CN115851784A - 一种利用Lbcpf1变体构建的植物胞嘧啶碱基编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用Lbcpf1变体构建的植物胞嘧啶碱基编辑系统及其应用。所述的胞嘧啶碱基编辑系统包括基于利用Lbcpf1变体——dLbcpf1的高精度和高编辑活性的胞嘧啶碱基编辑工具表达盒，以及向导RNA的表达盒。利用本发明的基因编辑系统，可以识别PAM序列为TTTV的靶点序列，在预定的植物基因组位点的编辑窗口内产生单个G或C替换成A或T的替换，显著提升了编辑的精确性,为植物基因组中实施更为准确的碱基编辑提供了新的方法和思路。

Description

一种利用Lbcpf1变体构建的植物胞嘧啶碱基编辑系统及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明利用Lbcpf1变体dLbcpf1并且利用多氨基酸替换变体A3Bctd设计得到了能保持高编辑效率且无随机脱靶效应的CBE变体。

背景技术

基因组编辑技术，特别是基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术可以通过同源重组(HR)介导的DNA修复途径来实现在基因组位点中引入特定碱基的替换。目前碱基编辑系统目前包括胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine Base Editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine Base Editor,ABE)，已被广泛应用于生命科学的各个领域。但是，目前胞嘧啶碱基编辑器CBE在全基因组水平存在不可预测的脱靶效应，这严重影响了该系统的特异性与安全性。因此，开发精准、高特异性的新型胞嘧啶碱基编辑工具对精准基因治疗和植物分子设计育种具有重要意义。

CRISPR/Cas9技术虽然有着无比强大的功能，但也有其缺点，比如PAM的限制导致靶点选择的有限性。Cpf1蛋白是细菌免疫系统中的Ⅱ型，Cpf1系统有两个部分组成，蛋白与向导RNA。但是其RNA不需要像Cas蛋白pre-crRNA与TrancrRNA在RNaseⅢ酶作用下产生成熟crRNA，因此向导RNA只有crRNA。Cpf1的蛋白有LbCpf1，FnCpf1，AsCpf1。因Cpf1没有HNH域，只有RuvC一个结构域，通过对Cpf1的RuvC结构域进行改造获得dCpf1，改造后的蛋白无核酸内切酶活性，可应用于碱基编辑工具的开发，且Cpf1系统更多靶向富含AT的区域。目前虽然在CRISPR/Cas9基础上建立了高效的植物胞嘧啶碱基编辑系统，但目前在CRISPR/Cpf1基础上建立的植物胞嘧啶碱基编辑系统的效率很低，尚未有相关的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够在富含AT区域进行精准高效编辑的水稻胞嘧啶碱基编辑工具。

本发明首先提供了一种Lbcpf1变体——dLbcpf1蛋白，其靶向富含AT的区域，且DNA切割活性缺失，其编码序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其序列具体为：

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本发明还提供了一种胞嘧啶碱基编辑器CBE的变体。

本发明还提供了一个单链DNA结合蛋白ssDBD，其编码序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其具体序列为：

本发明还提供了一种编辑效率高，编辑窗口较小的A3Btcd胞嘧啶脱氨酶，由序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列构成，其具体序列为：

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本发明还提供了一种融合蛋白dLbcpf1-A3Btcd及其表达盒，所述dLbcpf1-A3Bctd融合蛋白表达盒具有式II结构：P2-C-D-E-F-G-H-I-J-K(II)；

其中，

(a)P2为第2启动子；

(b)C为无或核定位信号序列NLS；

(c)D为A3Bctd基因序列；

(d)E为为任意的连接肽或连接序列；

(e)F为ssDBD基因序列；

(f)G为为任意的连接肽或连接序列；

(g)H为dLbcpf1基因序列；

(h)I为无或核定位信号序列NLS；

(i)J为3个拷贝的尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂基因序列；

(i)K为终止子。

其中，B和I至多一个为无。

优选的，所述P2启动子包括但不限于Ubi、Actin、35S启动子。

另一方面，本发明还提供一种向导RNA表达盒，其具有式I结构：P1-A-B-T(I)；其中，

(a)P1为第1启动子；

(b)A为对应于成熟型直接重复序列(direct repeat,DR)

