CN115873800A

CN115873800A - 一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115873800A
Application number: CN202111127324.8A
Authority: CN
Inventors: 王伊; 宋海峰; 张晶; 王丹枫
Original assignee: Demiao Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Demiao Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明涉及免疫细胞培养技术领域，特别涉及一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用。该全人源体外生发中心培养模型包括：含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，以及幼稚型B细胞。本发明所构建的体外生发中心模型所使用的饲养层细胞为在疫苗生产领域已广泛使用数十年的人源细胞系MRC5(人胚肺成纤维细胞)，与人B细胞相容性好，并且由于生长速度较慢，不需要使用丝裂霉素C处理或者辐射处理使其增殖停滞，避免了处理过程中残留丝裂霉素C对后续使用带来的影响。本发明体外生发中心培养模型培养的B细胞可以用于研究B细胞的活化、分化和功能。

Description

一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫细胞培养技术领域，特别涉及一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用。

背景技术

人体有3道防线以抵御外界抗原侵袭。第一道防线：物理屏障(我们通常认为皮肤是我们最主要的第一道防线)，病毒、细菌、寄生虫和真菌等抗原等若想对机体造成实质性伤害时需要先突破这道物理屏障；第二道防线：固有免疫系统，固有免疫系统是人体中已经进化了数百万年(相当于先天)的免疫系统，通过识别对机体有害的病原体、细菌等，同时对各类抗原起到快速而强力的清除作用，从而保护人体不受侵袭；第三道防线：适应性免疫系统，这是一种可以适应攻击机体的几乎所有抗原的防御系统，B细胞和T细胞是其重要的成员。

B淋巴细胞亦可简称B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。如今使用的大多数疫苗就是通过刺激这类B淋巴细胞产生抗体的。B细胞表面上都存在受体分子，称为B细胞受体(BCRs)。机体的每一种抗体都与一种特殊的抗原结合在一起，因此，为了使抗体能够与许多不同的抗原结合，需要分泌许多不同的抗体分子。在同一个体内，可高达10⁹～10¹²，构成容量巨大的BCR库，赋予个体识别各种抗原、产生特异性抗体的巨大潜能。

体液免疫应答是人体获得性免疫反应的重要环节之一。其中由浆细胞分泌的抗体行使了最主要的功能。初次免疫应答中，浆细胞由成熟的幼稚型B细胞(

B cell)分化而成，而这一分化过程的启动则依赖于幼稚型B细胞中BCR信号通路的激活。B细胞通过其表面分布的BCR特异性识别抗原，从而开启B细胞信号通路的活化以及幼稚型B细胞的增殖分化。在经历了体细胞超突变(somatic hypermutation)和免疫球蛋白亚型转换(classswitching)后，幼稚型B细胞最终分化成针对抗原高亲和力结合的记忆性B细胞或者具有抗体分泌功能的浆细胞，行使体液免疫功能。

生发中心(Germinal center)是成熟的幼稚型B细胞(

B cell)增殖、分化和提高抗体亲和力的区域。在生发中心，发生很多重要的反应，包括B细胞的克隆增殖、体细胞高频突变、亲和力选择以及浆细胞和记忆细胞的分化，对体液免疫有重要的促进作用。生发中心的研究意义在于：1.生发中心发育的机制尚不明确，并且生发中心是一种瞬时结构，目前人生发中心的研究材料主要来源于医院手术切除的扁桃体，取材困难，因此想要直接获得人体样本来进行研究存在一定困难。而体外生发中心模型的建立在一定程度上解决了取材受限的困境，有助于对B细胞在生发中心中的发育以及异常生发中心进行研究。2.通过体外生发中心模型的建立，在B细胞增殖过程中，可以实现BCR体细胞高频突变(Somatichypermutation)，从起始量很少的

B细胞就获得序列多样化的BCR库，为获得高亲和力的全人源抗体库、研发全人源抗体药物提供基础，同时也可以获得具有一定亲和力的特异性B细胞用于细胞治疗等研究，以及开发针对肿瘤的预防性疫苗。

