CN115884782A

CN115884782A - 新型干眼症治疗用药物组合物

Info

Publication number: CN115884782A
Application number: CN202180038446.1A
Authority: CN
Inventors: 金载旺; 李泰勋; 李泫珠
Original assignee: Novacell Technology Inc
Current assignee: Novacell Technology Inc
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2023-03-31
Also published as: JP2023529079A; KR20210145894A; US20230226137A1; EP4159225A1; WO2021241892A1; EP4159225A4; KR102429281B1

Abstract

本发明提供一种新型干眼症治疗用药物组合物，所述组合物通过无副作用地显著改善角膜损伤和角膜混浊而修复损伤角膜和增加眼泪分泌，从而有效治疗与干眼症相关的眼科疾病。

Description

新型干眼症治疗用药物组合物

技术领域

本发明涉及一种新型干眼症治疗用药物组合物，更具体地，涉及一种能够无副作用地治疗与干眼症相关的眼科疾病的新型干眼症治疗用药物组合物。

背景技术

干眼症(dry eye syndrome)是一种通常由眼泪产生减少或眼泪蒸发导致的泪膜损失增加而出现的异物感、烧灼感或眼睛的刺激感等症状的综合征。现有的对干眼症的治疗聚焦于，为了根据症状弥补不足的眼泪而通过滴入作为人造眼泪的人工泪液、或暂时性或永久性阻塞泪管等保守方法维持一定量以上的眼泪。然而，这样的症状疗法其效果不够充分，不能直接消除发病原因。因此，近来对干眼症的治疗趋势倾向于，通过减少泪腺和眼球表面的炎症来使干眼得到好转的直接和终极的治疗方法，而不是旨在以缓解症状为目的的被动治疗。此外，对于难以通过人工泪液调节的中度到重度的干眼症，作为用于控制炎症的药物而不是单纯的人工泪液处方，正在联合使用环孢素、类固醇、自体血清滴眼液等抗炎药。然而，人工泪液存在由于效果是暂时性的因此一天需使用数次且对角膜损伤没有保护效果的缺点，当长期使用类固醇制剂时，类固醇制剂可能诱发如青光眼的致命副作用，作为广谱免疫抑制剂的环孢素也会出现眼球疼痛、烧灼感、异物感、充血等问题和部分全身性副作用等局限性。此外，治疗用隐形眼镜使用不便，反而会成为导致感染的原因，封闭泪点手术存在对手术的排斥心里和出现副作用时难以恢复原状的缺点。因此，迫切需要开发一种能够无副作用地有效预防或治疗干眼症的制剂。与此相关，韩国公开专利第2014-0099526号公开了用于干眼症治疗的JNK信号转导途径的细胞渗透肽抑制剂的用途。

发明内容

(要解决的技术问题)

然而，上述现有技术的情况下，对眼黏膜诱发局部刺激的可能性高，难以定量给药，从而可以显著降低治疗效率。

本发明是为了解决包括上述问题的各种问题而提出的，其目的在于，提供一种新型干眼症治疗用药物组合物，所述组合物通过无副作用地显著抑制由干眼症导致的眼泪分泌量的减少和角膜形态的变化而有效地治疗干眼症。然而，这些问题只是示例性的，本公开的范围不限于此。

(解决问题的方案)

根据本发明的一观点，提供一种干眼症治疗及预防用药物组合物，所述组合物含有作为活性成分的具有抗菌活性的肽，所述肽由七个氨基酸组成，所述肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：

BOBWRYm

(其中，B是各自可选地选自由赖氨酸(K)或精氨酸(R)组成的群组的碱性氨基酸，O是各自可选地选自由苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)组成的群组的芳香族氨基酸)。

根据本发明的另一观点，提供一种角膜结膜炎治疗用药物组合物，所述组合物含有作为活性成分的具有抗菌活性的肽，所述肽由七个氨基酸组成，所述肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：