(c)B为目标位点引导序列sg；

(d)T为终止序列。

优选的，P1启动子包括35S-CmYLCV-U6复合启动子、TaU3p、OsU3p、TaU6p或OsU6p启动子。

本发明还提供一种植物胞嘧啶碱基编辑系统，所述的dLbcpf1-A3Bctd融合蛋白表达盒和向导RNA表达盒位于同一表达载体上。

本发明还提供一种所述的精准胞嘧啶碱基编辑系统应用，所述应用包括：利用所述的精准胞嘧啶碱基编辑载体，实现对水稻基因组的碱基编辑，从而获得含有碱基突变的转基因植物或植物部分。

另一方面，本发明还提供一种将所述的基因组编辑载体基因导入水稻细胞的方法。

本发明还提供一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的表达盒或如上所述的编辑载体。

本发明所提供的一种基于dLbcpf1-A3Bctd系统的胞嘧啶碱基编辑载体及其应用，可以应用于对水稻的基因组进行编辑，以水稻基因组上片段为靶标，能够在PAM序列下游的第10～14位的碱基进行突变，实现C：T或G：A的碱基精准替换。

附图说明

图1为pHUC-dLbcpf1-A3Bctd载体质粒示意图。

图2为dLbcpf1-A3Bctd基因编辑系统产生的碱基编辑效果。

图3为突变后植株与未发生编辑的植株的生长情况对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1——pHUC-dLbcpf1-A3Bctd表达载体的构建

总体而言，本实施例中，通过同源重组技术获得dLbcpf1-A3Bctd胞嘧啶碱基编辑工具的融合蛋白，所述dLbcpf1蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1所示，所述的单链DNA结合蛋白ssDBD的编码序列如SEQ ID NO:2所示，所述的A3Btcd胞嘧啶脱氨酶的编码序列如SEQ IDNO:3所示。

具体而言，发明人在进行A3Bctd胞嘧啶碱基编辑系统实验研究时，通过尝试各种突变方式，对各种不同的突变方式进行了大量实验，在实验过程中，意外获得了一个Lbcpf1突变体样本，发现该突变体样本在水稻中的表现具有可重复性以及高编辑效率。经测序发现，该Lbcpf1蛋白的第832位氨基酸由Asp(D)突变成Ala(A)，相应的dLbcpf1变体在切割序列时形成单链缺口。此外，在所获得的突变蛋白的基础上，发明人发现使其第156位氨基酸由Asp(D)突变成Arg(R)，可以提高dLbcpf1蛋白在水稻体内的编辑活性。使用人工合成dLbcpf1、ssDBD、A3Bctd的融合蛋白序列，并且为了进一步提高单碱基编辑系统的效率，在dLbcpf1的3’端融合了3个UNG抑制蛋白(UGI)，分别在A3Bctd的5’及UGI的3’加上一个核定位信号NLS。融合蛋白基因命名为dLbcpf1-A3Bctd，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。合成的dLbcpf1-A3Bctd基因带上PstI/SacI酶切位点并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

crRNA表达盒从5'～3'具有以下4个元件：35S-CmYLCV-U6复合启动子、LbCpf1对应的成熟型直接重复序列(direct repeat，DR)、两个BsaI酶切位点用于对sg序列进行无缝克隆、转录终止子序列，具体序列见SEQ ID NO:4。方框表示LbCpf1对应的成熟型DR序列；划线部分碱基为两个BsaI酶切位点相关的序列，构建碱基编辑载体时该序列会被sg序列代替；黑色底纹为转录终止子序列TTTTTTT；其余为35S-CmYLCV-U6复合启动子的序列。SEQ IDNO:4序列为：

AAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGA

crRNA表达盒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，连接于PUC57-AMP载体上，两端带上HindIII酶切位点，形成PUC57-AMP-crRNA载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用PstI/SacI酶切，回收dLbcpf1-A3Bctd片段。用PstI/SacI酶切植物表达载体pHUC600载体并回收，利用T4连接酶将dLbcpf1-A3Bctd连接到pHUC600载体上。获得pHUC600-dLbcpf1-A3Bctd。将pHUC600-dLbcpf1-A3Bctd用HindIII单切，回收大片段。将PUC57-AMP-crRNA载体用HindIII单切，回收crRNA片段。利用T4连接酶将crRNA片段连接到pHUC600-dLbcpf1-A3Bctd载体上，得到植物表达载体pHUC-dLbcpf1-A3Bctd，其载体图见图1。

