CN115873761A - 一种植物乳杆菌ksfy01及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌KSFY01及其应用，属于微生物领域。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.15654，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年04月28日。本发明通过建立小鼠衰老模型，探究菌株KSFY01的抗氧化作用和提高小鼠运机能力的效果。实验结果表明，该菌株能通过改善代谢产物累积、糖原存储、肌肉和肝肾脏损伤以及氧化应激，从而提高衰老小鼠的抗疲劳能力和运动能力。为今后开发用于抗疲劳和改善老年人运动功能的食源性抗氧化剂提供了参考，对益生菌资源的开发利用具有重要意义。

Description

一种植物乳杆菌KSFY01及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种植物乳杆菌KSFY01及其应用。

背景技术

衰老是一个综合性的生理变化过程，是生物个体必然经历的阶段。目前社会老龄化不断加剧，预计到2050年全球60岁以上人口将达到21亿。衰老会使机体的代谢速率降低，抗氧化系统失衡，自由基不能及时被清除导致其在体内堆积，血浆及组织的过氧化脂质含量增加，机体抗疲劳能力亦逐渐下降。有研究发现，端粒长度在进行剧烈有氧运动的健康老年人中得以保留，并且与最大有氧运动能力呈正相关，说明良好运动能力可能会延缓衰老。同时经常运动的人心率较慢、血压和胆固醇水平较低，这些状态都直接体现出运动能力与衰老有关联。机体衰老引起的器官和肌肉功能下降、疲劳感增强都导致运动能力下降；保持合理的运动则可以改善人体机能、缓解身体的疲劳状态，保持机体活力，因此机体衰老和运动能力是相互影响的，机体健康既是良好运动能力的体现，良好的运动能力又能够促进持续运动，从而延缓衰老。

在正常的生理状态下，生物体进行有氧代谢会不断产生氧自由基(ROS)，攻击组织细胞，当氧自由基的损伤能力大于机体的修复能力时，就会造成机体的衰老。同时，机体的衰老过程中体内的抗氧化酶活性和非酶抗氧化能力均明显下降，引起体内自由基持续积累，导致正常的代谢受到影响，使机体的疲劳度增强，运动能力随之下降，造成老年人群的生活质量下降。因此，氧化应激、衰老和运动能力之间具有密切的联系，通过干预机体抗氧化能力，增强运动机能既是延缓衰老的有效途径；同时，机体衰老的减缓又使机体器官活力和肌肉活性加强，从而促进运动机能的加强。对机体补充外源性抗氧化剂，阻止细胞易氧化底物的氧化、抑制脂质过氧化反应并直接清除体内氧自由基，达到降低体内氧化应激，是延缓体力疲劳的有效方法之一。

益生乳酸菌(LAB)功能开发和利用是目前国内外食品生物工程领域研究的热点。大量对乳酸菌的益生功能特性的研究结果显示，许多的乳酸菌都具有抗氧化的功能，但不同菌株抗氧化能力之间存在差异性。益生菌的研究很多，然而目前国内外鲜见关于其对运动能力影响的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物乳杆菌KSFY01及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌株能通过改善代谢产物累积、糖原存储、肌肉和肝肾脏损伤以及氧化应激，从而提高衰老机体的抗疲劳能力和运动能力，为今后开发用于抗疲劳和改善老年人运动功能的食源性抗氧化剂提供了参考，对益生菌资源的开发利用具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种植物乳杆菌KSFY01，其已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.15654，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期为2018年04月28日。

