CN115868590A - 一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用 - Google Patents
一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115868590A CN115868590A CN202111147206.3A CN202111147206A CN115868590A CN 115868590 A CN115868590 A CN 115868590A CN 202111147206 A CN202111147206 A CN 202111147206A CN 115868590 A CN115868590 A CN 115868590A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus
- fermentation
- ginkgo
- ginkgo leaf
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 title claims abstract description 55
- 235000011201 Ginkgo Nutrition 0.000 title claims abstract description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 28
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 16
- 241000218628 Ginkgo Species 0.000 title abstract 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 31
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 claims abstract description 8
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 claims abstract description 7
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 claims abstract description 7
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 claims abstract description 7
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 229940031154 kluyveromyces marxianus Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 244000194101 Ginkgo biloba Species 0.000 claims description 51
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- YXHVCZZLWZYHSA-FPLPWBNLSA-N Ginkgoic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC1=CC=CC(O)=C1C(O)=O YXHVCZZLWZYHSA-FPLPWBNLSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 238000007602 hot air drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 4
- 238000012371 Aseptic Filling Methods 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 3
- YXHVCZZLWZYHSA-UHFFFAOYSA-N (Z)-6-[8-pentadecenyl]salicylic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC1=CC=CC(O)=C1C(O)=O YXHVCZZLWZYHSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 claims 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 22
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 4
- 231100000460 acute oral toxicity Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 abstract description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 6
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000009429 Ginkgo biloba extract Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- SCULJPGYOQQXTK-OLRINKBESA-N Cinobufagin Chemical compound C=1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@@H]4[C@@]5(C)CC[C@H](O)C[C@H]5CC[C@H]4[C@@]43O[C@@H]4[C@@H]2OC(=O)C)C=CC(=O)OC=1 SCULJPGYOQQXTK-OLRINKBESA-N 0.000 description 2