目前，生发中心体外培养技术主要是针对小鼠体外生发中心培养模型，部分针对人体外生发中心模型的建立中所用饲养层细胞也为鼠源细胞(如NIH/3T3)。如：

1)在小鼠NIH/3T3细胞系(小鼠胚胎成纤维细胞)上构建表达鼠CD40LG和鼠TNFSF13B蛋白的饲养层细胞。通过辐射使细胞失去增殖能力。

2)从小鼠脾脏中获取

B细胞。

3)将小鼠

B细胞与饲养层细胞进行共培养，在第一阶段添加IL4因子；在第二阶段添加IL21因子或者持续使用IL4因子。

4)虽然第二阶段添加的因子不同免疫球蛋白亚型转换(class switching)的方向也不同，但均可以激活

B，使其在体外扩增并产生体细胞高频突变变(somatichypermutation)、免疫球蛋白亚型转换(class switching)。

又如：

1)基于小鼠NIH/3T3细胞系构建表达人CD40LG的饲养层细胞。通过辐射或丝裂霉素C使细胞失去增殖能力。

2)将人PBMC细胞与饲养层细胞共培养，通过加入Cyclosporin A抑制T细胞增殖，但不影响B细胞增殖。

3)在Day0-Day14添加IL4因子，可以激活

B细胞，使其进行体外扩增。

但其首要缺点在于从该生发中心模型中获取的B细胞可能会存在含有动物源成份的风险，因此可能会限制从该模型中获取的B细胞的使用(如开发针对肿瘤的治疗性抗体或预防性疫苗)。另外，鼠源饲养层细胞对人B细胞的相容性也存在问题，对B细胞的激活、增殖、分化发育的影响与人体内差异较大。第三，鼠源NIH/3T3细胞生长速度快，使用时需要辐射源照射或药物处理，对成本、安全性均有不良影响。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用。本发明建立的一套基于全人源系统的体外生发中心培养模型在一定程度上，更接近人体生发中心。只要在生产过程中采用成份明确的、非动物源成份培养体系，则能完全避免动物源成份。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种全人源体外生发中心培养模型，该全人源体外生发中心培养模型包括：含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，以及幼稚型B细胞。

作为优选，人胚肺成纤维细胞为人源细胞系MRC5。

本发明还提供了该全人源体外生发中心培养模型的制备方法，包括如下步骤：

将人CD40LG和TNFSF13B基因插入慢病毒载体质粒，得到重组质粒；

将重组质粒转染入HEK293T细胞，进行病毒包装，得到慢病毒；

将慢病毒转染入人胚肺成纤维细胞，得到含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞；

将幼稚型B细胞接种于含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，得到全人源体外生发中心培养模型。

作为优选，病毒载体质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro。

作为优选，人胚肺成纤维细胞为人源细胞系MRC5。

本发明还提供了一种幼稚型B细胞的增殖分化培养方法，包括如下步骤：

采用上述含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞，加入B细胞培养基，接种幼稚型B细胞，加入IL4，进行第一阶段培养；

将第一阶段培养后的细胞进行第二阶段培养。

作为优选，第一阶段培养的培养时间为3～5天。

作为优选，第二阶段培养的细胞培养因子为IL4或IL21。

作为优选，IL4或IL21的添加浓度为1～10ng/mL。

作为优选，第二阶段培养的培养时间为4～15天。

作为优选，幼稚型B细胞与饲养层细胞的细胞数量比为1:10～1:1。

本发明提供了一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用。该全人源体外生发中心培养模型包括：含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，以及幼稚型B细胞。本发明具有的技术效果为：

本发明所构建的体外生发中心模型所使用的饲养层细胞为在疫苗生产领域已广泛使用数十年的人源细胞系MRC5(人胚肺成纤维细胞)，与人B细胞相容性好，并且由于生长速度较慢，不需要使用丝裂霉素C处理或者辐射处理使其增殖停滞，避免了处理过程中残留丝裂霉素C对后续使用带来的影响(如应用于人体)。

本发明建立的基于全人源体系的体外生发中心培养模型培养的B细胞可以用于研究B细胞的活化、分化和功能。此外，该模型还具有开发治疗性抗体(从康复患者血清中提取分离抗病毒B细胞、体外亲和力成熟优化抗体药物结构等)或作为预防性疫苗产品开发平台等多种应用前景，只要使用成份明确的培养基、试剂就可以避免动物源成份，满足GMP生产法规要求。