BOBWRYm

根据本发明的另一观点，提供一种角膜损伤及角膜混浊改善用药物组合物，所述组合物含有作为活性成分的具有抗菌活性的肽，所述肽由七个氨基酸组成，所述肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：

BOBWRYm

根据本发明的另一观点，提供一种用于治疗受试者干眼症的方法，所述方法包括将所述组合物施用于患有干眼症的受试者的步骤。

根据本发明的另一观点，提供一种肽在制备干眼症治疗剂中的用途，所述肽具有抗菌活性且由七个氨基酸组成，所述肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：

BOBWRYm

(发明的效果)

如上所述本发明的新型干眼症治疗用药物组合物显著抑制由干眼症导致的眼泪分泌量的减少、角膜结膜炎及角膜形态的变化，从而修复损伤角膜和增加眼泪分泌量的效果优异，因此可用于开发安全且有效的干眼症治疗剂。当然，本发明的范围不受这种效果的限定。

附图说明

图1是将本发明的肽处理到小鼠模型后通过荧光染色和显微镜拍摄的角膜损伤程度的图像。

图2是对根据本发明的肽处理的角膜损伤程度进行量化和分析的图表。

图3是将本发明的肽处理到小鼠模型后通过显微镜拍摄的眼球混浊度的图像。

图4是对根据本发明的肽处理的眼球混浊度进行量化和分析的图表。

具体实施方式

在本文中所使用的术语“抗菌肽”通常是指由比较简单的结构组成的阳离子肽(cationic peptide)化合物，其具有对革兰氏阳性菌(gram-positive bacteria)、革兰氏阴性菌(gram-negative bacteria)、真菌、病毒等的广谱抗菌谱，尽管其作用机制尚未被完全揭露，但众所周知的是，该化合物通过破坏微生物细胞膜的作用机制而表现出抗菌力。

在本文中所使用的术语“干眼症(dry eye syndrome)”是指由眼泪不足、或眼泪过度蒸发或眼泪组成成分的不平衡而导致眼球表面损伤、眼睛酸痛及刺激性症状诸如刺激感、异物感、干燥感等的眼病，眼泪和眼球表面(角膜和结膜)的炎症，而不是简单的眼泪不足，导致眼球的不适感、视力下降、眼泪层的不稳定性而对眼球表面造成损伤，增加疼痛发作、不规则的角膜表面、模糊且波动大的视力及角膜溃疡等发病风险。

在本文中所使用的术语“角膜混浊(corneal opacity)”是指由表面干燥、损伤或炎症等，在作为正常透明组织的角膜上形成不透明部分的状态或角膜整体变得不透明的状态。

(本发明的详细说明)

根据本发明的一观点，提供一种干眼症治疗及预防用药物组合物，所述组合物含有具有抗菌活性的肽作为活性成分，所述肽由七个氨基酸组成，所述肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：

BOBWRYm

在所述药物组合物中，所述干眼症可以是水性泪液缺乏型干眼症或蒸发型干眼症。在这种情况下，所述水性泪液缺乏型干眼症是指由泪腺分泌的眼泪不足而诱发，蒸发型干眼症是指在泪腺分泌功能正常的情况下，由过多的水分从暴露的眼表面流失而诱发。此外，可以向所述肽的N末端添加辛酰基或向C末端添加胺基。

BOBWRYm

在所述药物组合物中，所述角膜损伤及角膜混浊可能由干眼症或角膜结膜炎导致，所述药物组合物可以具有选自由软膏、皮肤外用制剂、气雾剂、喷雾剂、滴眼剂、口服制剂、及注射剂组成的群组的制剂。