- SCULJPGYOQQXTK-UHFFFAOYSA-N Cinobufagin Natural products CC(=O)OC1C2OC22C3CCC4CC(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1C=1C=CC(=O)OC=1 SCULJPGYOQQXTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 2
- 229940068052 ginkgo biloba extract Drugs 0.000 description 2
- 235000020686 ginkgo biloba extract Nutrition 0.000 description 2
- 229930184727 ginkgolide Natural products 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- KBKUJJFDSHBPPA-UHFFFAOYSA-N 5beta-hydroxylcinobufagin Natural products CC(=O)OC1C2OC22C3CCC4(O)CC(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1C=1C=CC(=O)OC=1 KBKUJJFDSHBPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241001264174 Cordyceps militaris Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000960949 Mus musculus Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 101001076414 Mus musculus Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 241001248610 Ophiocordyceps sinensis Species 0.000 description 1
- 229940123251 Platelet activating factor antagonist Drugs 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- KBKUJJFDSHBPPA-ZNCGZLKOSA-N cinobufotalin Chemical compound C=1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@@H]4[C@@]5(C)CC[C@H](O)C[C@@]5(O)CC[C@H]4[C@@]43O[C@@H]4[C@@H]2OC(=O)C)C=CC(=O)OC=1 KBKUJJFDSHBPPA-ZNCGZLKOSA-N 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000020510 functional beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000003848 thrombocyte activating factor antagonist Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用，所述银杏叶组合物的比例如下：银杏叶占70%、米糠占10%、海带占10%和麦麸占10%，组合物接种长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和马克思克鲁维酵母，经长期固态发酵和液态发酵，再经高温瞬时杀菌和陶瓷膜过滤，得到一种益生菌发酵银杏叶组合物。该益生菌发酵银杏叶组合物通过经口急毒实验验证无任何毒副作用，可抑制鼠源H22细胞移植瘤，具有抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及饮料制备领域，具体涉及一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用，属于功能饮料制备和应用领域。
背景技术
我国银杏资源占世界的 70 %以上，是银杏叶的主产地。银杏叶提取物被广泛应用于保健食品、化妆品和药品等领域。银杏叶分离出最具代表性的功效组分银杏黄酮类与银杏内酯类，银杏黄酮类是一种天然自由基清除剂和血管扩张剂，银杏内酯类是目前天然药物中最强血小板活化因子拮抗剂。同时，银杏提取物还具有抗肿瘤生理活性，抗肿瘤靶点和通路较丰富，且通过各组分协同起到抗肿瘤作用，包括抗氧化性、抑制增殖、诱导分化凋亡、干预信号转导和抑制心血管生长等途径。由于银杏叶中银杏酸具有一定的毒性，即使炮制后银杏酸的含量仍较高，微生物发酵可能是有效解决的方法，因为微生物发酵不仅对银杏酸进行分解与转化，达到增效减毒的目的，还能增加黄酮和内酯等活性成分的含量。
目前，国内使用银杏叶作为抗肿瘤材料的专利较多，如 CN201810492749.0 一种防癌中药药剂及其制备方法和应用、CN201910267160.5 一种治疗肿瘤的中药组合物、CN201810522595.5 一种蛹虫草银杏叶保健饮料及其制备方法、CN201610183374.0 一种治疗肿瘤的中药及其制备方法、CN201611057537.7 一种银杏叶虫草饮料及其制备方法等，上述专利均采用直接添加的方式，制备方法简单，未精细化提取出人体可吸收的有效成分，所以效果和安全性不一定具有保障。
发明内容
银杏叶中含有黄酮、类酯等活性成分，在心血管疾病、炎症、免疫力低下等疾病上有广泛使用，研究发现银杏叶提取物还具有抗肿瘤活性，通过益生菌发酵法提取的活性成分，不仅降低毒性成分银杏酸含量，还提升其抗肿瘤活性。
