CN115851744A

CN115851744A - Dmd基因突变体及其应用、检测dmd基因突变体的引物组合、试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN115851744A
Application number: CN202211149319.1A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 刘亚宁; 伍亮; 邓亚兰
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及DMD基因突变体及其应用、检测DMD基因突变体的引物组合、试剂和试剂盒。本发明首次发现DMD基因存在c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC时，与进行性肌营养不良相关，通过检测DMD基因是否存在c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC，能够检测进行性肌营养不良。本发明提供的DMD基因突变体可以将进行性肌营养不良患者和正常人群区分开，是一种诊断进行性肌营养不良的生物标志物，有助于进行性肌营养不良基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

Description

DMD基因突变体及其应用、检测DMD基因突变体的引物组合、试剂和试剂盒

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及DMD基因突变体及其应用、检测DMD基因突变体的引物组合、试剂和试剂盒。

背景技术

进行性肌营养不良(Progressive muscular dystrophy)是一组以骨骼肌进行性无力萎缩为主要临床表现的异质性基因缺陷性疾病。可伴有中枢神经系统、心脏、骨骼、呼吸及胃肠道受累。不同类型起病时间、进展速度、受累范围、严重程度差异很大。遗传方式分为X连锁隐性遗传、常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传等。其中以Duchenne/Becker型肌营养不良(DMD/BMD)为代表。杜氏进行性肌营养不良(DMD，MIM 310200)和贝氏肌营养不良(BMD，MIM 300376)的病因是维持肌肉细胞在伸缩过程中保持肌膜完整性的重要结构蛋白Dystrophin的编码基因(DMD基因，MIM 300377)发生致病缺陷，从而导致功能异常，最终造成肌肉进行性破坏。Duchenne/Becker型肌营养不良遗传方式为X连锁隐性遗传，发病率在各个国家、地区和人种间无明显差异，每3600～6000出生男婴中有1例发病。我国的发病率约为1/3853。

DMD基因(MIM 300377)定位于染色体Xp21.2-p21.1，基因全长2220.2kb，包含79个外显子和78个内含子，编码3681个氨基酸组成的Dystrophin蛋白。Dystrophin蛋白是维持肌肉细胞膜稳定的重要成分，其功能是维持肌肉细胞的稳定性，使肌肉细胞在收缩的过程中，不会受到破坏。DMD患者因肌肉中缺少了Dystrophin蛋白，使肌肉在运动中，不断受到破坏，患者通常在12岁前失去行走能力，并在20-30岁左右死于心肺衰竭。BMD患者可以制造Dystrophin蛋白，但功能不正常且无法百分之百有效工作，所以症状较轻。在DMD基因上可发生删除、重复、插入以及各种点突变，如果发生移码突变或者无义突变，就发展为DMD，如果没有移码突变，则可发展为症状较轻的BMD。

基因突变是导致进行性肌营养不良发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊进行性肌营养不良的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，发现与进行性肌营养不良相关的基因突变位点，助力进行性肌营养不良基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供DMD基因突变体及其应用、检测DMD基因突变体的引物组合、试剂和试剂盒，丰富进行性肌营养不良的致病突变谱，精准判断进行性肌营养不良，用于进行性肌营养不良的遗传学诊断以指导治疗，以及胚胎植入前遗传学诊断和优生优育。

本发明提供了一种导致进行性肌营养不良的DMD基因突变体，所述DMD基因突变体包括c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC。

本发明还提供了上述技术方案所述的DMD基因突变体作为检测靶点在a1)～a6)任意一种或多种中的应用：

a1)制备检测进行性肌营养不良的试剂；a2)制备预防进行性肌营养不良试剂盒；a3)制备诊断进行性肌营养不良试剂盒；a4)制备孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；a5)制备孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒；a6)制备辅助治疗进行性肌营养不良试剂盒。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的DMD基因突变体的引物组合，所述引物组合包括扩增引物；

所述扩增引物包括上游引物DMD-F和下游引物DMD-R；所述DMD-F包括如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；所述DMD-R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