本发明还提供一种所述植物乳杆菌KSFY01在制备提高机体运动能力产品中的应用。

进一步地，通过提高机体运动耐力、改善代谢物累积以及缓解机体损伤，达到缓解疲劳和提高机体运动能力的效果。

进一步地，所述改善代谢物累积具体为降低机体血清中CK、ALT和AST水平。

进一步地，所述缓解机体损伤包括缓解肝脏、肾脏和肌肉损伤；所述机体包括衰老机体。

本发明还提供一种所述植物乳杆菌KSFY01在制备抗氧化产品中的应用。

进一步地，所述植物乳杆菌KSFY01通过调控机体Nrf2信号途径的分子表达，提高机体的抗氧化能力。

本发明还提供一种所述植物乳杆菌KSFY01在制备提高机体抗疲劳能力产品中的应用。

本发明还提供一种提高机体运动能力、抗疲劳能力和减缓机体衰老的产品，所述产品包含有效剂量的植物乳杆菌KSFY01。

进一步地，所述植物乳杆菌KSFY01包括植物乳杆菌KSFY01菌悬液，所述菌悬液在机体中的有效剂量为1.0×10⁹-1.0×10¹⁰CFU/kg。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过建立小鼠衰老模型，探究L.plantarum KSFY01的抗氧化作用和提高小鼠运机能力的效果。实验结果表明，L.plantarum KSFY01能通过改善代谢产物累积、糖原存储、肌肉和肝肾脏损伤以及氧化应激，从而提高衰老小鼠的抗疲劳能力和运动能力。为今后开发用于抗疲劳和改善老年人运动功能的食源性抗氧化剂提供了参考，对益生菌资源的开发利用具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为菌株的革兰氏染色镜检图；

图2为本发明的实验设计流程示意图；

图3为各组小鼠的运动力竭时间；

图4为各组小鼠肝组织的H&E病理观察图；

图5为各组小鼠肾组织的H&E病理观察图；

图6为各组小鼠肝组织中mRNA的表达；A-F依次为SOD1、SOD2、CAT、IL-10、IL-1β和TNF-α；

图7为各组小鼠肝组织中mRNA的表达；A-D依次为HO-1、Nrf2、γ-GCS和NQO-1；

图8为各组小鼠骨骼肌组织中mRNA的表达；A-F依次为SOD1、SOD2、CAT、IL-10、 IL-1β和TNF-α；

图9为各组小鼠骨骼肌组织中mRNA的表达；A-D依次为HO-1、Nrf2、γ-GCS和NQO-1。

具体实施方式

1材料和方法

1.1实验菌株的分离、鉴定和保藏

1.1.1菌株的分离纯化

分别取1mL酸奶样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-6，然后取10^-4、10^-5、10^-6 3个梯度的菌液100μL进行平板涂布，37℃培养24-48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。

1.1.2乳酸菌的初步鉴定

挑取平板上的纯菌落接种于5mL MRS液体培养基中，37℃培养24h。取上述含菌培养基1mL于无菌离心管中，4000r/min离心10min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，在100倍油镜下，革兰氏染色观察到乳酸杆菌菌株细胞形态如图1所示，细胞形态有长杆、短杆，且不存在出芽生殖。革兰氏染色镜检为阳性，初步鉴定为乳酸菌。

1.1.3乳酸菌DNA提取

将已纯化的疑似目标菌株接种于MRS肉汤中，37℃培养18-24h后，采用细菌基因组DNA 提取试剂盒进行DNA提取。将提取完成的DNA做好编号，放于-20℃冰柜保藏备用。

1.1.4基因组DNAPCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

提取完的DNA进行PCR扩增，其中上游引物27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')1μL、下游引物1495R(5'－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3')1μL，2×Taq plus Buffer 12.5 μL、模板DNA 1μL，用无菌dd H₂O将体系补足至25μL。并以无菌超纯水替代模板DNA作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环，最后72℃延伸5min。

然后取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，电泳条件为110V， 45min。将检测成功的PCR产物送往北京擎科生物技术有限公司进行测序，测序结果如下：

TGGGGGCTGCTATGATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCAT GATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAG CGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCC GAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATG GTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCA CATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC AATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAA AACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAA CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGC CTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAC AGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGA AGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCC CTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGA AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAG CTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTC CCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCAC TCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCG CGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTA CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGG CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTA ACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGACAGATGGG。

将测序成功的序列使用NCBI中的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序进行比对分析。明确菌株KSFY01为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

1.1.5菌株KSFY01的保藏

菌株KSFY01的分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2018年04月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号：CGMCC No.15654。

1.1.6植物乳杆菌KSFY01菌悬液的制备

将冻存在-80℃的菌种接种于灭菌MRS培养基中复苏，复苏条件：37℃，培养18-24h，共活化两代。取第二代菌悬液，5000r/min离心10min，弃去上层培养基加入同体积0.9％生理盐水重新制成菌悬液。