附图说明

图1 293T感染荧光图片；

图2流式检测结果；

图3 MRC40LB GFP检测；

图4

B细胞经hiGC培养后形态变化(10X照片)；

图5

B细胞经hiGC培养后形态变化(40X照片)；

图6

B细胞增殖情况；

图7

B细胞表面marker变化情况；

图8

B细胞AID表达变化情况；

图9 293T40LB细胞GFP检测；

图10流式检测细胞CD40LG表达情况；

图11 293T40LB经MMC处理后形态图片；

图12 293T40LB与

B细胞共培养后的形态图片。

具体实施方式

本发明公开了一种全人源体外生发中心培养模型及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

抗体药物：抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。

免疫细胞治疗：细胞免疫治疗也称为生物免疫疗法中的细胞治疗方法，主要包括三种免疫细胞的疗法－DC、CIK、DCCIK。具体方法是:通过提取患者体内不成熟的免疫细胞(采血)，在实验室中进行活化培养使其具有高效识别和细胞的能力后，再回输患者体内。患者只需配合做采血与回输血两个步骤，无需住院。疗法优点凸显在：通过采集人体自身免疫细胞，经由体外培养使其数量成千上万倍增多，进而使免疫细胞的靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体以杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破机体免疫耐受，激活和增强机体的免疫力，具有治疗和防治双重功效。一般采用自体细胞。

本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1基因合成人CD40L(CD40LG)和BAFF(TNFSF13B)基因

基因信息：

>NM_006573.4|TNFSF13B[Human]|CDS 858bp，GeneID:10673

>NM_000074.2|CD40LG[Human]|CDS 786bp，GeneID:959

2克隆构建目的质粒

1)线性化载体

pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro通过EcoRI和BamHI酶切线性化。

酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的片段胶回收。

2)使用无缝组装试剂盒插入CD40LG和BAFF基因

将目的基因片段和线性化载体以摩尔比1:1加到离心管中进行重组反应：

3)将链接片段转化到Ecol.DH5α中，通过菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl作为模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

PCR反应液组成

PCR反应条件

2 Step PCR

4)阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。

3包装病毒

1)转染前一天HEK293T细胞消化传代至100mm培养皿中，培养24h后，转染时密度为70-80％。

2)转染前1h，取出细胞去除原培养基，加入10ml Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。

3)制备转染试剂和质粒的复合物

A将待转染的病毒载体质粒复合物32μg溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5分钟。

B将转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。

C将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放20min。

4)取出细胞，将配制孵育好的质粒-转染试剂复合物加入到细胞中，放回培养箱。

5)6-8h后吸去培养基，PBS洗一遍，加入新鲜培养基培养。

6)转染后48h，收集细胞上清，同时细胞换新鲜培养基。

7)转染后72h，再次收集细胞上清，与48h上清合并。

8)将上清于3500rpm离心10min，弃去沉淀。

9)用0.22μm滤膜过滤离心后上清，分装到超速离心管中，30000rpm，4℃离心2小时。

10)离心结束后可见管壁有白色沉淀物(病毒)，在生物安全柜打开离心管，弃掉上清，倒扣在吸水纸上，弃去残液。

11)每管用100-200μl预冷的DPBS重悬白色沉淀，转移到EP管中，4℃过夜。

12)6000rpm离心5min，0.22μm滤膜过滤后分装，-80℃冰箱保存备用。

4慢病毒滴度测定

1)感染前一天，将293T细胞按1E+5个接种到24孔板中。

2)将病毒进行梯度稀释，分别取样感染细胞。

3)细胞正常培养、换液、保持正常生长。

4)感染后72h拍照GFP。记录细胞感染后的情况。

5)收集细胞，提取基因组DNA。

6)测定：针对病毒特定载体元件WPRE设计定量PCR引物

①按比例配制QPCR反应体系：

②按照两步法进行QPCR检测

预变性95℃，30s之后每一步变性95℃，10s，退火延伸60℃，30s，共进行34个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。

5病毒滴度计算

测定的DNA样品中整合的慢病毒整体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(Transducing Units/ml,TU/ML)的计算公式如下：

TU/ml＝(C×N×100)/V

注：C＝平均每基因组整合的病毒特定基因序列拷贝数

N＝感染时细胞的数目(约为2E+5)