优选的，本发明所述引物组合还包括测序引物；所述测序引物包括上游引物DMD-SeqF和下游引物DMD-SeqR；所述DMD-SeqF包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述DMD-SeqR包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物组合在制备检测进行性肌营养不良的试剂中的应用。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的DMD基因突变体的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物组合。

优选的，所述试剂还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂在制备b1)～b5)中任意一种或多种试剂盒中的应用：

b1)预防进行性肌营养不良试剂盒；b2)诊断进行性肌营养不良试剂盒；b3)孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；b4)孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒；b5)辅助治疗进行性肌营养不良试剂盒。

本发明还提供了一种诊断进行性肌营养不良的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂。

本发明c.186+2T>C表示野生型DMD基因的第3号内含子的第2位碱基T突变为C，该突变破坏了剪切信号，可造成剪切异常；所述c.151_162delCTAGACCTCCTC表示野生型DMD基因的第3号外显子的第151至162位的CTAGACCTCCTC共12个碱基缺失，造成编码的蛋白与正常野生型DMD基因编码的蛋白相比第51至54位氨基酸(LDLL)缺失，蛋白功能异常。本发明包括c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC的DMD基因突变体，可以导致进行性肌营养不良，家系中未患病成员检测该突变结果为阴性。本发明所述DMD基因突变体丰富了进行性肌营养不良的致病突变谱，一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断进行性肌营养不良的致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导，为进行性肌营养不良患者的治疗提供全新的理论依据，可以为治疗进行性肌营养不良提供可能的药物靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为进行性肌营养不良1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图2为利用Sanger测序检测1号家系DMD:NM_004006.3:exon3:186+2T>C位点基因型的结果图，其中，C层：1号家系中半合子突变者；B层：1号家系中基因型为杂合突变携带者；A层：1号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图3为进行性肌营养不良2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者；

图4为利用Sanger测序检测2号家系DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型的结果图，其中，C层：2号家系中半合子突变者；B层：2号家系中杂合子突变携带者；A和D层：2号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图5为性别检测结果；

图6-1～图6-9为STR检测结果；

图7为进行性肌营养不良3号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图8为利用试剂盒检测3号家系DMD:NM_004006.3:exon3:186+2T>C位点基因型的结果图；其中，C层：3号家系中半合子突变者；B层：3号家系中基因型为杂合突变携带者；A层：3号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)；

图9为进行性肌营养不良4号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，

表示死亡女性个体，↗表示先证者；

图10为利用试剂盒检测4号家系DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型的结果图，其中，E和F层：4号家系中半合子突变者；B和D层：4号家系中杂合子突变者；A和C层：4号家系中基因型为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。

具体实施方式

本发明提供了一种导致进行性肌营养不良的DMD基因突变体，所述DMD基因突变体包括c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC。本发明所述DMD基因的登录号为NM_004006.3。

在本发明中，所述c.186+2T>C表示DMD基因的第3号外显子紧邻的第3个内含子的第2位碱基T突变为C，具体为DMD:NM_004006.3:exon3:186+2T>C，产生包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列(5’-ACTGGCATGTG-3’)；所述c.186+2T>C会破坏剪切信号，可造成剪切异常，引起进行性肌营养不良，具有致病性。

在本发明中，所述c.151_162delCTAGACCTCCTC表示DMD基因的第3号外显子的第151至162位的共12个碱基缺失，产生包括SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列(5’-CGCCTCGAAGGC-3’)；所述c.151_162delCTAGACCTCCTC导致编码的DMD蛋白与野生型DMD基因编码的蛋白相比，第51至54位氨基酸(LDLL)缺失，即产生含有p.Leu51_Leu54del的DMD突变体蛋白，影响正常DMD功能，引起进行性肌营养不良，具有致病性，具体为DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del。所述DMD突变体蛋白包括如SEQ IDNO.9(RRLEGL)所示的氨基酸序列。

本发明利用外显子测序筛选与进行性肌营养不良高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，通过Sanger测序进行验证，首次发现DMD基因存在c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC时，与进行性肌营养不良相关，因此，通过检测DMD基因是否存在c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC，能够检测进行性肌营养不良。本发明提供的DMD基因突变体可以将进行性肌营养不良患者和正常人群区分开，是一种诊断进行性肌营养不良的生物标志物，有助于进行性肌营养不良基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

