CN115918807A - 藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法 - Google Patents

藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法 Download PDF

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Abstract

一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂，包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g。本发明对影响半裸舟形藻生长的环境条件和营养因子进行优化，建立了稳定高效的半裸舟形藻培养体系。分别将半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌活化、扩培、重悬，调整藻细胞和菌液浓度。将处理后的半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌按比例添加到刺参饲料中对刺参进行投喂。本复合免疫增强剂各组分互利共栖、协同增效，可以通过提高生长指数、增强免疫酶和消化酶活性、提高抗病能力来综合提升刺参的非特异性免疫机能。本发明还公开了一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂的制备方法和应用方法。

Description

藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法
技术领域
本发明涉及微生物工程技术与棘皮动物免疫学技术领域，特别是涉及一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法。
背景技术
刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门、海参纲，是重要的近海水产养殖品种。刺参富含蛋白质、矿物质、维生素等多种天然活性物质，具有极高的营养和药用价值。刺参属于无脊椎棘皮动物，缺乏特异性免疫系统，主要依赖天然免疫机制对进入机体的异物进行识别、排除。刺参饲料的质量直接影响养殖刺参的健康和养殖环境质量，合理配伍的饲料添加剂可通过改善肠道健康、提高生长指数、增强抗病能力来大幅度提高刺参的非特异性免疫机能，从而提高刺参的养殖效益。
底栖硅藻被称为海洋中的天然牧草，是诱导刺参幼体附着和变态的优良诱导物，也是附着后刺参幼体生长所必需的天然适口饵料。复合型底栖硅藻杂质较多，密度有限且其中的竞争藻类甚至是有毒微藻经过培养后可能会成为优势种群，与底栖硅藻争夺生长资源。因此，开发新型、优良的单株海洋饵料底栖硅藻对刺参等水产动物的苗种生产和健康养殖具有重要的现实意义。底栖硅藻种类中的半裸舟形藻个体小、生长速度快、附着强度高，富含胞外多糖、氨基酸以及不饱和脂肪酸等营养物质，具有成为优质饵料添加剂的潜力。
沼泽红假单胞菌富含多种蛋白质、维生素、微量元素及活性物质，能够降解水体中的亚硝酸盐、硫化物等有毒物质，同时释放具有抗病力的酵素，抑制致病菌增殖。同时，沼泽红假单胞菌适应性很强，能忍受和分解水产养殖环境中高浓度的有机物质，产生有利于水产动物生长的活性因子，增强机体的免疫能力。沼泽红假单胞菌是我国农业部公布的《饲料添加剂目录》列为养殖动物允许使用的微生物，在刺参健康养殖及疾病防控中具有良好的作用效果和广阔的应用前景。
然而，迄今为止先前技术并没有关于将半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌合理配伍以提高养殖刺参免疫机能的相关报道或公开。市售的刺参用免疫增强剂制备及应用方式相对比较单一，其组分选择大多只是简单机械地组合，而不是经过科学选择、合理配伍的联合应用，生物利用度较低。
发明内容
有鉴于此，本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌联合应用的刺参用复合免疫增强剂。复合免疫增强剂可以通过促进生长、增强消化酶及免疫酶活性、提高抗病能力来综合提升和改善刺参的非特异性免疫机能。
本发明提供一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂，所述复合免疫增强剂的组分至少包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，其中，在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g。