V＝加入的病毒的体积数

病毒检测结果：

表1

项目	V值	C值	N值	D值	滴度	平均滴度
							1	10	21.79	2.00E+05	1	4.36E+08
2	1	2.42	2.00E+05	1	4.84E+08	5.04E+08
							3	0.1	0.29	2.00E+05	1	5.73E+08

293T感染荧光图片见图1。

6构建稳定表达CD40LG及BAFF细胞株MRC40LB(构建后细胞株命名为MRC40LB)

1)MRC5细胞按1.5e5个/孔种6孔板。

2)24h后取出细胞，吸去原培养基，加入2ml新鲜培养基，按MOI＝30计算，滴加12μl病毒，轻轻晃匀，放回培养箱培养。

3)16-20h换新鲜培养基。

4)48h后换新鲜培养基

5)72h后换新鲜培养基，并添加终浓度为1μg/ml的puromycin.之后正常培养细胞，保证细胞正常生长。细胞密度达80％左右时传代。

6)流式检测细胞CD40LG、BAFF表达

用0.05％胰酶消化3min，吸去胰酶，加入2ml完全培养基重悬细胞，台盼蓝计数。取2E+5个细胞每孔，PBS洗2遍。100μl PBS重悬。分别加入1μl抗CD40LG抗体和抗BAFF抗体，室温、避光孵育30min。PBS洗3遍。300μl PBS重悬，流式检测。流式检测结果见图2，MRC40LBGFP检测结果见图3。

7用

B细胞分选试剂盒从人PBMC中分选获得

B细胞

1)配制分选Buffer：BSA 1g；EDTA：74g，1XPBS 100ml，0.2um过滤。配制B细胞培养基：164044ml；灭活FBS 5ml；HEPES 500μl，AA 500μl，β-Me:50μl。

2)从-80℃取出PBMC，迅速放入37℃解冻。将PBMC转移到15ml离心管加入2ml B细胞培养基，400g离心10min。B细胞培养基洗2遍，每次3ml，400g离心10min。5ml PBS重新细胞。按8×10⁷个细胞分选。320μl分选Buffer重悬细胞，加入80μl混合抗体，轻弹后拧紧管盖，放入4℃冰箱静置5min。加入240μl Buffer，加入1600μl磁珠，轻弹放入4℃冰箱静置10min。LS柱用4ml Buffer预处理。待Buffer全部流出，滴加细胞，换干净的收集管收集流穿的细胞。加入3ml Buffer洗LS柱，收集流穿液。重复3次。将LS柱从磁力架上取下，加入5mlBuffer，用柱推将液体推出LS柱并收集。B细胞培养基洗2遍后备用或用细胞冻存液冻存。按总细胞数计算

B细胞回收率为10％左右。

8 hiGC(human in-vitro Germinal center)

将MRC40LB按2E+5个接种到六孔板中。24h后，吸去所有培养基，换成新鲜B细胞培养基。再按1:10-1:1(

:MRC40LB)接种

B细胞。

阶段一：将验证好的MRC5LB细胞按2E5个接种到六孔板中，24h后，用PBS将细胞洗2遍以去除残留puromycin，加入8ml BCM(B cell culture medium)。将

B细胞按2E5个加入到饲养层细胞中。加入终浓度为1-10ng/ml IL4，隔天换液。持续培养4天。阶段二：持续使用IL4或将IL4改为IL21，持续培养至实验结束，一般培养4-15天。在培养的第4、6、8、10、12、14天对细胞进行计数，检测细胞增殖情况。

B细胞经hiGC培养后形态变化：如图4、5所示，10X照片：细胞呈现明显的克隆增殖；40倍照片：细胞呈现出明显的形态变化，有“触手产生”。

B细胞增殖情况结果见图6。

9流式检测细胞表面marker变化情况(图7)

在培养的第8、10、12、14、19天，按1E+5个细胞每管准备4管细胞，分别加入抗体；室温避光孵育30min后，3ml PBS洗1次，300μl PBS重悬，上机检测。

B细胞在培养过程中发生逐步分化为生发中心型B细胞(CD38⁺CD27⁺)，FAS95表达上调，符合生发中心B细胞发育途径中表面marker变化规律。

10

B细胞AID表达变化情况

AID酶表达显著升高，说明细胞在培养过程中具有体细胞高频突变能力(表2、图8)