根据本发明上述DMD基因突变体在进行性肌营养不良方面的突出作用，以下内容均属于本发明的保护范围：所述DMD基因突变体作为检测靶点制备检测进行性肌营养不良的试剂；所述DMD基因突变体作为检测靶点制备诊断进行性肌营养不良的试剂盒；所述DMD基因突变体作为检测靶点制备预防进行性肌营养不良的试剂盒；所述DMD基因突变体作为检测靶点制备辅助治疗进行性肌营养不良的试剂盒；所述DMD基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病筛查试剂盒；所述DMD基因突变体作为检测靶点制备孕前和/或产前遗传病诊断试剂盒。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的DMD基因突变体的引物组合，所述引物组合包括扩增引物和测序引物；

在本发明中，所述测序引物优选包括上游引物DMD-SeqF和下游引物DMD-SeqR；所述DMD-SeqF优选包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述DMD-SeqR优选包括如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

本发明所述SEQ ID NO.1～4的核苷酸序列具体如下：

SEQ ID NO.1：5’-CCCACCCAGGTAGATTG-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GCAGGCGGTAGAGTATG-3’；

SEQ ID NO.3：5’-AAAAGGGGATAATCGTGAA-3’；

SEQ ID NO.4：5’-AAAATCATACGAGGTTGCT-3’。

本发明所述引物组合能够检测DMD基因上是否存在c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC的突变位点，具体的，所述扩增引物特异性扩增含有c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC突变位点的DMD基因突变体片段和野生型DMD基因片段，通过测序引物进行测序后即可区分DMD基因突变体和野生型DMD基因。本发明提供的引物组合可以将进行性肌营养不良患者和正常人群区分开，快速精准诊断进行性肌营养不良。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物组合在制备检测进行性肌营养不良的试剂中的应用；所述的试剂优选包括检测DMD基因突变体的试剂；所述DMD基因突变体优选包括c.186+2T>C和/或c.151。

本发明还提供了一种检测上述技术方案所述的DMD基因突变体的试剂，所述试剂包括上述技术方案所述的引物组合，优选还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

本发明还提供了一种诊断进行性肌营养不良的试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂。本发明所述试剂盒通过男性个体和/或女性个体的检测样品中DMD基因突变体的基因型诊断个体是否患有进行性肌营养不良；所述检测样品优选包括血液。所述基因型诊断个体是否患有进行性肌营养不良的标准具体为：

当男性个体c186+2T>C和c151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的基因型是“c186+2T>C半合子突变”或“c151_162delCTAGACCTCCTC半合子突变”，则为患者；

当男性个体c186+2T>C和c151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的基因型是“c186+2T>C半合子突变”和“c.151_162delCTAGACCTCCTC半合子突变”，则为患者；

当男性个体的基因型是“野生型”，则个体为正常人；

当女性个体c186+2T>C和c151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的基因型是“c.186+2T>C杂合子突变”或“c.151_162delCTAGACCTCCTC杂合子突变”，则为携带者；

当女性个体c186+2T>C和c151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的基因型是“c.186+2T>C纯合子突变”或“c.151_162delCTAGACCTCCTC纯合子突变”，则为患者；

当女性个体c186+2T>C和c151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的基因型是“c.186+2T>C杂合子突变”和“c.151_162delCTAGACCTCCTC杂合子突变”的复合杂合突变，则为患者；

当女性个体c186+2T>C和c151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的基因型是“c.186+2T>C纯合子突变”和“c.151_162delCTAGACCTCCTC纯合子突变”，则为患者；

当女性个体的基因型是“野生型”，则个体为正常人。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的DMD基因突变体及其应用、检测DMD基因突变体的引物组合、试剂和试剂盒进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.诊断标准：

