CN115851642A - 一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物催化领域，主要涉及一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。本发明提供了一种高活力的酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR，其与L‑泛解酸内酯脱氢酶和葡萄糖脱氢酶于E.coli BL21(DE3)中共表达，可用于合成D‑泛解酸内酯。结果表明，在5mL催化体系中，含酶湿菌体400g/L，DL‑泛解酸内酯1M，葡萄糖2M，在pH 6.0PBS缓冲液中，反应温度30℃，反应转速400rpm，反应24h后补加葡萄糖脱氢酶100g/L，反应至36h时D‑泛解酸内酯e.e.值高达98％。
Description
技术领域
本发明属于生物催化领域，主要涉及源自一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。
背景技术
D-泛酸钙又称维生素B5，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等行业。工业化合成D-泛解酸内酯是采用化学法和水解酶拆分法相结合的技术路线。合成D-泛解酸内酯从羟醛缩合开始，获得的羟基特戊醛在酸性条件下与HCN反应生成氰醇，氰醇水解闭环生成外消旋的DL-泛解酸内酯。DL-泛解酸内酯经内酯水解酶选择性水解D-泛解酸内酯成D-泛解酸，D-泛解酸与L-泛解酸内酯分离后再内酯化成为D-泛解酸内酯，同时L-泛解酸内酯经消旋化为DL-泛解酸内酯用于后续的拆分。该工艺虽然在工业上已运用多年，但是具有能耗大、酸碱使用多、工艺复杂等不足。氧化还原酶级联催化合成D-泛解酸内酯是一种非常有前景的生物法，该法利用L-泛解酸内酯脱氢酶、酮基泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶级联催化DL-泛解酸内酯的去消旋，可替代现有的酶法选择性拆分工艺，不涉及D-泛解酸与L-泛解酸内酯的分离，减少了酸碱有机溶剂的使用，具有绿色、环保、安全、高效的优点。
氧化还原酶法中L-泛解酸内酯脱氢酶催化L-泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，酮基泛解酸内酯还原酶将酮基泛解酸内酯还原为D-泛解酸内酯，同时葡萄糖脱氢酶在葡萄糖存在下驱动辅酶循环。其中，将酮基泛解酸内酯不对称还原为D-泛解酸内酯是该方法的关键步骤。目前已报道的高活力酮基泛解酸内酯还原酶为数不多，酮基泛解酸内酯还原酶的活力若不能满足多酶级联催化反应，将导致中间产物的积累，降低多酶级联的催化效率，增加后续产物分离纯化的难度。
目前尚未见源自Zygosaccharomyces parabailii的酮基泛解酸内酯还原酶的报道，也没见源自Zygosaccharomyces parabailii的酮基泛解酸内酯还原酶用于多酶级联去消旋DL-泛解酸内酯不对称合成D-泛解酸内酯的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用。
本发明提供了ZpaAR在催化DL-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯中的应用，所述的ZpaAR来源于Zygosaccharomyces parabailii，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，本发明提供了编码ZpaAR的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
更进一步的，所述的ZpaAR用于D-泛解酸内酯的合成，具有色、环保、安全、高效的优点。
本发明提供了核酸组合，其包括编码AmeLPLDH的核酸、编码BsGDH的核酸和本发明所述的编码ZpaAR的核酸；
所述的AmeLPLDH的编码核酸如SEQ ID NO:3所示；
所述的BsGDH的编码核酸如SEQ ID NO:5所示。
本发明提供了表达模块，其包括：
启动子、终止子和本发明所述的核酸。
启动子、终止子和本发明所述的核酸组合。
进一步的，所述的启动子包括但不限于T7、T7lac、Sp6、araBAD、lac、pTac。
更进一步的，本发明利用T7启动子进行所述核酸的表达。
一些实施例中，所述表达模块包括T7和AmeLPLDH。
另一些实施例中，所述表达模块包括T7和BsGDH。
另一些实施例中，本发明所述的表达模块包括T7、ZpaAR和BsGDH。
本发明中，所述的表达单元还包括单个或多个本发明所述的核酸以串联、融合表达或及其他可行方式进行组合形成的表达单元，本发明对此不做限定。
本发明所述表达模块，还可以包括复制子、终止子等调控元件，本发明对此不做限定。
本发明提供了重组载体，其包括：
载体骨架和本发明所述的核酸；
或载体骨架和本发明所述的核酸组合；
或载体骨架和本发明所述的表达模块。
进一步的，本发明所述的载体包括原核载体。更进一步的，所述的原核载体包括可用于大肠杆菌目的蛋白表达的原核载体，本发明对此不做限定。
