CN115851466A - 一株杰丁毕赤酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体提供了一株杰丁毕赤酵母及其应用，所述杰丁毕赤酵母菌株代号为LABOFMIC‑306，寄存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221329。经实验表明，该杰丁毕赤酵母菌具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一株杰丁毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明主要涉及微生物及其应用领域，具体涉及一株杰丁毕赤酵母及其应用。

背景技术

皮肤微生物是皮肤微生态系统的重要成员，皮肤表面的菌群通常可分为常驻菌和暂驻菌，常驻菌是一群在健康皮肤上定居的微生物，暂驻菌是指通过接触外界环境而获得的一类微生物，包括金黄色葡萄球菌、溶血链球菌及肠球菌等，它们是引起皮肤感染的主要病原菌。大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生，皮肤微生物在皮肤免疫的成熟和稳态中发挥着重要作用。

皮肤微生物组与皮肤表面的细胞、汗液、皮脂等物质，以及外界环境共同组成一个生态系统，对于维持宿主皮肤健康有重要作用。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖；还可分解角质细胞碎屑或脂质，辅助乳化皮脂膜，维持表皮酸性环境，以抵御外界病原菌定殖。

皮肤微生物组在皮肤表面合成具有活性的代谢产物，如短链脂肪酸、B族维生素等，调节皮肤生理功能。越来越多的研究表明，皮肤微生态失衡(又称菌群失衡)会导致一系列皮肤疾病，如特应性皮炎、痤疮、脂溢性皮炎、银屑病、机会性感染等。当有益菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。

因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。

发明内容

为实现上述技术目的，本发明提供了一株杰丁毕赤酵母(Pichiajadini i)，命名为LABOFMIC-306，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221329。经实验表明，该杰丁毕赤酵母菌具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

本发明首要技术方案是提供了一株杰丁毕赤酵母(Pichiajadinii)，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221139，保藏于中国典型培养物保藏中心。

该杰丁毕赤酵母来源于中国山东省济南市趵突泉水中，具体是在距水面10-15cm的水层中取样获得的水中；水样采集后立即放在冰水浴中，置于暗箱保存。低温运回实验室后取适当量水样以低速离心去除杂质，取上清划线于麦芽汁琼脂固体平板，28℃恒温培养12～16h后，挑取乳白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-306。

革兰氏染色镜检：菌株LABOFMIC-306在显微镜下呈单细胞存在形式，在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成表面光滑无光泽、中央凸起的乳白色圆形菌落，质地均匀，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃。

经26S rDNA基因序列分析，测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-306菌株为杰丁毕赤酵母(Pichiaja dinii)。

在获得上述杰丁毕赤酵母之后，发明人进一步要求保护其在制备改善皮肤细胞状况的产品中的应用。所述改善皮肤状况包括促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老中的至少一种。

针对不同的用途，上所述促细胞增殖包括促进成纤维细胞增殖的作用。

上述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括FLG和OVOL1中的至少一种。

上述保湿包括上调保湿相关基因AQP3和/或GBA的表达。

上述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括LN、MKX、COL3A1和COL1A1中的至少一种；

和/或上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达；

和/或上调细胞自噬相关基因LC3B的表达；

和/或上调细胞抗氧化相关基因NRF2和SIRT-3的表达；

和/或上调免疫调节因子相关基因MOR的表达；

和/或上调细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF21、HGF的表达；

和/或下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因包括MMP家族中的至少一种；

和/或下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括Caspase家族的至少一种；

和/或抑制胶原蛋白酶活性。

发明人进一步提供了一种改善皮肤状况的产品，所述的产品为食品或药品或化妆品，无论哪种形式的产品，其有效成分包括以保藏编号为CCTCC NO:M20221329的杰丁毕赤酵母或其衍生物；

其中所述的杰丁毕赤酵母为活菌和/或灭活菌；所述的杰丁毕赤酵母衍生物包括其培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物；特别是其发酵产物或溶胞物。

所述的产品剂型包括但不限于膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种；产品为药品或化妆品时的使用方法包括涂抹、外敷、熏蒸或注射。

综上所述，本发明提供了一株杰丁毕赤酵母(Pichiajadinii)LABOFMI C-306。经实验表明，该杰丁毕赤酵母菌具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

保藏信息

保藏时间：2022年8月25日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:M 20221329；

保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学；

分类命名：杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306(PichiajadiniiLABOFMIC-306)。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成，采用的材料、培养基等均为普通市售品，均可市售购买得到。

下述实施例中杰丁毕赤酵母的LABOFMIC-306在具体的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为溶胞物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为发酵产物形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选自为发酵产物或溶胞物。