在一实施例中，所述复合免疫增强剂在所述各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为：所述半裸舟形藻108cell/g，所述沼泽红假单胞菌107cfu/g。
本发明还提供一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂的制备方法，所述复合免疫增强剂的组分至少包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g，所述半裸舟形藻的制备方法包括以下步骤：
(1)将冻存的所述半裸舟形藻解冻后置于250mL三角瓶中培养，初始接种量为105cell/mL，培养液为f/2培养基；
(2)将所述三角瓶置于全自动光照培养箱中培养，每日人工摇晃藻种3～5次并取适量所述半裸舟形藻的藻液进行计数以确定对数生长期；
(3)用于所述半裸舟形藻的培养温度为20～25℃，盐度为29～32，初始pH7.5～8.5，光照周期为12L/12D，光照强度为2200～2800lx，氮磷比为10～20；
(4)待所述半裸舟形藻培养至对数生长期后，刮取附着所述培养基上所述半裸舟形藻的藻细胞，用无菌海水重悬，采用比浊法调整藻液浓度。
在一实施例中，用于所述半裸舟形藻的培养基为改良的f/2培养基，其中添加玉米素ZT浓度为1～2mg/L。
在一实施例中，所述沼泽红假单胞菌的制备方法为：
(1)将所述沼泽红假单胞菌冻干粉菌溶解于无菌蒸馏水中，将所述沼泽红假单胞菌的菌种在固体培养基上划线活化，固体平板在光照度为2500lx，温度为30℃的条件下于厌氧培养箱中培养3～5天，至所述固体平板出现红色单菌落，所述沼泽红假单胞菌的培养基的成分至少包括胰蛋白胨15.0g/L、大豆胨5.0g/L、氯化钠5.0g/L和琼脂20g/L，酸碱值为pH7.5～8.0；
(2)挑取所述红色单菌落接种于所述沼泽红假单胞菌的液体培养基中，所述液体培养基的培养温度为30℃，光照强度为2500lx，于厌氧培养箱中静置培养3～5天，至所述沼泽红假单胞菌的菌种增殖至对数生长期且菌液转变为深红色；
(3)于6000rpm离心10min，收集所述沼泽红假单胞菌的菌体，用无菌海水重悬菌体，采用麦氏比浊法调整菌液浓度。
本发明更提供一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂的应用方法，所述复合免疫增强剂的组分至少包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g，其中，所述应用方法为将所述半裸舟形藻及所述沼泽红假单胞菌按特定比例添加到刺参饲料中，加少量海水搅拌均匀后对刺参进行投喂。
在一实施例中，所述半裸舟形藻与所述沼泽红假单胞菌互利共栖、协同增效，在保证所述沼泽红假单胞菌代谢活动的同时，又提高了所述半裸舟形藻的生物量积累速度。
在一实施例中，所述半裸舟形藻通过光合作用产生氧气，所述沼泽红假单胞菌利用氧气矿化有机物，分解水体中至少包括氨基氮、亚硝基氮、硫化氢的有害物质，将所述有害物质转化为利于所述半裸舟形藻生长的营养源，同时生成二氧化碳以供所述半裸舟形藻的藻细胞进行光合利用。
本发明相对于现有技术有如下优点及效果：
(1)本发明首次将半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌科学配伍并联合应用于刺参养殖中，有效提高了养殖刺参的非特异性免疫机能。本发明采用的半裸舟形藻细胞呈俯卧式生长，可为底栖刺参提供牢固的附着基质。沼泽红假单胞菌稳定性高、抗逆性强，在制备和储藏过程中优势明显。本复合免疫增强剂添加到刺参饲料中的吸附性和稳定性好，沉降速度快，符合刺参的摄食特点和营养需求。
(2)本发明对影响半裸舟形藻增殖的环境条件及营养因子进行优化，有效提高了半裸舟形藻的比生长速率、光能利用率及生物量，建立了稳定高效的半裸舟形藻培养体系。可以满足单株底栖硅藻规模化生产的要求，具有较高的生物效价。有效克服复合型底栖硅藻杂质多、藻种不纯的问题，同时避免了多种微藻竞争生长而产生的拮抗作用。