本发明中，利用pACYCDuet-1和pET28a对所述的核酸进行表达，所述的骨架载体与核酸的组合形式可以包括如下所示中的任意一种或多种：
pET28a-AmeLPLDH；
pACYCDuet-1-ZpaAR；
pACYCDuet-1-BsGDH；
pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH。
本发明所述的载体，还包括将所述的核酸组合或表达单元与单个或多个载体骨架形成的多种形式的载体。
本发明提供了宿主，其转化或转染本发明所述的重组载体。
进一步的，所述的宿主包括但不限于大肠杆菌、酵母、动物细胞，本发明对此不做限定。
更进一步的，本发明以大肠杆菌为宿主细胞，转化或转染本发明所述的重组载体。
本发明提供了所述宿主的制备方法，包括将本发明所述的载体转化或转染宿主细胞。所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。本发明一些实施例中，所述表达系统的制备方法包括将本发明所述的重组载体通过化学转化的方法转化大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明提供了如下I)～V)中至少一种在制备D-泛解酸内酯中的应用：
I)、本发明所述的核酸；
II)、本发明所述的核酸组合；
III)、本发明所述的表达模块；
IV)、本发明所述的重组载体；
V)、本发明所述的宿主。
本发明提供了D-泛解酸内酯的制备方法，其以本发明所述的宿主为发酵菌株，并在反应体系中加入DL-泛解酸内酯、葡萄糖，经反应制得含有D-泛解酸内酯的产物。
进一步的，所述的DL-泛解酸内酯浓度为：250mM～1500mM；所述的葡萄糖的浓度为：0mM～2500mM。
更进一步的，所述的反应体系的条件包括：
反应温度20℃～40℃；
搅拌转速0rpm～600rpm；
50mM PBS缓冲液pH 5.0～10.0。
本发明中，所述的D-泛解酸内酯的制备方法，包括在发酵24h后补加只含有BsGDH的菌株。
所述的只含有BsGDH的菌株是将载体pACYCDuet-1-BsGDH转化宿主构建的重组菌株，该重组菌株用于葡萄糖脱氢酶BsGDH的表达。
进一步的，所述的宿主为E.coli BL21(DE3)。
本发明中，在5mL催化体系中，湿菌体400g/L，DL-泛解酸内酯1M，葡萄糖2M，在pH6.0PBS缓冲液中，反应温度30℃，反应转速400rpm，反应24h后补加BsGDH 100g/L，反应至36h时D-泛解酸内酯e.e.值高达98％。
本发明提供了由所述的制备方法制得的产品。
进一步的，本发明所述的产品，包括食品、药品或饲料，本发明对此不做限制。
更进一步的，所述的产品的剂型包括液剂、粉剂、固体制剂；其施用当时可以包括涂抹、外敷等，本发明对此不做限定。
本发明取得了以下有益效果：
本发明提供了一种高活力的酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR，该酶源自Zygosaccharomyces parabailii，其与L-泛解酸内酯脱氢酶和葡萄糖脱氢酶于E.coliBL21(DE3)中共表达，可用于催化DL-泛解酸内酯合成D-泛解酸内酯。结果表明，在5mL催化体系中，作为生物催化剂的湿菌体400g/L，DL-泛解酸内酯1M，葡萄糖2M，在pH 6.0PBS缓冲液中，反应温度30℃，反应转速400rpm，反应24h后补加葡萄糖脱氢酶100g/L，反应至36h时D-泛解酸内酯e.e.值高达98％。
附图说明
图1示以AmeLPLDH、ZpaAR、BsGDH共表达构建重组基因工程菌作为生物催化剂，去消旋合成D-泛解酸示意图；
图2示SDS-PAGE胶图；其中，从左到右，泳道M，Blue plus II protein marker；泳道1，未经诱导基因工程菌；泳道2，诱导后的基因工程菌，加粗条带对应为AmeLPLDH、ZpaAR和BsGDH，其分子量大小分别为42kDa、35kDa和28kDa；
图3示标样L-泛解酸内酯、D-泛解酸内酯、酮基泛解酸内酯的气相色谱图；
图4示合成D-泛解酸内酯的最适温度；
图5示合成D-泛解酸内酯的最适搅拌速度；
图6示合成D-泛解酸内酯的最适pH；
图7示合成D-泛解酸内酯的最适辅底物浓度；
图8示底物浓度对合成D-泛解酸内酯的影响；
图9示补加葡萄糖脱氢酶BsGDH对合成D-泛解酸内酯的影响；
图10示分离所得产物D-泛解酸内酯的手性GC分析谱图；
图11示分离所得产物D-泛解酸内酯的GC-MS分析谱图；
图12示分离所得产物D-泛解酸内酯的1H NMR谱图；
图13示分离所得产物D-泛解酸内酯的13C NMR谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明中所述表达模块是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。
本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。
在本发明中，对表达融合蛋白的DNA序列进行了优化，这些优化包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。