实施例1LABOFMIC-306的分离

发明人于中国山东省济南市趵突泉中采样，在距水面10-15cm的水层打开瓶塞取样，盖上盖子后再从水中取出，水样采集后立即放在冰水浴中，置于暗箱保存。低温运回实验室后取适当量水样以低速离心去除杂质，取上清划线于常规麦芽汁琼脂固体平板，28℃恒温培养12～16h后，挑取乳白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-306。

革兰氏染色镜检：菌株LABOFMIC-306在显微镜下呈单细胞存在形式，在麦芽汁琼脂平板上生长，可形成表面光滑无光泽、中央凸起的乳白色圆形菌落，质地均匀，边缘整齐；在麦芽汁液体培养基中呈均匀浑浊生长，最适生长温度28℃。

实施例2LABOFMIC-306的核酸鉴定

1、26S rDNA基因序列分析：

挑取单菌落置麦芽汁液体培养基中，28℃培养过夜后，12000转离心2min收集菌体，按照酵母基因组DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用酵母菌通用引物NL1,NL4，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃1min，52℃1min，72℃90s，36个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLAST N)后，得出LABOFMIC-306菌株为杰丁毕赤酵母(Pichiajadinii)。

实施例3LABOFMIC-306促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

1、LABOFMIC-306发酵产物和溶胞物的制备：

挑取杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306单菌落于常规麦芽汁液体培养基，28℃摇床培养16-18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，12000转离心2min使菌体分离沉淀,取出上清液以121℃，30min高压灭活，经0.22μm滤膜过滤为灭活发酵产物。

其离心沉淀菌体以PBS清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以PBS重悬至离心时体积，再以超声波破碎20分钟，121℃，30min高压灭活，即得溶胞物。

2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入发酵产物5％(V/V)，溶胞物10％(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测FLG和OVOL1基因的表达。分别以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306发酵产物和溶胞物均具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG和OVO样转录因子1基因OVOL1表达的作用，基因表达量上调1.41-2.09倍。表明LABOFMIC-306具有促进皮肤屏障修护的作用。

实施例4：LABOFMIC-306上调HaCaT保湿相关基因表达实验

1、LABOFMIC-306发酵产物和溶胞物的制备：

制备方法参照实施例3。

2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验

接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×10⁵细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入发酵产物5％(V/V)，溶胞物10％(V/V)(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测AQP3和GBA基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

结果见下表：

/>

体外细胞实验表明，本发明的杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306发酵产物和溶胞物具有上调保湿相关的水通道蛋白3基因AQP3和葡萄糖脑苷脂酶基因GBA表达的作用，基因表达量上调1.05-1.95倍。表明LABOFMIC-306具有促进皮肤保湿的作用。

实施例5：LABOFMIC-306调节光老化HaCaT细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因表达实验

1、LABOFMIC-306发酵产物及溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、LABOFMIC-306添加

将发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1，细胞自噬相关基因LC3B以及抗氧化相关基因NRF2的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵产物上调细胞外基质相关基因COL1A1和细胞自噬相关基因LC3B。结果见下表：

溶胞物上调细胞外基质基因COL1A1，细胞自噬相关基因LC3B和抗氧化相关基因NRF2。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306具有上调HaCaT细胞外基质相关的I型胶原α1链基因COL1A1和细胞自噬相关微管相关蛋白1轻链3β基因LC3B，以及抗氧化相关的核因子E2相关因子2基因NRF2表达的作用，基因相对表达倍数1.09-2.46。

实施例6：LABOFMIC-306促进人成纤维细胞HFF的增殖

1、LABOFMIC-306发酵产物及溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及LABOFMIC-306添加

接种以DMEM培养的HFF细胞，以100ul/孔(每孔含3×10⁴细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H₂O₂，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，PBS清洗两次，加入100μl新培养基，各孔分别添加发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)，(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

计算公式及结果如下表：

LABOFMIC-306促进HFF细胞增殖

体外细胞实验表明，本发明的杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率11.26％-19.05％。

实施例7：LABOFMIC-306调节氧化损伤HFF细胞外基质/抗氧化/免疫调节因子/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因表达实验

1、LABOFMIC-306发酵产物及溶胞物制备：

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、LABOFMIC-306添加

将发酵产物5％(V/V)、溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵产物/溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/免疫调节因子/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因LN、MKX和COL3A1，抗氧化相关基因SIRT-3，免疫调节因子相关基因MOR，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2，细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF21、HGF以及降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