(3)本复合免疫增强剂两组分(半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌)之间互利共栖、协同增效。本发明应用的半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌并非简单机械地组合，而是经过科学选择、合理配伍的联合应用。半裸舟形藻通过光合作用产生氧气，沼泽红假单胞菌利用氧气矿化有机物，分解水体中氨基氮、亚硝基氮、硫化氢等有害物质，将其转化为利于半裸舟形藻生长的营养源，同时生成二氧化碳以供藻细胞光合利用。藻类的代谢物和死亡藻类也可被沼泽红假单胞菌分解转化为可被藻类直接利用的氮、磷、碳及其它营养物质。另外，半裸舟形藻可以为沼泽红假单胞菌提供生长所需要的栖息地，并通过释放胞外代谢物促进其生长。这些胞外代谢物还能促进藻菌(半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌)的粘合，为二者的共生体提供保护屏障，有效抵抗极端环境并缓解有毒物质侵害。同时，沼泽红假单胞菌也通过释放促生长因子(例如，维生素、糖肽类物质、铁载体等)来提高半裸舟形藻的新陈代谢。同时还能利用半裸舟形藻周围水体中高浓度的溶解氧为其提供还原性较强的生存环境。沼泽红假单胞菌和半裸舟形藻通过二氧化碳和氧气的交换、养分的交换及微量营养元素的交换达到互利共栖、协同增效的目的，既保证了细菌的代谢活动，又提高了藻类生物量积累的速度。本发明将半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌配合使用，利用二者的互作响应关系协同增效，能够更有效地提高刺参的免疫机能。
(4)本复合微生态制剂成分明确、营养丰富、制备方法简单、生产成本低，具有无污染、无耐药性、无毒副作用的特点，不会产生水产品安全风险和环境安全问题，适合大规模生产推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1a为本发明复合免疫增强剂的半裸舟形藻(A)和沼泽红假单胞菌(B)的反应机理示意；
图1b为本发明复合免疫增强剂的半裸舟形藻(A)和沼泽红假单胞菌(B)的图形态特征图；
图2为本发明复合免疫增强剂对刺参酸性磷酸酶活力的影响示意图；
图3为本发明复合免疫增强剂对刺参碱性磷酸酶活力的影响示意图；
图4为本发明复合免疫增强剂对刺参超氧化物歧化酶活力的影响示意图；
图5为本发明复合免疫增强剂对刺参溶菌酶活力的影响示意图；
图6为本发明复合免疫增强剂对刺参淀粉酶活力的影响示意图；
图7为本发明复合免疫增强剂对刺参胰蛋白酶活力的影响示意图；
图8为本发明复合免疫增强剂对攻毒刺参累计死亡率的影响示意图；
图9为本发明复合免疫增强剂对攻毒刺参灿烂弧菌的抑制作用效果图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的特定实施例进行详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的描述，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体，意在涵盖非排他性的包含，除了包含所列的那些要素，而且还可包含没有明确列出的其他要素。
以下各实施例中刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心，刺参单体质量1.75±0.14g，暂养于6个相同规格水族箱中(100cm×80cm×80cm)，每箱100头。水族箱分别编号A、B、C、D、E、F。刺参暂养两周后添加复合免疫增强剂。
实施例1
请同时参阅图1a及图1b。图1a为本发明复合免疫增强剂的半裸舟形藻(A)和沼泽红假单胞菌(B)的反应机理示意图，图1b为本发明复合免疫增强剂的半裸舟形藻(A)和沼泽红假单胞菌(B)的形态特征图。本发明提供一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂(以下简称“复合免疫增强剂”)，复合免疫增强剂的组分至少包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，在其他实施例中，还可以包括一种以上的菌类及/或藻类。在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g。较佳的，经过多次试验后所得出的优化数据是复合免疫增强剂在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为：半裸舟形藻108cell/g，沼泽红假单胞菌107cfu/g。