编码ZpaAR的核酸为：
atgccgaaactgccggccccgaccctgaaaattaaagcaagcggtacccgtattccggttctgggcttcggtaccggtacccagtggcgcattgccaaacgtgaaggtgaaaccaaaggccagttcattaataaactggttgcccagctgcgcgaggcaattaatgtagggttcacccatattgatacagcagaatattactgtacccatgaagaagtgggggcagcactgaaagaaagcaacgttccgcgtaatgaactgtttatcacagataaatacaaccagggcgcctggaccggcctggactgtagcggtccggtgcaggcagcacataaagcactgaatctgctgaatctgcagtatttcgatctgtatatgctgcaccgcccggacattaccaaagaaaacgcgggcattgatctgcaggaagcatggcgtcaactggaacaactgtatgaaagcggtctggcaaaagcaattggtgttagcaactttcctctggaatatctgaaaaagatggaaagctattgtaaatacatgccaatggttcaccagatcgaatttaatccttacctgcagaatcaaacaccgggtgtagttgagtggtgccagaaaaaggagatcgttgtggaagcatattcaccgctgaccccgctgtcccgcgcacgtcctggaccactggacgcaattctgccgggactggtcaaaaagtatggtcgttctgaaacccaaattctgctgcgttgggttattgatcgtggtctggttgttctgaccacctctagtaaaagcgaacgtctgcaggagattctgggtagcctggaatttaaactggaaaaacgtgatatcgacctgatcagcgaagttggtcgtgaaaaacattatcagtggtgcctgagcgaattctttgcacaatttcgtagt(如SEQ ID NO:1所示)。
ZpaAR的氨基酸为：
MPKLPAPTLKIKASGTRIPVLGFGTGTQWRIAKREGETKGQFINKLVAQLREAINVGFTHIDTAEYYCTHEEVGAALKESNVPRNELFITDKYNQGAWTGLDCSGPVQAAHKALNLLNLQYFDLYMLHRPDITKENAGIDLQEAWRQLEQLYESGLAKAIGVSNFPLEYLKKMESYCKYMPMVHQIEFNPYLQNQTPGVVEWCQKKEIVVEAYSPLTPLSRARPGPLDAILPGLVKKYGRSETQILLRWVIDRGLVVLTTSSKSERLQEILGSLEFKLEKRDIDLISEVGREKHYQWCLSEFFAQFRS(如SEQ ID NO:2所示)。
编码AmeLPLDH的核酸为：
atgagtaacggctggtttgaaaccgtggccgaagcacagcgtcgtgcacgcaaacgcctgccgaaaagtgtgtatggtgcactggtggccggtagcgaacgcggcattaccgttgacgataacattgccgcctttgccgaactgggttttgccccgcatgttgccggtctgagcgataaacgtgaactgggcaccaccgtgatgggtcagccgattagcctgccggtggttattagcccgaccggtgttcaggcagttcatccggatggcgaagttgcagttgcccgtgcagcagcagcacgtggtaccgcaatgggcctgagcagcttcgccagcaagagcatcgaagaagtggccgcagccaatccgcagacctttttccagatgtattgggtgggcagccgcgacgttctggttcagcgcatggaacgtgcccgcgcagcaggtgcagttggtctgattatgaccctggactggagcttcagcaccggtcgcgactggggtagtccggtgattcctgaaaagctggatctgaaggcaatggcacgctttgccccggagggtattacccgtccgaaatggctgtgggacttcgccaaaacccgtaagctgccggatctgacaaccccgaatttaacaccgccgggtggcacagccccgaccttttttggcgcatacggcgaatggatgcagaccccgctgccgacatgggaagacgtggcctggctgcgcgaacaatggggtggcccgtttatgctgaagggcgtgatgcgtgttgacgatgcaaaacgtgccgttgatgccggcgttaccgcaattagcgtgagcaaccacggcggtaacaatctggatggtacaccggcaccgattcgtgccctgccggcaattgcagatgccgtgggcggtgatgtggaagttctgctggatggcggtattcgtcgcggcagtgacgtggttaaggccattgccctgggtgccaaagcagttctgatcggtcgcgcctatctgtggggcctggcagcaaatggtcaggccggcgtggaaaatgttctggacattctgcgtggcggtattgacagcgccgttctgggcctgggtaagaccagcatccatgagctgacccgcgatgatgtggttattccgccgggcttcgaacgtgccctgggtgttcctaaaagt(如SEQ ID NO:3所示)。