根据本发明的另一观点，提供一种受试者干眼症治疗方法，所述方法包括将所述组合物施用于患有干眼症的受试者的步骤。

BOBWRYm

根据本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的载体或添加剂。在本文中所使用的术语“药学上可接受的”是指生理上可接受且当施用于人类时通常不会导致诸如胃肠道紊乱、头晕等过敏反应或与此类似的反应。作为所述添加剂的示例，可以包括赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、分散剂、稳定剂等。作为所述赋形剂的示例，可以包括乳糖、甘露醇、异麦芽酮糖醇、微晶纤维素、硅化微晶纤维素、粉末纤维素等。作为崩解剂的示例，可以包括低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、淀粉等。作为粘合剂的示例，可以包括羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、聚维酮、共聚维酮、预胶化淀粉等。作为润滑剂的示例，可以包括硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂富马酸钠等。作为润湿剂的示例，可以包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯衍生物、泊洛沙姆、聚氧乙烯蓖麻油衍生物。作为分散剂的示例，可以包括羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、聚维酮、共聚维酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素等。作为稳定剂的示例，可以包括柠檬酸、富马酸、琥珀酸等。此外，本发明的药物组合物还可以包括抗凝剂、香料、乳化剂、防腐剂等。

此外，可以使用本领域公知的方法制剂化本发明的药物组合物，以便施用于哺乳动物后能够提供活性成分的迅速、持续或延迟释放。所述药物制剂可以是粉末、颗粒、片剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂或软质或硬质明胶胶囊。

在本文中所使用的术语“治疗”是指通过施用本发明的组合物缓解或有益地改变所述干眼症症状的所有行为。

所述药物组合物的给药途径包括口服、静脉内、肌肉内、动脉内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、局部、舌下或直肠，例如可以通过局部施用(topical application)方式应用该药物组合物。所述胃肠外给药包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、病灶内注射或注入技术。

本发明的药物组合物可以以药学有效量给药。在本文中所使用的术语“药学有效量”是指以可适用于任何医学治疗的合理效益/风险比率治疗疾病的充分量，有效剂量水平可根据包括个体类型及严重程度、年龄、个体的性别、疾病类型、药物活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径及排泄率、治疗时间、与药物组合物联合使用的药物在内的因素及医学领域众所周知的其他因素来决定。本发明的组合物可以作为受试者治疗剂或与其他治疗剂组合给药，并可以与现有的治疗剂顺序或同时给药。此外，可以单剂量或多剂量给药。考虑到所有上述因素，重要的是施用无副作用地可以最小量获得最大效果的量，并可以由本领域技术人员容易地确定。

所述药物组合物的剂量可根据包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、给药时间、给药途径、排泄率、药物联用及特定疾病的严重程度的各种因素而进行各种各样的变化。此外，本发明的药物组合物可以单独使用或与手术、放射线治疗、激素治疗、化学治疗及使用生物反应调节剂的方法并用。此外，以成人为基准，所述药物组合物可以以0.001至200mg/kg范围内的剂量给药，当所述药物组合物为外用制剂时，以成人为基准，优选以1.0至3.0mL的量，每日1次至5次，持续至少1个月，但所述剂量并非旨在限制本发明的范围。

本发明人们在通过现有基础筛选发现的肽的基础上，合成了将诸如棕榈酰基、辛酰基等各种脂质成分连接于所述肽的N末端的修饰肽以进一步增加抗菌活性和渗透度以显示出高抗菌作用和免疫调节活性，从而开发了一种有效治疗诸如特应性皮炎的免疫疾病和由病原菌感染导致的疾病的新型抗菌及免疫调节肽(以下，简称为“肽I(Peptide I)”)(韩国授权专利第1855170号)。然而，作为所述肽应用于诱发干眼症的动物模型的结果，本发明人确认了与对照组相比改善角膜损伤和角膜混浊的显著效果，从而完成了本发明。

以下，将通过实施例更加详细地说明本发明。然而，本发明不限于以下公开的实施例，而是可以以各种不同的形态实施，提供这些实施例是为了使本发明的公开完整，并将本发明的范围充分告知本领域技术人员。