幼儿期运动发育轻度迟滞，儿童期(5～6岁)运动能力开始下降，并出现步态异常、跟腱挛缩、腰椎前凸等变化，查体可见明显双腓肠肌假肥大现象。结合血肌酶谱明显升高、肌电图呈肌源性损害，可临床疑诊DMD。确诊需基因检测发现DMD基因致病性缺陷或肌肉活检发现Dystrophin蛋白异常。

遗传咨询与产前诊断：DMD是一种X连锁隐性遗传疾病。女性携带者将致病突变位点传递给其男性后代的概率为50％，不除外发生一些新生突变。当先证者致病突变已知时，可对男性胎儿行产前诊断，可行羊毛膜、羊水细胞DNA测序、脐带血DMD流式检测等。

2.检测对象

以2个进行性肌营养不良家系(简称1号家系和2号家系)为受试对象，进行检测，该1号家系和2号家系部分成员的临床信息见表1，家系图谱如图1和图3。

表1进行性肌营养不良1号家系成员的临床信息

注：Ⅰ和Ⅱ依次表示第一代和第二代，1号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2和Ⅱ:1外周血DNA用于测序；2号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、和Ⅱ:1外周血DNA用于测序，Ⅱ:2羊水DNA用于测序。

实施例2

外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)和EB染液(Amresco)。

3.试剂配方

1)5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH8.0，0.5mol/L)	ddH<sub>2</sub>O
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	补足至100mL

2)0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释表3中5×TBE电泳液贮存液10倍即可。

3)10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

4)1×细胞核裂解液配方按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	2MTris-HCl，pH8.2	4MNaCl	2mMEDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员及2号家系中Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1成员的外周血3～5mL和2号家系Ⅱ2成员羊水DNA为研究样品。

4.1样本DNA提取

1)如为肝素抗凝外周血样本，则将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明；如为羊水则直接进行步骤2)。

2)4℃，3000rpm离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积的酚和氯仿混合液(酚和氯仿的体积比为1:1)混匀，室温3000rpm离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到具有致病意义的基因突变DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C和exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del；其中exon3:c.186+2T>C的突变为位于第3号外显子紧邻的第3个内含子的第2位碱基由T突变为C，该突变破坏了剪切信号，可造成剪切异常；exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC的突变为第151至162位的12个碱基缺失，可能导致所编码的蛋白质第51至54位氨基酸(LDLL)缺失。

在1号家系患者男性个体中DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点的基因型是“c.186+2T>C半合子突变”，在1号家系女性携带者个体中DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点的基因型是“c.186+2T>C杂合突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。

在2号家系患者男性个体中DMD:NM_004006.3:exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的基因型是“c.151_162delCTAGACCTCCTC半合子突变”，在2号家系女性携带者个体中两位点的基因型是“c.151_162delCTAGACCTCCTC杂合突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。

实施例3

Sanger测序验证

对1号家系和2号家系外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C和exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲)、2号家系4名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲、胎儿)和100名家系外正常人进行DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C和exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1.DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

2.候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3。

2.2针对突变位点c.186+2T>C和c.151_162delCTAGACCTCCTC设计21对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况

表6针对c.186+2T>C和c.151_162delCTAGACCTCCTC位点候选引物基本情况和验证实验结果

/>

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类引物。

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

/>

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃预变性5min；

第二步：30个循环(95℃变性30sec→Tm退火30sec→72℃延伸60sec)；(根据表9中各引物Tm值设置PCR扩增参数)。

第三步：72℃延伸7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表7验证测试后统计的结果，选择表6中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为针对DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点和DMD:NM_004006.3:exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的扩增引物。

3、1号和2号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃预变性5min；

第二步：30个循环(95℃变性30sec→40℃退火30sec→72℃延伸60sec)；

第三步：72℃延伸7min；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

试剂	PCR产物纯化后DNA	3.2pmol/μL测序引物	BigDye	5×BigDye测序缓冲液	ddH<sub>2</sub>O
						体积	2.0μL	1.0μL	0.5μL	2.0μL	4.5μL

测序PCR循环条件：

第一步：96℃预变性1min；

第二步：33个循环(96℃变性30sec→55℃退火15sec→60℃延伸4min)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(pH5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15min；