AmeLPLDH的氨基酸序列为：
MSNGWFETVAEAQRRARKRLPKSVYGALVAGSERGITVDDNIAAFAELGFAPHVAGLSDKRELGTTVMGQPISLPVVISPTGVQAVHPDGEVAVARAAAARGTAMGLSSFASKSIEEVAAANPQTFFQMYWVGSRDVLVQRMERARAAGAVGLIMTLDWSFSTGRDWGSPVIPEKLDLKAMARFAPEGITRPKWLWDFAKTRKLPDLTTPNLTPPGGTAPTFFGAYGEWMQTPLPTWEDVAWLREQWGGPFMLKGVMRVDDAKRAVDAGVTAISVSNHGGNNLDGTPAPIRALPAIADAVGGDVEVLLDGGIRRGSDVVKAIALGAKAVLIGRAYLWGLAANGQAGVENVLDILRGGIDSAVLGLGKTSIHELTRDDVVIPPGFERALGVPKS(如SEQ ID NO:4所示)。
编码BsGDH的核酸为：
atgtatatgtatccggatctgaaaggcaaagttgttgcaattaccggtgcagcaagcggcctgggtaaagccatggcgattcgttttggtaaagaacaggcgaaagttgttattaactattattccaacaaacaggatccgaatgaagtgaaagaagaagttattaaagccggtggtgaagcagtggttgtgcagggtgatgttacaaaagaagaagatgtgaaaaacatcgtgcagacggcgatcaaagaatttggtacgctggatatcatgattaataacgcaggtctggaaaatccagttccgagccatgaaatgccgctgaaagattgggataaagtgatcggtaccaatctgacaggcgcatttctgggtagccgtgaagccattaaatattttgttgaaaacgatatcaaaggtaacgttattaacatgagcagtgtgcatgaagttattccgtggccgctgtttgttcattatgcagccagcaaaggtggtattaaactgatgaccgaaacgctggcactggaatatgcaccaaaaggtattcgcgttaataatattggcccgggtgcgattaacaccccgattaacgccgaaaaatttgcagatccgaaacagaaagccgatgtggaaagcatgattccgatgggttatatcggtgaacctgaagaaatcgcagcagtcgcggcatggctggcaagcaaagaagcaagctatgtgaccggtattaccctgtttgcagatggtggtatgacgcagtatccgagctttcaggcgggtcgtggt(如SEQ ID NO:5所示)。
BsGDH的氨基酸序列为：
MYMYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG(如SEQ ID NO:6所示)。
LB液体培养基组成(1L)：胰化蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g。用1M的NaOH调节pH值到7.0～7.5，定容至1L。在121℃高压灭菌20min，4℃储存。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1L-泛解酸内酯脱氢酶AmeLPLDH、酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR、葡萄糖脱氢酶BsGDH共表达基因工程菌的构建
经密码子优化后，人工合成来源于Zygosaccharomyces parabailii的酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR编码基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR的构建：将SEQ ID NO:1所示酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR编码基因插入pACYCDuet-1载体的Nco I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pACYCDuet-1-ZpaAR；将重组载体pACYCDuet-1-ZpaAR导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR。