1.2实验动物分组与给药

本发明利用D-半乳糖建立小鼠衰老模型，选择50只雄性昆明小鼠，6周龄，购买于重庆医科大学动物实验中心。正式实验前，小鼠放置于12小时光/暗循环条件下适应性喂养一周，自由饮食和饮水。一周适应期结束，将小鼠平均分为5组(10只每组)，分为正常组、模型组、维生素C组(VitC)、KSFY01高剂量组(KSFY01-H)和KSFY01低剂量组(KSFY01-L)。实验周期为10周，实验开始后除正常组外其余各组小鼠每日腹腔注射D-半乳糖溶液(120mg/kg)，持续6周，正常组小鼠则腹腔注射等量生理盐水。从第7周开始正常组和模型组小鼠每日灌胃蒸馏水(0.02mL/kg b.w.)；VitC组小鼠每日灌胃150mg/kg b.w.维生素C；KSFY01-H组小鼠每日灌胃L.plantarum KSFY01菌悬液，剂量为1.0×10¹⁰CFU/kg；KSFY01-L组小鼠每日灌胃 L.plantarum KSFY01菌悬液，剂量为1.0×10⁹CFU/kg，持续灌胃4周。10周后小鼠进行跑步力竭实验，记录每组小鼠力竭时间，然后立即对小鼠进行眼球取血后脱颈处死，快速取其肝脏、肾脏组织，用于后续实验。图2为本发明的实验设计流程示意图。

1.3小鼠跑步实验

10周后小鼠进行跑步力竭实验，将小鼠跑步滚轮设置为20rpm/min，强迫小鼠在滚轮上进行跑步，小鼠停止跑步时进行电击，连续电击5次，直到力竭，记录此过程的跑步时间。

1.4小鼠血清中生化指标和能量代谢指标的测定

取小鼠眼球血于1.5mL离心管中，置于4℃冰箱30min后离心。离心条件：3000rpm、4℃、 10min；取适量的血清，采用生化试剂盒测定小鼠血清中血尿素氮(BUN)，游离脂肪酸(NEFA)，乳酸(LD)，乳酸脱氢酶(LDH)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA) 的水平以及肌肉中的肌糖原。同时也采用酶联免疫的方法测定小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)，丙氨酸转氨酶(ALT)，肌酸激酶(CK)活性。

1.5小鼠肝脏、肾脏的病理学切片观察

小鼠解剖后，立即取部分小鼠肝脏，肾脏组织，置于10％中性福尔马林溶液中进行固定，然后将固定的组织置于4℃环境下脱水处理48h，然后采用石蜡对组织样品进行包埋，再将包埋的组织切成5～10μm薄片后用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，H&E)染料染色，最后在光学显微镜下观察组织的病理变化。

1.6实时荧光定量PCR

使用实时定量PCR(RT-qPCR)测量小鼠肝脏、肌肉组织中SOD1、SOD2、CAT、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)、血红素加氧酶1(HO-1)、核因子-红细胞2相关因子2(Nrf2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、NAD(P)H脱氢酶[醌]1(NQO-1)的mRNA表达。

第一步提取肝脏和肌肉组织中RNA。从-80℃冰箱取出小鼠肝脏组织和肌肉组织，称取 100mg于匀浆管中，加入1mL TRIzol试剂和匀浆珠进行提取。第二步利用核酸分析仪测定所提取RNA浓度，纯度值在1.8-2.0间方可进行后续试验。第三步用赛默飞试剂盒，按照步骤将 RNA反转录为cDNA，分装cDNA，置于-80℃冰箱保存备用。第四步以反转录的cDNA为模板，加上荧光染料，放入荧光定量PCR仪中反应。RT-PCR反应体系均为20μL，反应条件为：95℃60s预热，95℃15s，55℃30s，72℃35s，40个循环，最终在95℃30s和55℃下测试35s，每个反应进行4次。实验以β-actin基因作为内参基因，采用2^-ΔΔCt相对定量法测定目标mRNA相对表达水平。本研究中所用的内参基因和目的基因引物序列见表1。

表1实时定量PCR所用引物序列

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1.7数据分析

所有数据表示为平均值±标准差(means±SD)，采用Graph Pad Prism(version7.00)软件绘图。使用SPSS软件(SPSS 22.0,SPSS Inc.)对数据进行统计分析，采用ANOVA分析和 Duncan’s检验评价样品各参数的差异显著性(p<0.05)。