表2

	Sample	Control	Expression	ExpressionSD
					1	N.B_6well/tir-CD40LG		22.91698	0.13196
2	N.B_48well/tir-CD40LG_coated		5.00026	0.06615
					3	PBMC*	Control	1.00000	0.49151
4	T+B(10:1)		1.41581	0.16891
					5	MRC5_MOI30_N.B		213.35930	0.02604
6	B4A3		1.59345	0.21287

综上说明，本发明成功建立了一种基于全人源体系的人源体外生发中心培养模型，为其后续使用中排除动物源成份提供基础。

对比例1构建稳定表达CD40LG及BAFF细胞株293T40LB(构建后细胞株命名为293T40LB)

1 293T细胞按1.5e5个/孔种6孔板。

2 24h后取出细胞，吸去原培养基，加入2ml新鲜培养基，按MOI＝30计算，滴加12μl病毒，轻轻晃匀，放回培养箱培养。

3 16-20h换新鲜培养基。

4 48h后换新鲜培养基。

5 72h后换新鲜培养基，并添加终浓度为1μg/ml的puromycin.之后正常培养细胞，保证细胞正常生长。细胞密度达80％左右时传代。

6 荧光显微镜拍摄293T40 LB细胞表达GFP情况(图9)

7 流式检测细胞CD40LG表达情况

用0.05％胰酶消化3min，吸去胰酶，加入2ml完全培养基重悬细胞，台盼蓝计数。取2E+5个细胞每孔，PBS洗2遍。100μl PBS重悬。加入1μl抗CD40L抗体，室温、避光孵育30min。PBS洗3遍。300μl PBS重悬，流式检测。结果见图10。

8 MMC(丝裂霉素C)处理细胞(图11)：

8.1配制MMC溶液:储存试剂为粉末2mg，用1ml DMEM(无血清)溶解配制成浓度为2mg/ml。配制工作液为：260μl MMC储存液+26ml 293T培养基(DMEM+10％FBS)。MMC溶液先配制现用。

8.2吸干净细胞培养基并收集至50ml离心管中，轻轻加入1ml MMC工作液。由于细胞悬浮较多，因此将原上清用800rpm离心5min后，将细胞沉淀用4ml MMC工作液重悬后平均加入到各孔中。

8.3细胞正常培养2.5h。

制备后的细胞可立即进行后续实验，也可以用细胞冻存液冻存后复苏使用。

9 293T40LB与B细胞共培养(图12)：

将经过MMC处理的293T40LB，PBS洗3次以去除MMC残留，按2E+6个接种到六孔板中。正常培养12-24h使细胞贴壁，小心吸去所有培养基，换成新鲜B细胞培养基。再按1:10-1:1(

:293T40LB)接种

B细胞。

结论：293T细胞本身贴壁不牢，同时增殖较快，因此需要用丝裂霉素C处理293T40LB以抑制其增殖，但处理后细胞贴壁更加不牢固，并且极易成细胞团，导致铺板不均匀。与B细胞共培养后未见B细胞有明显的增殖及表型变化，因此不再继续研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种全人源体外生发中心培养模型，其特征在于，所述全人源体外生发中心培养模型包括：含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞，以及幼稚型B细胞。

2.根据权利要求1所述的全人源体外生发中心培养模型，其特征在于，所述人胚肺成纤维细胞为人源细胞系MRC5。

3.权利要求1或2所述全人源体外生发中心培养模型的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将重组质粒转染入HEK293T细胞，进行病毒包装，得到慢病毒；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述病毒载体质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述人胚肺成纤维细胞为人源细胞系MRC5。

6.一种幼稚型B细胞的增殖分化培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用权利要求1或2所述含有人CD40LG和TNFSF13B基因的人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞，加入B细胞培养基，接种幼稚型B细胞，加入IL4，进行第一阶段培养；

将第一阶段培养后的细胞进行第二阶段培养。

7.根据权利要求6所述的增殖分化培养方法，其特征在于，所述第一阶段培养的培养时间为3～5天。

8.根据权利要求6所述的增殖分化培养方法，其特征在于，所述第二阶段培养的细胞培养因子为IL4或IL21。

9.根据权利要求6所述的增殖分化培养方法，其特征在于，所述第二阶段培养的培养时间为4～15天。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的增殖分化培养方法，其特征在于，所述幼稚型B细胞与所述饲养层细胞的细胞数量比为1:10～1:1。