在一实施例中，本发明提供一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂的制备方法。半裸舟形藻的制备方法包括以下步骤为：将冻存的半裸舟形藻解冻后置于250mL三角瓶中培养，初始接种量为105cell/mL，培养液为f/2培养基；将三角瓶标记封号后，置于全自动光照培养箱中培养，每日人工摇晃藻种3～5次并取适量藻液进行计数以确定对数生长期；用于半裸舟形藻的培养温度为20～25℃(较佳为20℃)，盐度为29～32(较佳为29)，初始pH7.5～8.5(较佳为pH7.5)，光照周期为12L/12D，光照强度为2200～2800lx(较佳为2800lx)，氮磷比为10～20(较佳为12.5，如表1所示)；待半裸舟形藻培养至对数生长期后，刮取附着培养基上的藻细胞，用无菌海水重悬，采用比浊法调整藻液浓度，备用。用于半裸舟形藻的培养基为改良的f/2培养基，对f/2培养基中玉米素ZT的添加浓度及氮磷比两个因素设置不同梯度进行优化筛选，添加玉米素ZT浓度为1～2mg/L，得出玉米素ZT的最佳添加浓度为1.0mg/L。上述技术方案中，半裸舟形藻培养基里添加的玉米素ZT是从玉米中提炼出来的天然细胞分裂素，可以增强半裸舟形藻细胞壁的可塑性，减缓在胁迫条件下藻细胞的氧化损伤，提高藻细胞的抗逆能力。同时，玉米素ZT还能促进叶绿素和蛋白质的合成，有效激活质膜上的ATP酶活性，为原生质体和细胞壁提供充足的合成原料，保证藻细胞的持久性增殖。
在一实施例中，沼泽红假单胞菌的制备方法为：将沼泽红假单胞菌冻干粉菌溶解于无菌蒸馏水中，将沼泽红假单胞菌的菌种在固体培养基上划线活化，固体平板在光照度为2500lx，温度为30℃的条件下于厌氧培养箱中培养3～5天，至平板出现红色单菌落，沼泽红假单胞菌的固体培养基的成分至少包括胰蛋白胨15.0g/L、大豆胨5.0g/L、氯化钠5.0g/L和琼脂20g/L，酸碱值为pH7.5～8.0；挑取红色单菌落接种于沼泽红假单胞菌的液体培养基中，液体培养基的培养温度为30℃，光照强度为2500lux，于厌氧培养箱中静置培养3～5天，至沼泽红假单胞菌的菌种增殖至对数生长期且菌液转变为深红色；于6000rpm离心10min，收集沼泽红假单胞菌的菌体，用无菌海水重悬菌体，采用麦氏比浊法调整菌液浓度，备用。
在一实施例中，本发明提供一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂的应用方法(以下简称“应用方法”)。应用方法为将半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌按特定比例添加到刺参饲料中，加少量海水搅拌均匀后进行投喂。水族箱A用作对照例，不添加免疫增强剂。水族箱B用作藻对比例，只在基础饲料中添加半裸舟形藻，添加浓度为109cell/g。水族箱C用作菌对比例，只在基础饲料中添加沼泽红假单胞菌，添加浓度为108cfu/g。水族箱D用作实施例1，在基础饲料中添加半裸舟形藻107cell/g，沼泽红假单胞菌108cfu/g。饲养试验持续30天，共设3组平行，每个处理3次重复。期间每日投喂1次，饲养期间保持充气，每2天换水一次，海水温度16～18℃，pH7.8～8.2，盐度29～31。溶解氧不低于6mg/L，氨氮不高于0.5mg/L。其中，半裸舟形藻与沼泽红假单胞菌互利共栖、协同增效，在保证沼泽红假单胞菌代谢活动的同时，又提高了半裸舟形藻的生物量积累速度。半裸舟形藻通过光合作用产生氧气，沼泽红假单胞菌利用氧气矿化有机物，分解水体中至少包括氨基氮、亚硝基氮、硫化氢等有害物质，将有害物质转化为利于半裸舟形藻生长的营养源，同时生成二氧化碳以供半裸舟形藻的藻细胞进行光合利用。
在一实施例中，在添加复合免疫增强剂后第0天、10天、20天、30天分别在各水族箱随机选取3只刺参，剖开腹腔获得体腔液及肠组织。将刺参体腔液合并，4℃、4000r/min离心10min，取上清液用于测定免疫酶活性。将刺参肠组织合并，用磷酸缓冲液(pH7.5)冲洗后用滤纸吸干，以10倍磷酸缓冲液匀浆。匀浆液于4℃、4000r/min离心10min，上清液用于测定消化酶活性，采用南京建成科技有限公司测试盒测定水族箱的刺参免疫酶及消化酶活性，具体测定步骤按照试剂盒说明书进行。酶活检测实验重复3次，酶活力大小以比活力的形式表示，单位为U/mg蛋白。
在一实施例中，在30天饲养试验结束后，用灿烂弧菌对刺参进行攻毒试验。通过预试验确定灿烂弧菌对刺参的半致死浓度为2×107cfu/mL。攻毒试验设3组平行，每组取25头刺参，灿烂弧菌注射剂量为0.1ml/头，记录攻毒后15天内刺参的累计死亡率。攻毒试验结束后，每组随机取3头刺参，解剖获得肠组织，用30mLPBS缓冲液匀浆处理10min。用无菌生理盐水将肠组织匀浆液稀释10倍，取0.05ml稀释液涂布至TCBS弧菌选择性培养基，28℃倒置培养，2天后统计刺参肠道弧菌数目。
表1 ZT浓度和氮磷比对半裸舟形藻生物量的影响
Figure BDA0003706532780000091
实施例2