2结果

2.1植物乳杆菌KSFY01对衰老小鼠运动耐力的影响

由图3可知正常组小鼠跑步时间为各组中最长，而衰老模型组运动时间则最短。相比衰老模型组，L.plantarum KSFY01和维生素C均能显著(p<0.05)延长衰老小鼠的跑步时间，而且L.plantarum KSFY01高剂量组的延长效果最好，效果显著优于L.plantarumKSFY01低剂量组和Vit C组。

2.2小鼠的能量代谢指标

如表2所示，正常组小鼠血清中的BUN、NEFA和LD水平均显著(P<0.05)低于其他各组，而MG和LDH含量则显著(P<0.05)高于其他组。而衰老模型组小鼠血清的以上指标呈现出和正常组相反的趋势。相对衰老模型组，L.plantarum KSFY01和维生素C可以使衰老小鼠血清中的BUN、NEFA和LD水平下降，而使LDH和MG含量升高。实验结果表明，L. plantarumKSFY01可以降低小鼠运动后产生的BUN，并且增加了LDH的活力，降低了LD的含量，使小鼠的疲劳程度有所缓解。

表2小鼠血清中BUN，NEFA，LD，LDH和肌肉组织中MG水平

注：数据表示为平均值±标准偏差。a-e同列不同字母上标的值表示差异显著(P<0.05)。 Vit C：维生素C处理的小鼠(200mg/kg)；KSFY01-H：植物乳杆菌KSFY01处理的小鼠(1×10¹⁰ CFU/kg)；KSFY01-L：植物乳杆菌KSFY01处理的小鼠(1×10⁹CFU/kg)。

2.3小鼠的运动损伤指标

由表3可知，维生素C，L.plantarum KSFY01高、低剂量组的ALT、AST、CK含量介于模型组和正常组之间。L.plantarum KSFY01菌悬液和维生素C均有良好的效果可以缓解由于D-半乳糖引起的ALT、AST、CK含量的增加。其中高剂量L.plantarum KSFY01组和维生素C 组效果优于低剂量L.plantarum KSFY01组。

表3小鼠血清中ALT、AST和CK水平

注：数据表示为平均值±标准偏差。a-d同列不同字母上标的值表示差异显著(P<0.05)。

2.4小鼠的抗氧化指标

如表4所示，本研究对血清中过氧化氢酶、谷胱甘肽和过氧化物MDA水平进行检测，与正常组相比，模型组CAT酶活力显著下降(p<0.05)，GSH含量也显著降低，经维生素C和L.plantarum KSFY01干预后，血清中的CAT酶活力被提高，其中高剂量L.plantarum KSFY01的效果优于维生素C和低剂量L.plantarum KSFY01。与模型组比较，维生素C和L.plantarumKSFY01明显降低了MDA含量(p<0.05)，其中高剂量L.plantarum KSFY01的效果最好。

表4小鼠血清中CAT、GSH和MDA水平

2.5小鼠肝脏、肾脏组织切片分析

小鼠显微镜下的肝组织形态见图4，正常组小鼠肝小叶结构清晰且完整肝脏细胞无明显变化，未见颗粒变性、空泡变性、肝细胞肿大、坏死等现象。D-半乳糖诱导的衰老模型组小鼠肝小叶结构被破坏，肝细胞的排列出现混乱，包浆中还出现许多大小不等的空泡，显微镜视野下还出现炎症浸润并伴有细胞坏死。维生素C和L.plantarum KSFY01均可以减轻衰老小鼠肝细胞的损伤，KSFY01-H作用后肝小叶结构基本完整，肝细胞变性明显改善，细胞边界较为清晰，形态较完整，而KSFY01-L组和Vc组小鼠肝脏组织包浆中还出现许多大小不等的空泡。

小鼠显微镜下的肾脏组织形态见图5，正常组肾小球血管袢薄而清晰。内皮细胞和系膜细胞数目正常。周围的肾小管也正常。衰老模型组小鼠肾脏组织中的肾小球形态不规则，部分肾小球破裂，肾小球肿胀，组织间有炎性细胞浸润。维生素C和L.plantarum KSFY01均能减轻衰老造成肾脏组织损伤，炎症细胞浸润不同程度下降。