3)3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；

4)室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物，引物序列如下所示。

针对DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点和DMD:NM_004006.3:exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的测序引物序列如下所示：

5’-AAAAGGGGATAATCGTGAA-3’(SEQ ID NO.3)

5’-AAAATCATACGAGGTTGCT-3’(SEQ ID NO.4)。

9、结果分析

针对DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点的测序结果显示，1号家系中1名患者DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点基因型是“c.186+2T>C”半合子突变；1号家系中1名携带者该位点的基因型是“c.186+2T>C”的杂合突变；100个无血缘关系的正常对照的DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C和exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“野生型”，“c.186+2T>C”半合子突变、“c.186+2T>C”的杂合突变和“野生型”的测序结果如图2所示。其中，箭头所指位置C层显示家系患者DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点基因型是“c.186+2T>C”半合子突变，B层显示家系中携带者DMD:NM_004006.3:exon3:c.186+2T>C位点基因型是“c.186+2T>C”杂合子突变，A层显示家系中先证者父亲该基因位点为野生型。

针对DMD:NM_004006.3:exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点的测序结果显示，2号家系中1名患者DMD:NM_000377.3:exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“c.151_162delCTAGACCTCCTC”半合子突变；2号家系中1名携带者该位点的基因型是“c.151_162delCTAGACCTCCTC”的杂合突变；2名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的DMD:NM_004006.3:exon3:c.151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“野生型”，“c.151_162delCTAGACCTCCTC”半合子突变、“c.151_162delCTAGACCTCCTC”的杂合突变和“野生型”的测序结果如图4所示。其中，箭头所指位置C层显示家系中患者DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“151_162delCTAGACCTCCTC”半合子突变，B层显示家系中携带者DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“151_162delCTAGACCTCCTC”杂合子突变，A和D层显示家系中正常个体DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“野生型”。

实施例4

胎儿性别鉴定及STR连锁分析

1、家系2胎儿性别鉴定(SRY基因检测)：

(1)抽提2号家系胎儿羊水gDNA，具体步骤同实施例2中的步骤4。

(2)对抽提2号家系胎儿羊水gDNA进行PCR扩增，检测SRY基因，PCR反应体积20μL，含MgCl₂1.5mM、四种dNTP各200μM、单条引物60ng、模板DNA 100ng，Taq酶1U。具体的引物序列和反应条件如表10。

表10 SRY基因检测PCR扩增相关参数

(3)参照实施例3步骤2.4，对步骤(2)的扩增产物进行电泳检测。

(4)结果判断：SRY基因PCR扩增如果出现一609bp的特异条带以及内对照条带(选择DMD基因第6外显子，为202bp)则为一男性个体，如果仅出现内对照扩增条带，则为一女性个体。

上述步骤(3)检测结果如图5所示，根据图5可以看出，SRY基因PCR扩增如果出现一609bp的特异条带以及内对照条带，提示胎儿为一男性个体。

2.家系2的STR连锁分析：

本实施例对家系2人员Ⅰ:2、Ⅱ:1和Ⅱ:2进行STR连锁分析。

具体方法步骤如下：

(1)DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

(2)PCR反应

选择DMD基因内9个微卫星位点(2CA、3`CA、7CA、44CA、45CA、49CA、50CA、59CA、63CA)进行检测；微卫星位点的引物序列由上海生工生物技术公司合成，并完成荧光集团标记，具体信息如下表11。

表11 DMD基因内9个微卫星位点检测PCR扩增相关参数

PCR反应总体积20μl，含MgCl₂1.5mM、四种dNTP各200uM、单条引物60ng、模板DNA100ng，Taq酶1U。

(3)结果分析

使用GeneMarker软件对上述步骤PCR扩增产物进行分析，结果如图6-1～图6-9所示。

根据图6-1～图6-9可以看出，先证者和胎儿的7个微卫星(2CA、7CA、44CA、45CA、49CA、59CA、63CA)的基因型不同，并且先证者和胎儿分别与其母亲其中一种基因型相同，先证者和胎儿分别遗传了其母亲不同的X染色体，先证者遗传了其母亲DMD基因突变的那条X染色体，胎儿则相反。

