CN102628024A - 一种促进植物生长的藻菌的共培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:1)配制培养基溶液,由NaHCO3、乙酸钠、NH4Cl、KNO3、KH2PO4、酵母膏、CaCl2、柠檬酸钠按比例配制而成;培养基溶液的pH值为7.0~7.5;2)接种,准备好海水小球藻原液,该海水小球藻原液分光光度值为OD680=3.0~4.0,对应浓度>3×106/ml;准备好沼泽红假单胞菌原液,该沼泽红假单胞菌原液分光光度值为OD805=2.0~2.5,对应浓度>3×108/ml;3)培养,采用人工光源进行间歇光照培养72小时,得到促进植物生长的藻菌。本发明采用了经申请人反复试验及验证的特定配比的组方,利用二者协同作用,实现藻菌共培,比传统培养方式中藻、菌浓度分别提高43.4%和58.1%,培养成本分别节约30.7%和38.3%。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进植物生长的藻菌的共培方法,是一种海水小球藻和光合细菌的共同培养技术。属于农业种植肥料的领域,尤其微生物肥料技术领域。
背景技术
海水小球藻是一种营养丰富的单胞藻,通常用作贝类、对虾等经济品种的生物饵料,还可以用来培养轮虫、桡足类等鱼类的开口饵料,富含必需氨基酸、必需脂肪酸、糖蛋白、核酸等生物活性物质,可以增强水产动物机体免疫力,在海水养殖中具有重要的应用价值。此外,小球藻吸收水体的氮磷、CO2等,并进行产氧光合作用,一方面可以有效降低水体COD、氮磷负荷,还释放氧气,改善水质,保持水产动物健康。
光合细菌是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物,广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处,主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。光合细菌的菌体以有机酸、氨基酸、氨和醣类等有机物和硫化氢作为供氧体,通过光合磷酸化获得能量,在水中光照条件下可直接利用降解有机质和硫化氢并使自身得以增殖,同进净化了水体。除此之外,细胞内还含有碳素储存物质糖原和聚β一羟基丁酸、辅酶Q、抗病毒物质和生长促进因子,具有很高的营养价值,在养殖业上也有广阔的应用前景。
通常,人们对小球藻和光合细菌进行分别培养,再进行单独或混合使用。不仅贮存、使用麻烦,而且由于培养浓度差异导致藻菌比例失衡,难以完全发挥其协同作用。本发明通过研究小球藻与光合细菌的培养条件与生长特性,配制培养基,再按一定比例进行接种,实现藻菌共培。
发明内容
本发明的目的,是为了克服现有技术对小球藻和光合细菌进行分别培养、单独或混合使用存在存贮和使用不方便、难以发挥协同作用的缺点,提供一种促进植物生长的藻菌的共培方法。
本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到:
一种促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于包括如下步骤:
1)配制培养基溶液,由NaHCO3、乙酸钠、NH4Cl、KNO3、KH2PO4、酵母膏、CaCl2、柠檬酸钠按比例配制而成;所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0~3.0mg/l、乙酸钠1.0~3.0mg/l、NH4Cl 1.0~2.0mg/l、KNO3 0.1~0.3mg/l、KH2PO4 0.5~1.5mg/l、酵母膏0.25~0.75mg/l、CaCl2 0.08~0.12mg/l、柠檬酸钠0.25~0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5;
2)接种,准备好海水小球藻原液,该海水小球藻原液分光光度值为OD680=3.0~4.0,对应浓度>3×106/ml;准备好沼泽红假单胞菌原液,该沼泽红假单胞菌原液分光光度值为OD805=2.0~2.5,对应浓度>3×108/ml;首先将所述海水小球藻原液与沼泽红假单胞菌原液按藻菌体积比例为1∶10混合后形成藻菌混合液,然后将藻菌混合液与步骤1)配制的培养基溶液混合,构成接种藻菌混合液;培养基溶液占接种藻菌混合液体积25%;
3)培养,采用人工光源进行间歇光照培养72小时,所述间歇光照培养培养是指12小时光照-12小时黑暗-12小时光照-12小时黑暗-12小时光照-12小时黑暗共72小时,后得到促进植物生长的藻菌,所述12小时光照的照度为2000勒克斯。
本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到:
实现本发明目的的一种技术改进方案是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 2.0mg/l、乙酸钠2.0mg/l、NH4Cl 1.5mg/l、KNO3 0.2mg/l、KH2PO4 1.0mg/l、酵母膏0.5mg/l、CaCl2 0.1mg/l、柠檬酸钠0.5mg/l。
实现本发明目的的一种技术改进方案是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0mg/l、乙酸钠1.0mg/l、NH4Cl 1.0/l、KNO3 0.1mg/l、KH2PO4 0.5mg/l、酵母膏0.25mg/l、CaCl2 0.08mg/l、柠檬酸钠0.25mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