本发明提供了一种益生菌发酵银杏叶组合物的制备方法，使用模拟人体消化的方式，对银杏叶组合物先进行6-12个月的固态发酵，再进行3-5个月的液态发酵，利用益生菌去除银杏酸，分解银杏叶，最大化提取活性成分。
本发明所述益生菌为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和马克思克鲁维酵的混合物。
本发明所述银杏叶组合物配比如下：银杏叶占比70-90%，麦麸、海带和米糠的等比混合物占比10%-30%。
本发明公开的益生菌发酵银杏叶组合物的制备方法如下：
（1）银杏叶组合物处理
A．银杏叶经清洗后沥干水，45-50℃热风干燥，去掉80-85%的水分，再经120-150℃炒制至微黄。经粉碎机粉碎，过80-100目。
B．麦麸、海带和米糠清洗后沥干水， 45-50℃热风干燥，去掉80-85%的水分。经粉碎机粉碎，过80-100目，再臭氧熏蒸12-24h，保证菌落总数低于1×10^4 cfu/g。
（2）银杏叶组合物固态发酵
A．按银杏叶占比70-90%，麦麸、海带和米糠的等比混合物占比10%-30%的比例，充分混合（1）中处理后的物料。
B．取长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和马克思克鲁维酵母8种菌的菌粉或菌液，每种菌粉按照1g/kg或每种菌液按照10ml/kg的比例加入（2）A混合物料中，再加入物料等质量的水，混合均匀后，转移到无菌不锈钢罐中，在30-37℃恒温房间内，密封发酵6-12个月。
C. 固态发酵从第6个月开始，每隔1个月从取样口取样5g，在洁净工作台加入95ml无菌水，混合均匀。取样品液检测pH，待pH值达到5以下时，结束固态发酵。
（3）银杏叶组合物液态发酵
A.发酵结束后的（2）A转移到发酵罐内，按照每公斤物料添加50-100倍无菌水，30-40℃、50-100r/min搅拌24h-48h，有效提取出固体发酵后小分子活性成分及益生菌，沉淀24-48h后从底部排出沉淀，保留上清部分。
B. 对（3）A所得物进行间歇通气发酵。先持续5天向罐内通入无菌空气，再沉淀2天，从底部排出沉淀残渣，保留上清。
C. 连续重复进行（3）B操作，直至发酵液透明度≥15cm，则结束（3）B的操作。
D. 完成（3）C操作，经超高温瞬时杀菌设备，130℃-150℃处理2-8s，迅速冷却至常温，再经0.45-1μm孔径的陶瓷膜过滤系统去除悬浊物，经无菌灌装，得到一款澄清饮料。
所述（1）A中银杏叶采摘自银杏树主干。
所述（1）A中银杏叶，较优的处理工艺如下：48℃热风干燥60min，去掉80-85%的水分，再经140℃炒制5min至微黄，收集、保藏在干燥阴凉处。
所述（2）A中银杏叶、麦麸、海带和米糠的优选比例为7:1:1:1。
所述（2）B的长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和马克思克鲁维酵母8种菌菌液，优选制备方法如下：乳酸菌使用MRS培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种；酵母菌使用YPD培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种。
所述（2）B固态发酵，优选发酵温度为36℃，优选发酵时间为9个月。
所述（2）C固态发酵终点，优选pH为4.5时。
所述（3）A，初步液体萃取中优选每公斤物料添加100倍无菌水，优选保温37℃，优选搅拌50r/min，优选萃取时间为48h。
所述（3）A中，初步液体萃取中优选的沉淀时间为24h。
所述（3）C中，优选重复（3）B次数为5次，优选的发酵液透明度为20cm。
所述（3）D中，优选的超高温瞬时杀菌条件如下：140℃处理4s，迅速冷却到30℃以下。
所述（3）D中，优选陶瓷膜过滤系统孔径为1μm。
本发明的益生菌发酵银杏叶组合物在癌症细胞模型中具有显著抑制癌症的效果。
本发明具有以下优点：
1、该益生菌发酵银杏叶组合物食用安全，无任何毒副作用。
2、该益生菌发酵银杏叶组合物饮料具有口感清淡、能量低的优点。
3、该益生菌发酵银杏叶组合物具有抑制癌症细胞的能力，具有一定抗癌效果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1：一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备
（1）银杏叶组合物处理
A. 银杏叶采收后，去除不完整叶，清洗后沥干水， 45℃热风干燥，去掉85%的水分。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
B. 米糠过筛去除杂物，清洗后沥干水， 50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
C. 海带经清洗后沥干水， 50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
D．麦麸过筛去除杂物，清洗后沥干水， 50℃热风干燥。经粉碎机粉碎，过100目，再臭氧熏蒸24h，保证菌落总数低于10000cfu/g。
（2）菌种液活化
长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌使用MRS培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种；马克思克鲁维酵母菌使用YPD培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种。所得菌种等比混合，作为发酵菌种液。
（3）银杏叶组合物固态发酵
A. 步骤（1）所得银杏叶粉、米糠粉、海带粉和麦麸粉，以7:1:1:1的比例进行混合，取样和混合过程在D级洁净区内进行。
