情况。
虎杖苷的转化情况和白藜芦醇的生成情况采用高效液相色谱法进行检测：吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。虎杖苷降解为白藜芦醇的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
虎杖苷转化率(％)＝消耗的虎杖苷质量/虎杖苷总质量×100
虎杖苷转化比＝消耗虎杖苷的摩尔质量/生成白藜芦醇的摩尔质量
图8是本发明实施例3中虎杖苷未处理前的色谱峰图。图9是本发明实施例3中虎杖苷经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后的色谱峰图。图8和图9显示了微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理前后的样品中虎杖苷和白藜芦醇变化情况。由图8和图9可知，经过微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理后，样品中的虎杖苷信号峰都变成了白藜芦醇信号峰，这说明经过处理后，溶液中的虎杖苷都降解成了白藜芦醇。
实施例3与对比例15-17的转化率和转化比结果如表5所示。由表5可知四种方法的虎杖苷转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的虎杖苷几乎都转化成了白藜芦醇。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，脉冲电场协同低共熔试剂(Ch/Mal)虎杖苷转化率最高(97.75％)。这可能是由于Ch/Mal相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
表5.不同低共熔溶剂对微波转化虎杖苷的影响
Figure BDA0004011196950000141
Figure BDA0004011196950000151
实施例3与对比例18-21共五种虎杖苷降解方法的转化率和转化比结果如表6所示。由表6可知五种方法的虎杖苷转化比都接近1，这说明五种降解方法中降解的虎杖苷几乎都转化成了白藜芦醇。五种方法中，微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)虎杖苷转化率最高(97.75％)。单独使用微波降解虎杖苷的效率较差，转化率仅为0.98％，而水热协同Ch/Mal的转化率较高，但耗时要显著高于微波协同Ch/Mal，该结果说明微波协同Ch/Mal在水解虎杖苷的效果上要显著强于微波和Ch/Mal单独应用。在降解同样体积浓度虎杖苷时，微波与低共熔试剂协同(Ch/Mal)处理时间最短，整个处理过程仅耗时5min，其处理时间要远低于水热协同Ch/Mal(30min)、酶解法(8h)和微生物转化法(144h)，其水解效率分别是这三种方法的6倍，96倍和1728倍。此外，微波协同Ch/Mal处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(来源于黑曲霉，3333元/g)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本低廉。
表6.不同虎杖苷降解方法的转化率和转化比结果
Figure BDA0004011196950000152

Claims (10)

1.一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将氯化胆碱和苹果酸按照摩尔比1:1-1.5:1混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂，稀释；
2)将虎杖苷溶解于稀释后的低共熔试剂，混匀；
3)将溶解了虎杖苷的低共熔试剂放入进行微波处理，控制微波功率为300-400W；
4)往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入超纯水，冷藏，离心分离，沉淀洗涤后冻干，得到白藜芦醇。
2.根据权利要求1所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的搅拌是在90-100℃水浴中进行。
3.根据权利要求1所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的稀释是用超纯水进行。
4.根据权利要求1或3所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于，所述的稀释至低共熔试剂在溶液中的体积浓度为85％-95％。
5.根据权利要求1所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法其特征在于，步骤3)中，所述的微波处理的时间为2-8分钟。
6.根据权利要求5所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法其特征在于，所述的微波处理的时间为3-5分钟。
7.根据权利要求1所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法其特征在于，步骤4)中，所述的超纯水加入量为低共熔试剂体积的12-14倍。
8.根据权利要求1所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法其特征在于，步骤4)中，所述的冷藏温度为3-5℃，冷藏时间为4-8小时。
9.根据权利要求1所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法其特征在于，步骤4)中，所述的洗涤是用超纯水洗涤3-4次。
10.根据权利要求1所述一种微波与低共熔试剂协同降解虎杖苷制备白藜芦醇的方法其特征在于，步骤4)中，所述的离心分离后的溶液被收集，倒入旋转蒸发装置，50-60℃温度下旋转蒸发出水分；直至水分全部蒸干，收集得到的高黏度组分为回收成功的低共熔试剂。
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