经密码子优化后，人工合成来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶BsGDH编码基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
将SEQ ID NO:5所示葡萄糖脱氢酶BsGDH编码基因插入pACYCDuet-1-ZpaAR载体的Nde I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH。
经密码子优化后，人工合成来源于Amycolatopsis methanolica的L-泛解酸内酯脱氢酶AmeLPLDH编码基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AmeLPLDH的构建：将SEQ ID NO:3所示L-泛解酸内酯脱氢酶AmeLPLDH编码基因插入pET28a载体的Nco I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pET28a-AmeLPLDH；将重组载体pET28a-AmeLPLDH导入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AmeLPLDH。
将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH制备成为感受态，将重组载体pET28a-AmeLPLDH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH中，获得L-泛解酸内酯脱氢酶AmeLPLDH、酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR、葡萄糖脱氢酶BsGDH共表达基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH/pET28a-AmeLPLDH。
表达葡萄糖脱氢酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-BsGDH构建：将SEQ ID NO:5所示葡萄糖脱氢酶BsGDH编码基因插入pACYCDuet-1载体的Nde I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pACYCDuet-1-BsGDH。将重组载体pACYCDuet-1-BsGDH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-BsGDH。
实施例2三酶共表达基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH/pET28a-AmeLPLDH湿菌体的制备
基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH/pET28a-AmeLPLDH按如下方法制备湿菌体：将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH/pET28a-AmeLPLDH接种于含有终浓度100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养过夜，然后以体积浓度2％的接种量转接于含有100μg/mL卡那霉素/氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养至菌体浓度OD600至0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.2mM的IPTG，在21℃下诱导培养12h，获得诱导培养液。同样条件下，以不添加IPTG的培养液为未诱导对照培养液。再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液；然后用pH为8.0和50mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体作为生物催化剂，于-80℃条件下保存备用。
SDS-PAGE检测样品的制备：取未诱导对照培养液和诱导培养液各1mL，在12000rpm离心1min，弃去上清，留取菌体。菌体随后各加入100μL超纯水，将菌重悬成菌悬液。之后，各取20μL菌悬液，加入4μL 6×Protein Loading Buffer混匀后，煮沸10min。煮沸结束后，12000rpm离心1min，各取15μL上清液用于SDS-PAGE检测，蛋白质Marker为BluePlusProtein Marker(14-120kDa)。如图2所示，SDS-PAGE检测表明，L-泛解酸内酯脱氢酶AmeLPLDH、酮基泛解酸内酯还原酶ZpaAR、葡萄糖脱氢酶BsGDH均在大肠杆菌中成功表达。