2.6肝脏组织中mRNA的表达

如图6和图7，正常组小鼠肝脏组织中的IL-1β和TNF-αmRNA表达强度最弱(图6中E-F)， IL-10、Cu/Zn-SOD(SOD1)、Mn-SOD(SOD2)、CAT、HO-1、Nrf2、γ-GCS和NQO1表达最强(图6中A-D和图7中A-D)；而衰老模型组小鼠的IL-1β和TNF-α表达最强，IL-10、 Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、HO-1、Nrf2、γ-GCS和NQO1表达最弱。维生素C和L.plantarum KSFY01可以下调衰老小鼠肝脏组织中的IL-1β、TNF-α表达和上调IL-10、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、 CAT、HO-1、Nrf2、γ-GCS和NQO1表达，且L.plantarum KSFY01高剂量组对这些表达的调控能力最强，使这些表达接近正常组小鼠。

2.7肌肉组织中mRNA的表达

我们也对小鼠肌肉组织中的Nrf2通路相关基因也进行了分析。IL-10、IL-1β、TNF-α、SOD1、SOD2、CAT、HO-1、Nrf2、γ-GCS和NQO1是该途径中的氧化基因。当Nrf2表达发生变化时，这些基因会异常表达。如图8中A-F和图9中A-D所示，与正常组相比，模型组肌肉组织中IL-10、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、HO-1、Nrf2、γ-GCS和NQO1 mRNA的表达水平显著降低(p＜0.05)，IL-1β和TNF-αmRNA表达强度显著增加(p＜0.05)。与模型组相比，维生素C和L.plantarum KSFY01干预大大改善了这些基因的表达量(p＜0.05)，使其与正常组更接近。另外，L.plantarum KSFY01的调节作用以剂量依赖性方式增强。高剂量L.plantarumKSFY01调节效果好于低剂量L.plantarum KSFY01。该结果表明，L.plantarum KSFY01对衰老引起的小鼠肌肉损伤有正向影响。

3结果分析

本研究通过腹腔注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型来观察L.plantarum KSFY01对小鼠耐力跑步的影响，以此来验证L.plantarum KSFY01在衰老状态下对运动能力的干预作用。实验结果证实L.plantarum KSFY01能够延长小鼠耐力跑步的时间，起到了增强运动能力的效果，具有缓解疲劳的作用。

长时间持续的运动是机体产生疲劳的重要原因，本研究设计了高强度运动跑台实验，使小鼠出现运动疲劳状态。血清LA，LDH和BUN水平可以说明疲劳发展的速度和程度。此外，小鼠长时间高强度运动中体力的衰竭与MG含量的变化有关，当机体经过一段时间的运动后，体内的糖原会分解成乳酸，并释放出能量来供肌肉运动，MG储备量越多，机体的耐力就越好，运动时间就越长。本研究中，与模型组比较，维生素C和L.plantarum KSFY01干预后会大幅度减弱这些代谢产物的累积，调节血糖水平，其中L.plantarum KSFY01还通过调节LDH水平降低了肌肉损伤。这表明L.plantarum KSFY01能通过有效地减少代谢副产物的积累，改善肌肉损伤和提高能量存储而缓解疲劳。

越来越多的证据表明，高强度运动或者急性锻炼可能会通过减少肝脏和门静脉的血流量来损伤肝细胞，经常会引起肝细胞缺氧，最终导致肝脏坏死。这种损伤通常伴随着CK、AST和 ALT水平升高。本研究中也发现，运动疲劳造成肝功能指标血清CK、ALT和AST水平显著增加，引起了肝功能障碍，在维生素C和L.plantarum KSFY01的干预下能逆转这种变化。

在运动过程中，会产生许多自由基，例如羟基自由基和超氧阴离子自由基，称为活性氧 (ROS)，这种现象在衰老状态下尤为明显。CAT、GSH等都是人体自身具有的重要的抗氧化剂和自由基清除剂，它们的存在可以维持机体正常的氧化应激水平，清除多余的自由基。另外， ROS的积累过量会引起氧化应激反应，并攻击生物大分子，比如脂质、蛋白质，核酸等，而形成脂质过氧化产物MDA。MDA又进一步的破坏细胞膜的结构，导致细胞肿胀进而坏死，因此MDA在机体中的水平也能间接反映机体自由基代谢的变化和组织过氧化损伤的程度。维生素C和L.plantarum KSFY01干预后，降低了小鼠血液中MDA的含量，增加了CAT和GSH的含量。因此，本研究的结果表明，L.plantarum KSFY01具有有效的抗氧化活性，抑制衰老而发挥增强运动耐力和能力的效果。

在氧化应激方面，为了阐明在衰老状态下，L.plantarum KSFY01影响疲劳和与疲劳相关的器官功能障碍的分子机制，我们评估了肝脏和肌肉组织中氧化应激相关信号基因的表达。目前多项研究表明，Nrf2信号通路是机体极为重要的内源性防御体系。其中，核因子相关因子 2(nuclear factor--E2-relatedfactor2，Nrf2)是对抗细胞产生氧化应激反应中最为关键的因子，Nrf2 主要通过与抗氧化反应元件(antioxidant responseelement，ARE)相互作用，诱导编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达，从而在细胞中抵御有害刺激，发挥着对细胞重要的保护作用。Nrf2 信号通路调节编码的下游抗氧化酶主要包括：γ-GCS、SOD、CAT等。调控的下游Ⅱ相解毒酶主要有：HO-1、NQO1、GCL等。此外，氧化应激反应，生成大量R0S，造成过氧化损伤，而线粒体中R0S的增多，可导致进步的脂质氧化，生成更多的脂质过氧化物，且可诱导肿瘤坏死因子TNF-α产生，TNF-α不仅会损伤线粒体呼吸链功能，影响呼吸链上电子传递，还会使线粒体的渗透性转换孔道开放，耗竭线粒体中细胞色素C，继而触发肝细胞调亡、坏死。本研究中应用RT-PCR手段分析维生素C和L.plantarumKSFY01是否能够影响这些基因的表达。结果表明高强度运动引起肝脏和肌肉组织中Nrf2，NQO1，γ-GCS，HO-1，SOD1，SOD2，CAT 和IL-10m RNA的表达水平下降，而维生素C和L.plantarum KSFY01显著提高了它们的表达，L.plantarum KSFY01干预调节作用更显著。L.plantarum KSFY01干预调节效果具有剂量依赖性，高剂量L.plantarum KSFY01的干预效果优于低剂量L.plantarum KSFY01。这些发现表明Nrf2途径是L.plantarum KSFY01发挥抗氧化和抗疲劳作用的潜在分子机制。

4结论

本研究通过建立小鼠衰老模型，探究L.plantarum KSFY01的抗氧化作用和提高小鼠运机能力的效果。实验结果表明，L.plantarum KSFY01能通过改善代谢产物累积、糖原存储、肌肉和肝脏损伤以及氧化应激，从而提高衰老小鼠的抗疲劳能力和运动能力。为今后开发用于抗疲劳和改善老年人运动功能的食源性抗氧化剂提供了参考，对益生菌资源的开发利用具有重要意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KSFY01，其特征在于，其已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.15654，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年04月28日。

2.一种权利要求1所述植物乳杆菌KSFY01在制备提高机体运动能力产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过提高机体运动耐力、改善代谢物累积以及缓解机体损伤，达到缓解疲劳和提高机体运动能力的效果。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善代谢物累积具体为降低机体血清中CK、ALT和AST水平。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缓解机体损伤包括缓解肝脏、肾脏和肌肉损伤；所述机体包括衰老机体。

6.一种权利要求1所述植物乳杆菌KSFY01在制备抗氧化产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌KSFY01通过调控机体Nrf2信号途径的分子表达，提高机体的抗氧化能力。

8.一种权利要求1所述植物乳杆菌KSFY01在制备提高机体抗疲劳能力产品中的应用。

9.一种提高机体运动能力、抗疲劳能力和减缓机体衰老的产品，其特征在于，所述产品包含有效剂量的植物乳杆菌KSFY01。

10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述植物乳杆菌KSFY01包括植物乳杆菌KSFY01菌悬液，所述菌悬液在机体中的有效剂量为1.0×10⁹-1.0×10¹⁰CFU/kg。

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