在一实施例中，复合免疫增强剂的半裸舟形藻及沼泽红假单胞菌的处理方式同实施例1。半裸舟形藻的培养温度为25℃，盐度为32，玉米素ZT添加浓度为2mg/L，氮磷比为20，光照周期为12L/12D。对f/2培养基初始pH及光照强度两个因素设置不同梯度进行优化筛选，得出培养基初始pH的最适值为8.0，光照强度最适值为2500lx(如表2所示)。水族箱E用作实施例2，在基础饲料中添加半裸舟形藻109cell/g，沼泽红假单胞菌106cfu/g。养殖试验、酶活检测、攻毒试验等操作同实施例1。
表2培养液初始pH和光照强度对半裸舟形藻生物量的影响
Figure BDA0003706532780000101
实施例3
在一实施例中，复合免疫增强剂的半裸舟形藻及沼泽红假单胞菌的处理方式同实施例1。半裸舟形藻的培养温度为23℃，盐度为30，玉米素ZT添加浓度为1.5mg/L，氮磷比为10，培养基初始pH8.5，光照周期为12L/12D，光照强度为2200lx。水族箱F用作实施例3，在基础饲料中添加半裸舟形藻108cell/g，沼泽红假单胞菌107cfu/g。养殖试验、酶活检测、攻毒试验等操作同实施例1。实施例3中复合免疫增强剂的半裸舟形藻和沼泽红假单胞菌的形态特征如图1b所示，舟形藻藻落整体分布均匀，藻体色素完好，空壳藻体较少。单细胞大小为6.5～8.3μm，壳面椭圆形，附着强度较大，运动缓慢。沼泽红假单胞菌呈短杆状，大小为1.2～3.5μm，有鞭毛，运动活跃。
结果分析：各实施例对刺参生长情况的影响如表3所示，单独或者联合施用半裸舟形藻和沼泽红假单胞菌均能够提高刺参的生长指数，而相比于单独添加组，联合施用半裸舟形藻和沼泽红假单胞菌能够更显著地提高刺参的质量增加率和特定生长率，其中实施例3刺参的质量增加率和特定生长率相对最高。这表明本发明的复合免疫增强剂可以加强刺参对营养物质的吸收利用，有效促进刺参生长。
表3复合免疫增强剂对刺参质量增加率和特定生长率的影响
Figure BDA0003706532780000111
在各实施例中，复合免疫增强剂对刺参免疫酶和消化酶活力的影响如图2～7所示，图2为本发明复合免疫增强剂对刺参酸性磷酸酶活力的影响示意图、图3为本发明复合免疫增强剂对刺参碱性磷酸酶活力的影响示意图、图4为本发明复合免疫增强剂对刺参超氧化物歧化酶活力的影响示意图、图5为本发明复合免疫增强剂对刺参溶菌酶活力的影响示意图、图6为本发明复合免疫增强剂对刺参淀粉酶活力的影响示意图、图7为本发明复合免疫增强剂对刺参胰蛋白酶活力的影响示意图。在选定的酶活指标中，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶是刺参体腔细胞内参与免疫防御活动的重要水解酶。可通过水解作用直接杀死或抑制病原体，并能增强机体对病原的吞噬作用。超氧化物歧化酶可以清除机体内多余的氧自由基，催化超氧阴离子，修复受损细胞。溶菌酶能够破坏致病菌的细胞壁，直接参与杀菌及抑菌过程。淀粉酶和胰蛋白酶可以有效反映刺参对营养物质的吸收利用能力。在使用复合免疫增强剂之前，各组刺参酶活力没有显著差异。随着养殖试验的进行，单独或者联合施用半裸舟形藻和沼泽红假单胞菌均能够提高刺参的免疫酶和消化酶活力，而相比于单独添加组，联合施用半裸舟形藻和沼泽红假单胞菌能够更显著地提高刺参的酶活水平。其中实施例1中刺参的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性更高，实施例2对溶菌酶的激活效果最好，实施例3刺参的超氧化物歧化酶、淀粉酶和胰蛋白酶活性最高。表明本复合免疫增强剂可以显著增强刺参的磷酸酶响应能力及抗氧化能力，有效提高消化和代谢功能。
在各实施例中，各实施例对攻毒灿烂弧菌刺参累计死亡率的影响如图8所示，换言之，图8为本发明复合免疫增强剂对攻毒刺参累计死亡率的影响示意图。攻毒后首个死亡个体出现在对照例，单独或者联合施用半裸舟形藻和沼泽红假单胞菌均可以延迟刺参的发病及死亡，而联合施用半裸舟形藻和沼泽红假单胞菌能够更显著地降低刺参的累计死亡率。复合免疫增强剂对攻毒刺参灿烂弧菌的抑制作用如图9所示，换言之，图9为本发明复合免疫增强剂对攻毒刺参灿烂弧菌的抑制作用效果图。实施例1、实施例2和实施例3中攻毒刺参肠道的灿烂弧菌数目明显少于单独添加组和对照例。其中，实施例2中舟形藻和沼泽红假单胞菌对灿烂弧菌的抑制作用最明显。表明本发明的复合免疫增强剂可以有效抵御灿烂弧菌的侵袭感染，显著增强刺参的抗病能力。
综合以上试验结果，本发明的复合免疫增强剂的各组分相辅相成、彼此增效。可以通过提高生长指数、增强免疫酶和消化酶活性、提高抗病能力来综合提升刺参的非特异性免疫机能。
需要说明的是，本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似的部分互相参见即可。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所附的权利要求为准。

Claims (9)

1.一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂，其特征在于，所述复合免疫增强剂的组分至少包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，其中，在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g。
2.根据权利要求1所述的复合免疫增强剂，其特征在于，所述复合免疫增强剂在所述各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为：所述半裸舟形藻108cell/g，所述沼泽红假单胞菌107cfu/g。
3.一种藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述复合免疫增强剂的组分至少包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g，所述半裸舟形藻的制备方法包括以下步骤：
(1)将冻存的所述半裸舟形藻解冻后置于250mL三角瓶中培养，初始接种量为105cell/mL，培养液为f/2培养基；
(2)将所述三角瓶置于全自动光照培养箱中培养，每日人工摇晃藻种3～5次并取适量所述半裸舟形藻的藻液进行计数以确定对数生长期；
(3)用于所述半裸舟形藻的培养温度为20～25℃，盐度为29～32，初始pH7.5～8.5，光照周期为12L/12D，光照强度为2200～2800lx，氮磷比为10～20；
(4)待所述半裸舟形藻培养至对数生长期后，刮取附着所述培养基上所述半裸舟形藻的藻细胞，用无菌海水重悬，采用比浊法调整藻液浓度。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述复合免疫增强剂在所述各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为：所述半裸舟形藻108cell/g，所述沼泽红假单胞菌107cfu/g。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：用于所述半裸舟形藻的培养基为改良的f/2培养基，其中添加玉米素ZT浓度为1～2mg/L。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌的制备方法为：
(1)将所述沼泽红假单胞菌冻干粉菌溶解于无菌蒸馏水中，将所述沼泽红假单胞菌的菌种在固体培养基上划线活化，固体平板在光照度为2500lx，温度为30℃的条件下于厌氧培养箱中培养3～5天，至所述固体平板出现红色单菌落，所述沼泽红假单胞菌的固体培养基的成分至少包括胰蛋白胨15.0g/L、大豆胨5.0g/L、氯化钠5.0g/L和琼脂20g/L，酸碱值为pH7.5～8.0；
(2)挑取所述红色单菌落接种于所述沼泽红假单胞菌的液体培养基中，所述液体培养基的培养温度为30℃，光照强度为2500lx，于厌氧培养箱中静置培养3～5天，至所述沼泽红假单胞菌的菌种增殖至对数生长期且菌液转变为深红色；
(3)于6000rpm离心10min，收集所述沼泽红假单胞菌的菌体，用无菌海水重悬菌体，采用麦氏比浊法调整菌液浓度。
7.一种根据权利要求1所述的藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂的应用方法，其特征在于，所述复合免疫增强剂的组分至少包括半裸舟形藻以及沼泽红假单胞菌，在各实验组的单位重量刺参饲料中的添加浓度为半裸舟形藻107～109cell/g和沼泽红假单胞菌106～108cfu/g，其中，所述应用方法为将所述半裸舟形藻及所述沼泽红假单胞菌按特定比例添加到刺参饲料中，加少量海水搅拌均匀后对刺参进行投喂。
8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述半裸舟形藻与所述沼泽红假单胞菌互利共栖、协同增效，在保证所述沼泽红假单胞菌代谢活动的同时，又提高了所述半裸舟形藻的生物量积累速度。
9.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于：所述半裸舟形藻通过光合作用产生氧气，所述沼泽红假单胞菌利用氧气矿化有机物，分解水体中至少包括氨基氮、亚硝基氮、硫化氢的有害物质，将所述有害物质转化为利于所述半裸舟形藻生长的营养源，同时生成二氧化碳以供所述半裸舟形藻的藻细胞进行光合利用。
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