实施例3E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH/pET28a-AmeLPLDH湿菌体催化DL-泛解酸内酯去消旋的反应体系构建
实施例2制备的E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-ZpaAR-BsGDH/pET28a-AmeLPLDH湿菌体于50mM PBS缓冲液(pH 6.0)中重悬为催化剂，以DL-泛解酸内酯为底物，葡萄糖为辅底物，构成5mL的反应体系。初始未进行条件优化的反应体系如下：底物DL-泛解酸内酯750mM，湿菌体终浓度400g/L，加入pH 6.0的50mM PBS缓冲液中，辅底物浓度为1500M，在pH为6.0、600rpm和30℃下反应24h。反应过程通过流加3M NaOH溶液维持pH恒定。同样条件下，以不加催化剂为空白对照。
反应结束后取300μL反应液于12000rpm离心3min，取200μL上清加入800μL乙酸乙酯萃取30min。萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相600μL加入0.8g无水硫酸钠，然后在12000rpm下再离心1min，取100μL上清液，补加乙酸乙酯至终体积0.5mL，利用气相色谱法检测样品中D-泛解酸内酯的含量。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。
气相色谱条件如下：气相色谱仪，Agilent 6890N；手性色谱柱，BGB-174(30m×250μm×0.25μm)；检测器，FID，250℃；载气，N2；载气流量，30mL/min；分流比：30：1；进样量：1.0μL；进样口温度：250℃。升温程序：175℃保持10min。如图3所示，底物、中间产物和产物的标样保留时间分别如下：D-泛解酸内酯，6.192min；L-泛解酸内酯，6.514min；酮基泛解酸内酯，6.783min。
其余反应液在12000rpm下离心2min，取上清，加入4倍反应液体积的乙酸乙酯，在200rpm和30℃条件下萃取1h，萃取结束后，在12000rpm下离心1min，取上层有机相。上层有机相经减压蒸馏去除乙酸乙酯，最终获得D-泛解酸内酯，其转化率为90％，对应的e.e.值为80％。
实施例4合成D-泛解酸内酯的最适温度
选取20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，其他操作及反应条件同实施例3。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差，结果如图4所示。在酶法催化DL-泛解酸内酯去消旋合成D-泛解酸内酯中，转化率越高，对应的D-泛解酸内酯e.e.值越高，e.e.值不仅代表光学纯度，而且体现转化率。酶在不同温度下活力差异较大，随着温度的升高产物e.e.值在30℃时达到峰值，之后温度升高会导致e.e.值下降，说明酶活力受损。由此可知，催化体系的最适温度为30℃。
实施例5合成D-泛解酸内酯的最适搅拌速度
选取转速为取0rpm、100rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm和600rpm。反应温度为30℃。其他操作及反应条件同实施例2。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。如图5所示，较低的转速会严重影响传质，导致e.e.值不高，当转速达到300rpm时e.e.值便有了提升，升至400rpm时，反应便可以达到最适催化效率，之后随着转速升高，催化效果略有下降。因此，催化体系的最适转速可为400rpm。
实施例6合成D-泛解酸内酯的最适pH
将反应体系的pH设为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，反应温度为30℃，转速为400rpm。其他操作及反应条件同实施例2。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。结果如图6所示，在酸性条件下产物e.e.值较高，当反应偏向于碱性后e.e.值骤降，而随着pH降至6.0时该体系达到最佳催化效果，pH持续下降，产物e.e.值有较小幅度的下降。由此可见，最适的反应pH为6.0。
实施例7合成D-泛解酸内酯的最适辅底物浓度
将反应体系辅底物葡萄糖终浓度设为0mM、500mM、1000mM、1500mM、2000mM和2500mM，反应温度为30℃，反应pH为6.0，转速为400rpm。其他操作及反应条件同实施例2。每次做三组平行实验，计算平均值和标准误差。结果如图7所示，在不添加辅底物葡萄糖的情况下，该体系几乎不发生反应，随着葡萄糖浓度的增加，产物e.e.值逐渐提高，当终浓度达到2000mM时提高至最大产物e.e.值。由此可见，最适的反应辅底物葡萄糖终浓度为2000mM。
实施例8底物浓度对合成D-泛解酸内酯的影响