实施例5

进行性肌营养不良诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

试剂盒：1)扩增引物：如实施例3中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；2)PCR缓冲液(10×PCR缓冲液，由500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，15mmol/L MgCl₂和余量的水组成)；3)Taq酶(20U)；4)dNTPs(四种dNTP各4mM)；5)c.186+2T>C阳性参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.186+2T>C突变位点阳性参考品的具体序列如SEQ ID NO.5所示，具体的：

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c.151_162delCTAGACCTCCTC阳性参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.151_162delCTAGACCTCCTC突变位点阳性参考品的具体序列如SEQ ID NO.6所示，具体的：

单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，方框空白处为缺失突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置；6)测序引物：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2、使用方法：

应用于3号和4号家系基因突变检测，临床信息如表12所示，3号家系图谱如图7，4号家系图谱如图9。

表12进行性肌营养不良3号与4号家系成员的临床信息

注：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依次表示第一代、第二代和第三代。

3号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2和Ⅱ:1外周血DNA用于该试剂盒检测；4号家系人员Ⅱ:1、Ⅱ:2、Ⅱ:3、Ⅱ:4、Ⅲ:1和Ⅲ:2外周血DNA用于该试剂盒检测，步骤如下：

1)基因组DNA提取：按照实施例2步骤提取样本基因组DNA。

2)先采用试剂盒中的PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述试剂盒中的测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

利用试剂盒对3号家系人员检测结果如图8所示，根据图8可以看出，3号家系中先证者DMD:NM_004006.3:exon3:186+2T>C位点基因型是“186+2T>C”半合子突变；先证者母亲DMD:NM_004006.3:exon3:186+2T>C位点基因型是“186+2T>C”杂合子突变；检测结果确认先证者为进行性肌营养不良患者，先证者母亲为进行性肌营养不良致病基因携带者，先证者父亲基因型为野生型，为正常个体。患者父母以后生男孩有50％的概率为进行性肌营养不良患者，建议以后如需生育二胎，至医院行胚胎植入前遗传学诊断或产前诊断。

利用试剂盒对4号家系人员检测结果如图10所示，根据图10可以看出，4号家系中先证者和其表弟DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“151_162delCTAGACCTCCTC”半合子突变(E和F层)；先证者母亲和姨妈DMD:NM_004006.3:exon3:151_162delCTAGACCTCCTC:p.Leu51_Leu54del位点基因型是“151_162delCTAGACCTCCTC”杂合突变(B和D层)，检测结果确认先证者和其表弟为进行性肌营养不良患者，先证者母亲和姨妈为进行性肌营养不良致病基因携带者。遗传咨询意见先证者和其表弟建议尽早干预治疗，且患者父母和姨父母以后生男孩有50％的概率为进行性肌营养不良患者，建议以后如需生育二胎，至医院行胚胎植入前遗传学诊断或产前诊断。

根据上述实施例可以看出，本发明DMD基因突变体可以作为诊断进行性肌营养不良的生物标志物，为治疗进行性肌营养不良提供可能的药物靶点。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种导致进行性肌营养不良的DMD基因突变体，其特征在于，所述DMD基因突变体包括c.186+2T>C和/或c.151_162delCTAGACCTCCTC。

2.权利要求1所述的DMD基因突变体作为检测靶点在a1)～a6)任意一种或多种中的应用：

3.一种检测权利要求1所述的DMD基因突变体的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括扩增引物；

所述扩增引物包括上游引物DMD-F和下游引物DMD-R；所述DMD-F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述DMD-R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括测序引物，所述测序引物包括上游引物DMD-SeqF和下游引物DMD-SeqR；所述DMD-SeqF包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述DMD-SeqR包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

5.权利要求3或4所述的引物组合在制备检测进行性肌营养不良的试剂中的应用。

6.一种检测权利要求1所述的DMD基因突变体的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求3或4所述的引物组合。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。

8.权利要求6或7所述的试剂在制备b1)～b5)中任意一种或多种试剂盒中的应用：

9.一种诊断进行性肌营养不良的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6或7所述的试剂。