实施例1：免疫调节及抗菌肽的制备

本发明人们通过常规基础筛选检索开发了一种具有免疫调节功能和抗菌活性的肽(KFKWRYm)，并为此获得了专利(韩国专利第10-1855170号)。接着，为了开发具有比上述肽更优良的免疫调节和抗菌能力的改良肽，在上述专利肽的氨基酸序列中设计了各种变体，并使用通常的氨基酸合成法合成这些肽(Umbarger,H.E.,Ann.Rev.Biochem.,47:533-606，1978)，并将其作为免疫调节和抗菌候选肽使用。此外，如上所述本发明人们向上述合成的肽的N末端添加了辛酰基或乙酰基等和/或修饰氨基而不是C末端羧基被取代的形式。

实施例2：新型肽的FPR2活化和抗菌活性实验

为了确认本发明的免疫调节和抗菌肽候选是否具有活化生物体的免疫调节功能，本发明人们观察了钙离子的渗透性变化。具体地，为了确认所述肽是否活化FPR2测量了细胞内钙离子浓度。为此，本发明人在能够灵敏测量细胞内游离钙离子的方法中使用不表达FPR2的RBL细胞和过表达FPR1的RBL细胞(FPR1-RBL)和过表达FPR2的RBL细胞(FPR2-RBL)并使用了具有针对钙的强结合力的染色物质Fura-2/AM。即，在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中培养细胞，在对数中期状态时(mid-log phase，1-3×10⁷个细胞/mL)离心分离并收获细胞。然后用不含胎牛血清的RPMI培养基洗涤细胞数次，将其重悬于RPMI培养基中直至其浓度为1×10⁷个细胞/mL。然后，向其中添加最终浓度为3μM的Fura-2/AM，并在37℃、5％CO₂培养箱中培养45分钟同时连续搅拌。经过适当的时间后，收获细胞，再次用RPMI培养基洗涤数次，然后将其悬浮于添加250μM浓度的磺吡酮(Sulfinpyrazone)的适量的RPMI培养基中以防止进入细胞内的Fura-2流失到细胞外部。每次取约2×10⁶个细胞，通过快速离心分离收获，并将其重悬于1mL添加EGTA但不添加钙离子的洛克(Locke)溶液中，在分光光度计上监测在340nm和380nm两个波长的吸光度比，以大约1分钟的间隔用不同浓度(1μM、0.1μM及0.01μM)的根据本发明的肽进行处理后，检查在两个波长的吸光度差异，然后将其根据Grynkiewicz的方法转换为游离到细胞内的钙离子浓度。

此外，为了测定所述肽的抗菌活性，准备作为革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和作为革兰氏阴性菌的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)后，在琼脂平板培养基上涂抹4次，在36℃培养箱中培养整夜。次日，将琼脂平板培养基上产生的菌株菌落接种到3mL营养肉汤中，并以36℃、220rpm的条件在振荡培养箱中培养整夜。次日，将上述菌稀释，在600nm测定吸光度并将吸光度调整至0.5，在营养肉汤中按1:100的比率稀释细菌。然后，将在上述实施例中制备的肽在营养培养基中依次稀释至0、1.25、2.5、5、10、20及40μM的浓度分别制备1mL，然后接种1mL稀释的上述菌。接着，以36℃、220rpm的条件搅拌并培养18小时，然后在600nm测定吸光度。

结果是，大部分肽表现出FPR2活化效果，并对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)表现出高抗菌活性(表1)。上述肽的FPR2活化和抗菌活性结果总结在下表1中。

[表1]

抗菌肽的FPR2活化及抗菌活性

实施例3：动物模型构建

为了确认本发明的肽肽I(序列号1至6)的干眼(dry eye)和炎症改善功效，本发明人们构建了小鼠动物模型。具体地，以C57BL/6家族的12周龄雄性小鼠作为实验动物，对除了不诱发干眼的对照组(control)之外的小鼠，在15天的实验期间，每天2次对小鼠的眼睛滴0.2％苯扎氯铵(benzalkonium chloride)诱发干眼和角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)。此后，在第三天通过角膜染色(corneal staining)评估小鼠的角膜损伤程度，并在挑选出具有充分角膜损伤的小鼠后，通过随机区组设计(randomizedblock design)对实验组进行分类。接着，从第4天开始，施用0.2％苯扎氯铵1小时后，以每天两次的间隔向眼睛滴注本发明的肽I(0.005％和0.01％)。根据给药溶液的浓度，将上述肽I溶解在生理盐水中，作为阳性对照组施用正在商品化的Allergan公司的Restasis(0.05％环孢菌素(cyclosporin))，及作为阴性对照组施用生理盐水(saline)。