底物终浓度分别为250mM、500mM、750mM、1000mM、1250mM、1500mM。反应温度为30℃，反应pH为6.0，转速为400rpm，辅底物葡萄糖终浓度2000mM。反应体系为5mL。其他操作及反应条件同实施例2。如图11所示，D-泛解酸内酯e.e.值随底物浓度的增加而减少，当底物浓度不大于750mM时，产物e.e.值均>98％。当底物浓度提高到1000mM以上时，产物e.e.值有了非常明显的下降，并且有中间产物酮基泛解酸内酯生成，这表明底物浓度的增加一定程度上会抑制了酶的催化活力。
实施例9补加葡萄糖脱氢酶BsGDH对合成D-泛解酸内酯的影响
在1000mM底物浓度下，反应24h后有中间产物积累，推测反应中葡萄糖脱氢酶BsGDH可能活力降低甚至失活，因此在反应24h补加100g/L表达葡萄糖脱氢酶的湿菌体E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-BsGDH，考察补加葡萄糖脱氢酶对D-泛解酸内酯e.e.值的影响。5mL反应体系如下：反应温度为30℃，pH为6.0，转速为400rpm，辅底物葡萄糖终浓度2000mM，底物DL-泛解酸内酯终浓度为1000mM。其他操作及反应条件同实施例2。在24h处加入终浓度100g/L的葡萄糖脱氢酶BsGDH。总反应36h后取样检测。以相同条件下不补加葡萄糖脱氢酶作为反应对照。结果如图9所示，1000mM底物在优化条件下反应24h后补加100g/L表达葡萄糖脱氢酶的湿菌体E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-BsGDH，反应36h时D-泛解酸内酯e.e.值达98％(图10)，而不补加葡萄糖脱氢酶的对照产物e.e.仅为80.4％。
产物e.e.值达98％的反应液经分离纯化后获得产物D-泛解酸内酯。产物经气相-质谱联用仪(GC-MS)分析，该物质分子量130，其结果与预期相符(图11)。将产物通过核磁共振谱确定其纯度与结构，称取0.015g的粗产物溶于CDCl3中，进行氢谱与碳谱检测，其结果为：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.12(s,1H),4.03-4.02(d,J＝8.9Hz,1H),3.95-3.93(d,J＝8.9Hz,1H),1.23(s,3H),1.08(s,3H)(图12)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ177.60,76.42,75.76,40.89,22.91,18.81(图13)，其结果也与预期相符。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (15)
1.ZpaAR在催化DL-泛解酸内酯生成D-泛解酸内酯中的应用，所述的ZpaAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.编码ZpaAR的核酸，其序列如SEQ ID NO:1所示。
3.核酸组合，其特征在于，包括权利要求2所述的核酸，和/或编码AmeLPLDH的核酸，和/或编码BsGDH的核酸；
所述的AmeLPLDH的编码核酸如SEQ ID NO:3所示；
所述的BsGDH的编码核酸如SEQ ID NO:5所示。
4.表达模块，其特征在于，包括：
启动子、终止子和权利要求1所述的核酸；
或启动子、终止子和权利要求2或3所述的核酸组合。
5.根据权利要求4所述的表达模块，其特征在于，所述的启动子包括T7启动子。
6.重组载体，其特征在于，包括：
载体骨架和权利要求1所述的核酸；
或载体骨架和权利要求3所述的核酸组合；
或载体骨架和权利要求4或5所述的表达模块。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述的载体骨架选自pACYCDuet-1和pET28a。
8.宿主，其包括转化或转染如权利要求6或7所述的重组载体。
9.权利要求8所述的宿主的制备方法，其特征在于，构建含有权利要求6或7所述的重组载体，然后转化或转染宿主。
10.如下I)～V)中的至少一项在制备D-泛解酸内酯中的应用：
I)、权利要求1所述的核酸；
II)、权利要求3所述的核酸组合；
III)、权利要求4或5所述的表达模块；
IV)、权利要求6或7所述的重组载体；
V)、权利要求8所述的宿主。
11.D-泛解酸内酯的制备方法，其特征在于，发酵如权利要求8所述的宿主，并在发酵的反应体系中加入DL-泛解酸内酯、葡萄糖，制得含有D-泛解酸内酯的产物。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，
所述DL-泛解酸内酯浓度为：250mM～1500mM；
所述葡萄糖的浓度为：0mM～2500mM。
13.根据权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件包括：
反应温度20℃～40℃；
搅拌转速0rpm～600rpm；
50mM PBS缓冲液pH 5.0～10.0。
14.根据权利要求11～13任一项所述的制备方法，其特征在于，在发酵第24h后补加只含有BsGDH的菌株，补加量为100g/L。
15.由权利要求11～14所述的制备方法制得的产品。
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