B.将菌种液按照1g/kg的比例加入（3）A所得的混合物料粉中，混合均匀，再加入等质量的水，混合均匀后，转移物料到无菌不锈钢罐中，在30℃恒温房间内，进行固态发酵。
C. 固态发酵6个月内，每隔1个月从取样口取样5g，在洁净工作台加入95ml无菌水，混合均匀。取样品液检测pH，待pH值降到4.5，结束固态发酵。
（4）银杏叶组合物液态发酵
A. 经（3）C固态发酵结束的物料，转移到无菌液体发酵罐内进行初步液体萃取。每公斤物料添加100倍无菌水， 37℃、80r/min搅拌48h进行，有效提取出固体发酵后小分子活性成分及益生菌，沉淀24后从底部排出，保留上清部分。
B. 对（4）A所得上清通气发酵。先向罐内通入400 L/min无菌空气，持续5天，促进益生菌进一步消耗液体内大分子营养物，再沉淀2天，后从底部排出沉淀残渣，保留上清。
C. 连续重复进行（4）B操作，直至发酵液透明度达到20cm，则结束（4）B的操作。
D. 完成（4）C操作，产品经超高温瞬时杀菌，130℃处理4s，迅速冷却至常温，再经1μm孔径的陶瓷膜过滤系统去除悬浊物，经无菌灌装，单瓶包装规格为50ml。
实验例1：本发明益生菌发酵银杏叶组合物的经口急毒试验
1.1 样品
益生菌发酵银杏叶组合物，液体，500 mL，批号20201108，由实施例1制备。
1.2 实验动物
健康成年SPF级ICR小鼠20只，雌雄各半，由南京医科大学医药实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（苏）2016-0002，合格证编号：NYD-L-2021040803。实验动物在温度为20～26℃、相对湿度为40%～70%的本中心屏障系统中饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2020-0006。实验鼠维持饲料（Co60辐照）由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证（2019）01008。
1.3急毒试验情况
采用限量法，设定剂量为10000 mg/kg•bw，每组10只动物，雌雄各半。动物检疫3d，试验时雌性体重为18.8～20.9g，雄性体重为19.6～21.8g，试验前动物禁食4h，自由饮水。样品比重1.06，以原液按10 mL/kg•bw，1次灌胃给样，实际剂量为10600 mg/kg•bw。全部动物连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。
灌胃给予ICR小鼠10600 mg/kg•bw的菌菇饮料。雌、雄性动物14d试验观察期间，饮食和活动正常，生长良好，未见中毒表现及异常体征，无动物死亡（见表1）。所以，菌菇饮料的雌、雄性小鼠急性经口毒性试验LD50均为大于10600 mg/kg•bw，属实际无毒。
表1 益生菌发酵银杏叶组合物的小鼠急性经口毒性试验结果
实验例2：本发明益生菌发酵银杏叶组合物的对鼠源H22细胞移植瘤的抑制效果
1.1 受试品
样品：益生菌发酵银杏叶组合物（MFG），液体500 mL，批号为20201108，由实施例1制备。
阳性对照药：华蟾素，陕西东泰制药有限公司，批号为 8D0100170。
1.2 细胞株
鼠源 H22 肝癌细胞株，购自上海博谷生物科技有限公司
1.3 试剂盒
Mouse Interleukin 18,IL-18 ELISA Kit，96T，购自武汉华美。
Mouse Interleukin 6,IL-6 ELISA KIT，96T，购自武汉华美。
Mouse Tumor necrosis factor-α,TNF-α ELISA KIT，96T，购自武汉华美。
1.4 实验动物
清洁级级 ICR 小鼠，雄性，6〜8 周龄，24±2g，100 只，动物设施许可证编号：SCXK-（苏）2020-0007。实验动物饲养于苏中生物制药有限公司动物实验室，小鼠置于屏障系统。随机分组，每笼5只。饲以专为小鼠配制的全价颗粒饲料；自由进食饮水。实验室内饲养温度保持在温度 22±4℃，相对湿度保持在45±5%，12h光照昼夜交替，动物实验符合扬州大学动物伦理委员会要求。
1.5 小鼠分组和建模
清洁级 ICR 小鼠按体重随机分组，每组10只。对照组（N）不造模，灌胃纯净水；造瘤小鼠适应性饲养3天，按1×10^7 接种 H22 细胞，取体外扩增后生长良好的H22肝癌细胞接种于ICR小鼠腹腔内，建立H22肝癌腹水瘤模型。建模成功后，鼠源 H22 细胞移植瘤小鼠随机分为模型组（M），实验组A，实验组B和阳性组，每组10只。N组和M组均灌胃258mg/kg生理盐水；实验组A给予30mg/kg MFG和228mg/kg生理盐水，编码A-MFG；实验组B给予30mg/kgMFG和228mg/kg华蟾素，编码B-MFG；阳性组给予30mg/kg 生理盐水和228mg/kg华蟾素，编码HCS。待M组小鼠肿瘤体积大于1000mm3 后，每周记录小鼠体重、进食量，干预六周后取血、处死小鼠，检测瘤组织指标。
1.6 各组小鼠在干预后的体重变化
在第六周，现对于N组，M组体重有显著上升（p<0.05），B-MFG组有显著下降（p<0.05），A-MFG组合HCS组则没有显著区别。在第六周，现对于M组，B-MFG组体重有显著下降。
表2 各组小鼠在干预后的体重变化
注：与对照组比较：#p<0.05；与模型组比较:*p<0.05
1.7 各组小鼠在干预后的摄食量变化
实验期间平均每只小鼠的饲料摄入无明显差异，MFG 对移植瘤小鼠摄食量无不良影响。M组后期摄食量呈下降趋势与瘤组织压迫食道影响进食有关。
表3 各组小鼠在干预后的摄食量变化(g/天)
1.8 MFG对移植瘤的抑制率
与M组比较， A-MFG组单独用MFG干预小鼠，肿瘤抑制率为22.3%；阳性对照HCS组的肿瘤抑制率为30.7%；联合使用MFG和HCS，B-MFG组的肿瘤抑制率为46.8%。所以，MFG单独具有一定抑制肿瘤效果，并能辅助HCS抑制肿瘤效果。
表4 MFG对移植瘤的抑制率
注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01。