实施例2——利用dLbcpf1-A3Bctd系统对水稻内源基因进行单碱基替换

选择水稻IPA1基因(Os08g0509600)中的核苷酸序列ATAATGAGCGCCGGAGGAGGCCGCAAA(下划线部分为所述5’-CAAA-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUC-dLbcpf1-A3Bctd融合形成pHUC611-dLbcpf1-A3Bctd-IPA1。利用冻融法将这个植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴(Oryzasativa ssp japonica cv.Nipponbare)的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

对于上面构建的载体分别得到转基因植株48株。采取水稻叶片样品，用CTAB法提取DNA。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增靶标附近序列的PCR引物为5’-CTTTCTGAGTCAACAGCCAA-3’及5’-CCATGAGGAGCTACGTTCCTG-3’，产生长度为528bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对。结果显示，在pHUC611-dLbcpf1-A3Bctd-IPA1这个碱基载体获得的植株中，18棵植株出现了G突变成A，突变效率37.5％(表1)，在检测IPA1的靶标突变植株中，均在PAM远端的第14位的G突变成A(图2)，没有发现其他类型的突变。且与未发生编辑的植株相比，突变后的植株的株型变的紧凑，这种紧凑型的植株非常有利于进行植株密植并且具有更强的抗倒伏性能，参见图3，因此IPA1基因发生编辑后改良了IPA蛋白的功能，提供了更好的植株生长性能和抗倒伏性能。由此可见，本发明的pHUC-dLbcpf1-A3Bctd单碱基编辑系统能获得较高的单碱基突变率，而且是在TTTV的PAM位置附近进行靶向突变，获得突变均为G到A的替换，即获得“干净”突变植株效率很高，为水稻育种领域提供了非常优秀的育种材料。

表1 pHUC-dLbcpf1-A3Bctd获得的定点突变植株突变类型

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Claims (9)

1.一种利用Lbcpf1变体构建的植物胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，所述胞嘧啶碱基编辑系统包括第一表达盒，

其中，所述第一表达盒为向导RNA表达盒，具有式I结构：P1-A-B-T(I)；其中，

(a)P1为第1启动子；

(b)A为对应于成熟型直接重复序列(direct repeat,DR)

(c)B为目标位点引导序列sg；

(d)T为终止序列，和/或第二表达盒，所述第二表达盒包含所述Lbcpf1变体。

2.根据权利要求1所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，所述第二表达盒为dLbcpf1-A3Bctd融合蛋白表达盒，所述dLbcpf1-A3Bctd融合蛋白具有式II结构：P2-C-D-E-F-G-H-I-J-K(II)；其中，

(a)P2为第2启动子；

(b)C为无或核定位信号序列NLS；

(c)D为A3Bctd基因序列；

(d)E为任意的连接肽或连接序列；

(e)F为ssDBD基因序列；

(f)G为任意的连接肽或连接序列；

(g)H为所述Lbcpf1变体dLbcpf1的基因序列；

(h)I为无或核定位信号序列NLS；

(i)J为3个拷贝的尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂基因序列；

(j)K为终止子。

其中，B和I至多一个为无。

3.根据权利要求1所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，P1启动子包括35S-CmYL-U6复合启动子、TaU3p、OsU3p、TaU6p或OsU6p启动子。

4.根据权利要求2所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统，所述Lbcpf1变体dLbcpf1的DNA切割活性缺失，由序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列构成。

5.根据权利要求2所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，包含一个单链DNA结合蛋白ssDBD，所述单链DNA结合蛋白ssDBD由序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列构成。

6.根据权利要求2所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，包含一个胞嘧啶脱氨酶A3Bctd基因，由序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列构成。

7.根据权利要求2所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。

8.一种权利要求1-7中任意一项所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统的应用，其特征在于，所述应用包括：利用所述植物胞嘧啶碱基编辑系统，实现对水稻基因组的碱基编辑，从而获得含有碱基突变的转基因植物或植物部分。

9.一种将权利要求1中所述的植物胞嘧啶碱基编辑系统导入水稻细胞的方法。

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