实现本发明目的的一种技术改进方案是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 3.0mg/l、乙酸钠3.0mg/l、NH4Cl 2.0mg/l、KNO3 0.3mg/l、KH2PO4 1.5mg/l、酵母膏0.75mg/l、CaCl2 0.12mg/l、柠檬酸钠0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
实现本发明目的的一种技术改进方案是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0mg/l、乙酸钠3.0mg/l、NH4Cl 2.0mg/l、KNO3 0.1mg/l、KH2PO4 1.5mg/l、酵母膏0.25mg/l、CaCl2 0.12mg/l、柠檬酸钠0.25mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
实现本发明目的的一种技术改进方案是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 3.0mg/l、乙酸钠1.0mg/l、NH4Cl 1.0mg/l、KNO3 0.3mg/l、KH2PO4 0.5mg/l、酵母膏0.75mg/l、CaCl2 0.08mg/l、柠檬酸钠0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
实现本发明目的的一种技术改进方案是:步骤3)的培养,采用血球计数板计数,接种藻菌混合液中海水小球藻细胞浓度为5×106/ml、沼泽红假单胞菌细胞浓度为5×108/ml。
本发明具有如下有益效果:
1、本发明由于采取将小球藻和光合细菌混合在同一培养基中培养,特别是采用了经申请人反复试验及验证的特定配比的组方,利用二者协同作用,实现藻菌共培,比传统培养方式中藻、菌浓度分别提高43.4%和58.1%,培养成本分别节约30.7%和38.3%。
2、本发明利用小球藻和光合细菌的协作关系,在特定培养基和接种条件下,能够形成良好的共培体系,小球藻和光合细菌二者充分利用培养基中的无机和有机营养物,有效控制养殖水环境中氨态氮、亚硝酸态氮、硫化氢等有害物含量;共培出来的小球藻和光合细菌具有丰富营养,可以作为水产动物的饵料或间接饵料被利用。
具体实施方式
具体实施例1
本实施例涉及一种促进植物生长的藻菌的共培方法,包括如下步骤:
1)配制培养基溶液,由NaHCO3、乙酸钠、NH4Cl、KNO3、KH2PO4、酵母膏、CaCl2、柠檬酸钠按比例配制而成;所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0~3.0mg/l、乙酸钠1.0~3.0mg/l、NH4Cl 1.0~2.0mg/l、KNO3 0.1~0.3mg/l、KH2PO4 0.5~1.5mg/l、酵母膏0.25~0.75mg/l、CaCl2 0.08~0.12mg/l、柠檬酸钠0.25~0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
2)接种,准备好海水小球藻原液,该海水小球藻原液分光光度值为OD680=3.0~4.0,对应浓度>3×106/ml;准备好沼泽红假单胞菌原液,该沼泽红假单胞菌原液分光光度值为OD805=2.0~2.5,对应浓度>3×108/ml;首先将所述海水小球藻原液与沼泽红假单胞菌原液按藻菌体积比例为1∶10混合后形成藻菌混合液,然后将藻菌混合液与步骤1)配制的培养基溶液混合,构成接种藻菌混合液;培养基溶液占接种藻菌混合液体积25%;
3)培养,采用人工光源进行间歇光照培养72小时,所述间歇光照培养培养是指12小时光照-12小时黑暗-12小时光照-12小时黑暗-12小时光照-12小时黑暗共72小时,后得到促进植物生长的藻菌,所述12小时光照的照度为2000勒克斯。
本实施例中,OD680、OD805分别是指波长690nm和805nm下的分光光度值,值越大,说明其细胞浓度越大。
具体实施例2:
本实施例2的特点是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 2.0mg/l、乙酸钠2.0mg/l、NH4Cl 1.5mg/l、KNO3 0.2mg/l、KH2PO4 1.0mg/l、酵母膏0.5mg/l、CaCl20.1mg/l、柠檬酸钠0.5mg/l。其余方法步骤同具体实施例1。
具体实施例3:
本实施例3的特点是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0mg/l、乙酸钠1.0mg/l、NH4Cl 1.0/l、KNO3 0.1mg/l、KH2PO4 0.5mg/l、酵母膏0.25mg/l、CaCl20.08mg/l、柠檬酸钠0.25mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。其余方法步骤同具体实施例1。
具体实施例4:
本实施例4的特点是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 3.0mg/l、乙酸钠3.0mg/l、NH4Cl 2.0mg/l、KNO3 0.3mg/l、KH2PO4 1.5mg/l、酵母膏0.75mg/l、CaCl2 0.12mg/l、柠檬酸钠0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。其余方法步骤同具体实施例1。
具体实施例5:
本实施例5的特点是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0mg/l、乙酸钠3.0mg/l、NH4Cl 2.0mg/l、KNO3 0.1mg/l、KH2PO4 1.5mg/l、酵母膏0.25mg/l、CaCl2 0.12mg/l、柠檬酸钠0.25mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。其余方法步骤同具体实施例1。
具体实施例6:
本实施例6的特点是:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 3.0mg/l、乙酸钠1.0mg/l、NH4Cl 1.0mg/l、KNO3 0.3mg/l、KH2PO4 0.5mg/l、酵母膏0.75mg/l、CaCl2 0.08mg/l、柠檬酸钠0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。其余方法步骤同具体实施例1。
具体实施例7:
本实施例7的特点是:步骤3)的培养,采用血球计数板计数,接种藻菌混合液中海水小球藻细胞浓度为5×106/ml、沼泽红假单胞菌细胞浓度为5×108/ml。其余方法步骤同具体实施例1。
本实施例的应用方法如下:
藻类和细菌是水生态系统调控体系中最重要的功能微生物,但是二者具有不同的作用特点:光合细菌繁殖较慢,一般对水体中有机物浓度要求较高,可将有机氮、氨态氮转化为无毒害作用的硝态氮;小球藻的繁殖速度快,能高效吸收水体无机营养盐,并对水体中较低浓度的有机物也能充分利用。(1)二者都能进行光合作用,对光照等培养条件的要求一致;(2)小球藻是自养型,光合细菌是异养型,使二者能够充分利用水中的无机和有机营养物,有效控制养殖水环境中氨态氮、亚硝酸态氮、硫化氢等有害物含量;(3)二者具有丰富营养,可以作为水产动物的饵料或间接饵料被利用。
Claims (7)
1.一种促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:
1)配制培养基溶液,由NaHCO3、乙酸钠、NH4Cl、KNO3、KH2PO4、酵母膏、CaCl2、柠檬酸钠按比例配制而成;所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0~3.0mg/l、乙酸钠1.0~3.0mg/l、NH4Cl 1.0~2.0mg/l、KNO3 0.1~0.3mg/l、KH2PO4 0.5~1.5mg/l、酵母膏0.25~0.75mg/l、CaCl2 0.08~0.12mg/l、柠檬酸钠0.25~0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5;
2)接种,准备好海水小球藻原液,该海水小球藻原液分光光度值为OD680=3.0~4.0,对应浓度>3×106/ml;准备好沼泽红假单胞菌原液,该沼泽红假单胞菌原液分光光度值为OD805=2.0~2.5,对应浓度>3×108/ml;首先将所述海水小球藻原液与沼泽红假单胞菌原液按藻菌体积比例为1∶10混合后形成藻菌混合液,然后将藻菌混合液与步骤1)配制的培养基溶液混合,构成接种藻菌混合液;培养基溶液占接种藻菌混合液体积25%;
3)培养,采用人工光源进行间歇光照培养72小时,所述间歇光照培养培养是指12小时光照-12小时黑暗-12小时光照-12小时黑暗-12小时光照-12小时黑暗共72小时,后得到促进植物生长的藻菌,所述12小时光照的照度为2000勒克斯。
2.根据权利要求1所述的促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:步骤3)的培养,采用血球计数板计数,接种藻菌混合液中海水小球藻细胞浓度为5×106/ml、沼泽红假单胞菌细胞浓度为5×108/ml。
3.根据权利要求1或2所述的促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 2.0mg/l、乙酸钠2.0mg/l、NH4Cl 1.5mg/l、KNO3 0.2mg/l、KH2PO4 1.0mg/l、酵母膏0.5mg/l、CaCl2 0.1mg/l、柠檬酸钠0.5mg/l。
4.根据权利要求1或2所述的促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0mg/l、乙酸钠1.0mg/l、NH4Cl 1.0/l、KNO30.1mg/l、KH2PO4 0.5mg/l、酵母膏0.25mg/l、CaCl2 0.08mg/l、柠檬酸钠0.25mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
5.根据权利要求1或2所述的促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 3.0mg/l、乙酸钠3.0mg/l、NH4Cl 2.0mg/l、KNO3 0.3mg/l、KH2PO4 1.5mg/l、酵母膏0.75mg/l、CaCl2 0.12mg/l、柠檬酸钠0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
6.根据权利要求1或2所述的促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 1.0mg/l、乙酸钠3.0mg/l、NH4Cl 2.0mg/l、KNO3 0.1mg/l、KH2PO4 1.5mg/l、酵母膏0.25mg/l、CaCl2 0.12mg/l、柠檬酸钠0.25mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
7.根据权利要求1或2所述的促进植物生长的藻菌的共培方法,其特征在于:步骤1)所述各物质组份在培养基溶液浓度为NaHCO3 3.0mg/l、乙酸钠1.0mg/l、NH4Cl 1.0mg/l、KNO3 0.3mg/l、KH2PO4 0.5mg/l、酵母膏0.75mg/l、CaCl2 0.08mg/l、柠檬酸钠0.75mg/l;培养基溶液的pH值为7.0~7.5。
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---|---|
CN (1) | CN102628024A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106434425A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 湖南省植物保护研究所 | 一种沼泽红假单胞菌培养基及其培养物的制备方法和应用 |
CN112553082A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-03-26 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种淡水小球藻的室外规模化扩培方法 |
CN114381376A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-04-22 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种藻菌共培的培养基及其共培养方法 |
CN115918807A (zh) * | 2022-06-21 | 2023-04-07 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法 |
CN115918807B (zh) * | 2022-06-21 | 2024-06-07 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101363005A (zh) * | 2008-09-16 | 2009-02-11 | 广东绿百多生物科技有限公司 | 一种微细藻类和光合细菌共同培养的方法 |
-
2012
- 2012-03-31 CN CN2012100934623A patent/CN102628024A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101363005A (zh) * | 2008-09-16 | 2009-02-11 | 广东绿百多生物科技有限公司 | 一种微细藻类和光合细菌共同培养的方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
孙军德等: "沼泽红假单胞菌培养条件研究", 《沈阳农业大学学报》, vol. 34, no. 1, 25 April 2003 (2003-04-25), pages 28 - 30 * |
孙颖民等: "《水产生物饵料培养实用技术手册》", 30 April 2005, article "第一章第五节 光合细菌的培养基", pages: 15 - 18 * |
张丽君等: "小球藻的异养生长及培养条件优化", 《广西植物》, vol. 21, no. 4, 30 December 2001 (2001-12-30), pages 353 - 357 * |
湛江水产学校: "《海洋饵料生物培养》", 31 December 1980, article "第五章第三节 培养液配方", pages: 95 - 106 * |
闫震等: "沼泽红假单胞菌与小球藻USTB-01的共培养研究", 《现代化工》, vol. 29, 20 October 2009 (2009-10-20), pages 172 - 176 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106434425A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 湖南省植物保护研究所 | 一种沼泽红假单胞菌培养基及其培养物的制备方法和应用 |
CN112553082A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-03-26 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种淡水小球藻的室外规模化扩培方法 |
CN114381376A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-04-22 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种藻菌共培的培养基及其共培养方法 |
CN115918807A (zh) * | 2022-06-21 | 2023-04-07 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法 |
CN115918807B (zh) * | 2022-06-21 | 2024-06-07 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 藻菌协同增效的刺参用复合免疫增强剂、制备和应用方法 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120808 |