Claims (10)
1.一种益生菌发酵银杏叶组合物的制备方法，使用模拟人体消化的方式，对银杏叶组合物先进行6-12个月的固态发酵，再进行3-5个月的液态发酵，利用益生菌去除银杏酸等过敏成分，深度分解银杏叶，获得的活性成分具有抗肿瘤效果。
2.权利要求1所述益生菌发酵银杏叶组合物的制备方法如下：
（1）银杏叶组合物处理
A．银杏叶经清洗后沥干水，45-50℃热风干燥，去掉80-85%的水分，再经120-150℃炒制至微黄；
B．麦麸、海带和米糠清洗后沥干水， 45-50℃热风干燥，去掉80-85%的水分。经粉碎机粉碎，过80-100目，再臭氧熏蒸12-24h，保证菌落总数低于1×10^4 cfu/g；
（2）银杏叶组合物固态发酵
A．按银杏叶占比70-90%，麦麸、海带和米糠的等比混合物占比10%-30%的比例，充分混合（1）中处理后的物料；
B．取长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和马克思克鲁维酵母8种菌的菌粉或菌液，每种菌粉按照1g/kg或每种菌液按照10ml/kg的比例加入（2）A混合物料中，再加入物料等质量的水，混合均匀后，转移到无菌不锈钢罐中，在30-37℃恒温房间内，密封发酵6-12个月；
C. 固态发酵从第6个月开始，每隔1个月从取样口取样5g，在洁净工作台加入95ml无菌水，混合均匀。取样品液检测pH，待pH值达到5以下时，结束固态发酵；
（3）银杏叶组合物液态发酵
A.发酵结束后的（2）A转移到发酵罐内，按照每公斤物料添加50-100倍无菌水，30-40℃、50-100r/min搅拌24h-48h，有效提取出固体发酵后小分子活性成分及益生菌，沉淀24-48h后从底部排出沉淀，保留上清部分；
B. 对（3）A所得物进行间歇通气发酵。先持续5天向罐内通入无菌空气，再沉淀2天，从底部排出沉淀残渣，保留上清；
C. 连续重复进行（3）B操作，直至发酵液透明度≥15cm，则结束（3）B的操作；
D. 完成（3）C操作，经超高温瞬时杀菌设备，130℃-150℃处理2-8s，迅速冷却至常温，再经0.45-1μm孔径的陶瓷膜过滤系统去除悬浊物，经无菌灌装，得到一款澄清饮料。
3.权利要求2所述（1）A中银杏叶采摘自银杏树主干，较优的处理工艺如下：48℃热风干燥60min，去掉80-85%的水分，再经140℃炒制5min至微黄，收集、保藏在干燥阴凉处。
4.权利要求2所述（2）A中银杏叶、麦麸、海带和米糠的优选比例为7:1:1:1。
5.权利要求2所述（2）B的长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和马克思克鲁维酵母8种菌液，优选制备方法如下：乳酸菌使用MRS培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种；酵母菌使用YPD培养基，接种1%甘油菌种，37℃静置培养24h，经5000r/min离心20min收集菌体，用等体积无菌水重悬浮菌种。
6.权利要求2所述（2）B固态发酵，优选发酵温度为36℃，优选发酵时间为9个月，（2）C固态发酵终点，优选pH为4.5时。
7.权利要求2所述（3）A，初步液体萃取中优选每公斤物料添加100倍无菌水，优选保温37℃，优选搅拌50r/min，优选萃取时间为48h，优选的沉淀时间为24h。
8.权利要求2所述（3）B次数优选为5次，优选的发酵液透明度为20cm。
9.权利要求2所述（3）D中，优选的超高温瞬时杀菌条件如下：140℃处理4s，迅速冷却到30℃以下。
10.权利要求2所述（3）D中，优选陶瓷膜过滤系统孔径为1μm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111147206.3A CN115868590A (zh) | 2021-09-29 | 2021-09-29 | 一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111147206.3A CN115868590A (zh) | 2021-09-29 | 2021-09-29 | 一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115868590A true CN115868590A (zh) | 2023-03-31 |
Family
ID=85755901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111147206.3A Pending CN115868590A (zh) | 2021-09-29 | 2021-09-29 | 一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115868590A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103263448A (zh) * | 2013-03-01 | 2013-08-28 | 南京林业大学 | 用于发酵预处理改进银杏叶黄酮提取的发酵菌种及应用 |
| CN106866285A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-06-20 | 山东博华高效生态农业科技有限公司 | 一种含有银杏叶的生物肥料的制作方法 |
| CN107373250A (zh) * | 2017-08-01 | 2017-11-24 | 佛山科学技术学院 | 一种银杏叶乳酸菌保健饮料及其制备方法 |
| CN107484549A (zh) * | 2017-08-24 | 2017-12-19 | 南京林业大学 | 一种冠突散囊菌固态发酵银杏叶的方法及其应用 |
| CN109770138A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-21 | 江苏恒康生物科技有限公司 | 一种药食同源植物发酵饮料及其制备方法 |