发酵产物上调细胞外基质相关基因LN和MKX，免疫调节因子相关基因MOR,抑制细胞凋亡基因BCL-2,细胞生长因子相关基因FGF-1、FGF-2、FGF-21；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族，结果见下表：

溶胞物上调细胞外基质相关基因MKX和COL3A1，抗氧化相关基因SIRT-3，免疫调节因子相关基因MOR，抑制细胞凋亡基因BCL-2，细胞生长因子相关基因FGF2、FGF21、HGF。结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306具有上调HFF细胞外基质相关的层粘连蛋白LN、莫霍克蛋白基因MKX和Ⅲ型胶原蛋白α链基因COL3A1，抗氧化相关的Sirtuins蛋白家族基因SIRT-3，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR，抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2以及细胞生长因子相关成纤维细胞生长因子基因FGF1、FGF2、FGF21、肝细胞生长因子基因HGF表达的作用，基因相对表达倍数1.04-2.56倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，基因相对表达倍数0.38-0.77。

实施例8:LABOFMIC-306抑制胶原蛋白酶活性实验

1、LABOFMIC-306发酵产物制备：

制备方法参照实施例3。

2、胶原蛋白酶活性抑制率检测

将50μL 0.2％的明胶(胶原蛋白)溶液和50μL 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCL(含50mmol/L CaCl2)溶液混合，加入发酵产物25μL(对照组以等体积麦芽汁液体培养基替代发酵产物)，加入胶原蛋白酶液25μL在37℃反应0.5h。终止反应后以茚三酮显色在593nm下测定各组胶原蛋白酶活性，进而计算胶原蛋白酶抑制率。

胶原蛋白酶活性抑制率计算公式及结果见下表：

体外细胞实验表明，本发明的杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306具有抑制胶原蛋白酶活性的作用，抑制率16.15％-17.28％。

实施例9:杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306面霜制备实例

LABOFMIC-306溶胞物面霜的制备，组方如下表所示

制备工艺：按处方量分别准备油相(取凡士林、液体石蜡、十八醇加热熔化至80℃，保温)、水相(取20g水加入SDS，完全溶解后加入甘油、荷荷芭油和丁二醇；加入实施例3制备的LABOFMIC-306溶胞物及剩余43.5g水，搅拌均匀)，将油相缓慢加入水相中，边搅拌边加热，超声破碎仪中超声3min(超声8s、停顿4s)搅拌至50℃，停止搅拌，自然冷却既得。所得LABOFMIC-306溶胞物面霜涂抹后感觉水润清爽滋润。

实施例10:杰丁毕赤酵母LABOFMIC-306发酵产物口服冲剂制备实例

LABOFMIC-306发酵产物冲剂的制备，组方如下表所示

原料	质量比例(％)
		凡士林	8
十八醇	8
		液体石蜡	2
荷荷芭油	3
		丁二醇	2
甘油	3
		SDS	0.5
LABOFMIC-306溶胞物	10
		去离子水	63.5

原料	质量比例(％)
		LABOFMIC-306发酵粉	45
胶原蛋白粉	35
		橘子果汁粉	18.6
维生素C	1
		二氧化硅	0.4

制备工艺：取实施例3制备的LABOFMIC-306发酵产物，喷雾干燥后制成LABOFMIC-306发酵粉，加入胶原蛋白粉、维生素C、橘子果汁粉、二氧化硅，搅拌分散均匀即完成冲剂。所得LABOFMIC-306冲剂以水冲泡后味道酸甜，口味天然，可做为皮肤保养的口服饮品。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株杰丁毕赤酵母(Pichiajadinii)，其特征在于，命名为LABOFMIC-306，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221329。

2.权利要求1所述杰丁毕赤酵母在制备改善皮肤细胞状况的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况包括促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促细胞增殖包括促进成纤维细胞增殖的作用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括FLG和OVOL1中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保湿包括上调保湿相关基因AQP3和/或GBA的表达。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括LN、MKX、COL3A1和COL1A1中的至少一种；

和/或上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达；

和/或上调细胞自噬相关基因LC3B的表达；

和/或上调细胞抗氧化相关基因NRF2和SIRT-3的表达；

和/或上调免疫调节因子相关基因MOR的表达；

和/或上调细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、FGF21、HGF的表达；

和/或下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因包括MMP家族中的至少一种；

和/或下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括Caspase家族的至少一种；

和/或抑制胶原蛋白酶活性。

8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为食品或药品或化妆品。

9.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，其有效成分包括以保藏编号为CCTCC NO:M20221329的杰丁毕赤酵母或其衍生物。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述的杰丁毕赤酵母为活菌和/或灭活菌；所述的杰丁毕赤酵母衍生物包括其培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。