实施例4：改善角膜损伤的效果

本发明人们调查了根据本发明的肽I的施用对干眼和角膜结膜炎的治疗效果。具体地，在干眼诱导的第3、7、11和15天(给药的第0、4、8和12天)用异氟醚(isoflurane)对小鼠进行吸入麻醉，然后向小鼠的眼睛滴注作为荧光染色剂(fluorescence dye)的荧光素(Fluorescein)进行角膜染色(corneal staining)。然后，用生理盐水(saline)洗涤残留的荧光素，然后用荧光显微镜对眼球进行拍照获得图像，并使用图像分析程序(Image J)计算和量化荧光染色面积以评估由干眼和角膜炎导致的角膜损伤程度。

结果是，发现与对照组相比，本发明的肽I的施用在更低浓度下显著改善了角膜损伤(图1和2)。

实施例5：减轻角膜混浊的效果

本发明人们调查了根据本发明的肽I的施用减轻由角膜损伤导致的混浊的效果。具体地，在干眼诱导的第3、7、11和15天(给药的第0、4、8和12天)用异氟醚(isoflurane)对小鼠进行吸入麻醉，然后用显微镜对眼球进行拍照获得图像。通过以0至4分赋分来定量并评估角膜混浊程度，如果无混浊且虹膜清晰可见，则为0分，如果确认部分轻度混浊，则为1分，如果确认部分混浊或整体轻度混浊，则为2分，如果确认角膜整体混浊，则为3分，如果观察到严重混浊和血管发达，则为4分。

结果是，发现与对照组相比，本发明的肽I的施用在更低浓度下显著减轻了角膜混浊(图3和4)。

综上所述，将本发明的新型干眼症治疗用药物组合物施用于小鼠动物模型的结果是，与对照组相比，无副作用地显著减轻了角膜损伤和角膜混浊，因此该组合物可以作为通过修复损伤角膜和增加眼泪分泌来有效治疗干眼症的材料而使用。

虽然已经参照上述实施例对本发明进行了说明，但这仅仅是示例性的。只要是本领域技术人员都将理解，由此可以进行各种变形和等效的其他实施例。因此，本发明真正的技术保护范围应以所附权利要求的技术思想为准。

Claims

1.一种干眼症治疗及预防用药物组合物，其特征在于，

所述组合物含有作为活性成分的具有抗菌活性的肽，所述肽由七个氨基酸组成，所述肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：

BOBWRYm

其中，B是各自可选地选自由赖氨酸(K)或精氨酸(R)组成的群组的碱性氨基酸，O是各自可选地选自由苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)组成的群组的芳香族氨基酸。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，

所述干眼症为水性泪液缺乏型干眼症或蒸发型干眼症。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，

向所述肽的N末端添加辛酰基或向其C末端添加胺基。

4.一种角膜结膜炎治疗用药物组合物，其特征在于，

BOBWRYm

5.一种角膜损伤及角膜混浊改善用药物组合物，其特征在于，

BOBWRYm

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，

所述角膜损伤及角膜混浊由干眼症或角膜结膜炎导致。

7.根据权利要求1至权利要求6中的任一项所述的药物组合物，其特征在于，

所述药物组合物具有选自由软膏、皮肤外用制剂、气雾剂、喷雾剂、滴眼剂、口服制剂、及注射剂组成的群组的制剂。

8.一种用于治疗受试者的干眼症的方法，其特征在于，

所述方法包括将权利要求1的药物组合物施用于患有干眼症的受试者的步骤。

9.一种肽在制备干眼症用治疗剂中的用途，其特征在于，

所述肽具有抗菌活性且由七个氨基酸组成，所述所述肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：

BOBWRYm