| CN110192588A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-03 | 四川顺翔银杏生物科技开发有限公司 | 一种银杏叶颗粒茶及其制备方法 |
-
2021
- 2021-09-29 CN CN202111147206.3A patent/CN115868590A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103263448A (zh) * | 2013-03-01 | 2013-08-28 | 南京林业大学 | 用于发酵预处理改进银杏叶黄酮提取的发酵菌种及应用 |
| CN106866285A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-06-20 | 山东博华高效生态农业科技有限公司 | 一种含有银杏叶的生物肥料的制作方法 |
| CN107373250A (zh) * | 2017-08-01 | 2017-11-24 | 佛山科学技术学院 | 一种银杏叶乳酸菌保健饮料及其制备方法 |
| CN107484549A (zh) * | 2017-08-24 | 2017-12-19 | 南京林业大学 | 一种冠突散囊菌固态发酵银杏叶的方法及其应用 |
| CN109770138A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-21 | 江苏恒康生物科技有限公司 | 一种药食同源植物发酵饮料及其制备方法 |
| CN110192588A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-09-03 | 四川顺翔银杏生物科技开发有限公司 | 一种银杏叶颗粒茶及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 卢红梅, 张义明: "银杏叶发酵饮料的研制", 食品工业科技, no. 08, pages 110 - 112 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112195139B (zh) | 植物乳杆菌菌株ldvs007及其应用 | |
| CN109125525B (zh) | 防治心血管疾病的组合物及其制备方法和应用 | |
| CN113604395B (zh) | 一株可发酵石斛且其发酵液可改善皮肤质量的植物乳杆菌 | |
| CN114574406B (zh) | 鼠李糖乳杆菌菌株wka55及其在制备防治酒精性肝损伤制品方面的用途与产品 | |
| CN115838676B (zh) | 利用新型植物乳植杆菌菌株中药发酵及应用 | |
| US20130309212A1 (en) | Lactobacillus salivarius and method for preparing metabolite thereof, composition of lactobacillus salivarius and metabolite thereof and use of the composition | |
| CN107854495B (zh) | 凝结芽孢杆菌在制备降低血尿酸制剂中的应用 | |
| CN114032190A (zh) | 一株可发酵石斛且其发酵液可有效修复日光皮炎的罗伊氏乳杆菌 | |
| CN105617367B (zh) | 促进畜禽呼吸道健康酵素及其制备方法 | |
| CN115887535B (zh) | 一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液及其制备方法 | |
| CN114982951B (zh) | 一种天然银杏酵素的制备方法 | |
| CN106728038A (zh) | 一种防治水产动物肝胆疾病的中药饲料预混剂及其制备方法 | |
| CN115868590A (zh) | 一种抗肿瘤的益生菌发酵银杏叶组合物的制备和应用 | |
| CN116445327A (zh) | 一种降血脂多元益生菌及其应用 | |
| KR20190072923A (ko) | 식용꽃 추출물의 유산균 발효액을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역활성 증진 기능성 음료 및 식품 조성물 및 그 제조방법 | |
| CN113797272A (zh) | 防治对虾副溶血弧菌病中草药复方制剂及其制备方法 | |
| KR20180057278A (ko) | 락토바실러스 사케이 2-6-4 균주 및 이의 용도 | |
| CN115363155A (zh) | 一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备 | |
| KR101771075B1 (ko) | 우엉-시금치 복합발효추출물을 포함하는 면역기능 증강용 조성물 | |
| CN115336684A (zh) | 一种提高免疫力的益生菌发酵黄金菇组合物及其制备方法 | |
| CN118389372B (zh) | 一种具有减肥和改善腹泻功能的植物乳植杆菌 | |
| CN116555126B (zh) | 具有肠炎治疗作用的含益生菌的组合物及其应用 | |
| CN115005442B (zh) | 一种天山雪莲多糖提取物制备方法与应用 | |
| CN115997833B (zh) | 一种适用平原移居高原环境的女性冻干功能茶饮及其制备方法 | |
| KR102202092B1 (ko) | 오르니틴 생성능을 갖는 바이셀라 코리엔시스 nd824 균주 및 이를 함유하는 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |