CN115851451A - 一种草地贪夜蛾微孢子及其应用和人工扩繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及草地贪夜蛾防治技术领域。本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子及其应用和人工扩繁方法，所述草地贪夜蛾微孢子保藏名称为NF‑CAU1，拉丁文为Nosema fruegiperda，保藏日期：2022年8月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45251。本发明的草地贪夜蛾微孢子能够高效侵染、致病草地贪夜蛾，并且便于人工大量扩繁，具有良好的推广效果。其侵染并致病半数四龄幼虫仅需575个孢子/头。四龄幼虫接种后，半数死亡剂量为7593个孢子/头，具有较高的毒力。接种后，每头被侵染虫子的产孢量显著高于接种量。
Description
技术领域
本发明涉及草地贪夜蛾防治技术领域，尤其涉及一种草地贪夜蛾微孢子及其应用和人工扩繁方法。
背景技术
草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）属于鳞翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，灰翅夜蛾属Spodoptera，是一种重大迁飞性农业害虫，最早从美洲发现，2016年入侵非洲中部和西部，2017年入侵亚洲多个国家。草地贪夜蛾具以下特征：一是食性杂，已知道可取食76科，353种植物。二是生殖力强，一只雌蛾平均可产卵1000~2000粒卵。三是迁飞速度快，每晚可迁飞100多公里。四是适应力强，可适应多种环境气候。
目前，对草地贪夜蛾主要还是以化学防治为主的综合防治策略，其中应急用药清单包括甲维盐、茚虫威、氯虫苯甲酰胺等11种化学农药，但是草地贪夜蛾抗药性问题不容忽视，定殖的草地贪夜蛾已经对有机磷、拟除虫菊酯等化学药剂产生很高的抗性，因此，除非是被严重为害的地块，否则不建议大量连续使用化学农药，除此之外，化学农药对自然环境和人畜健康存在一定风险。生物防治是最重要的绿色防控措施，大量研究表明生物防治措施对防控草地贪夜蛾是有效的，目前主要的生物防治资源包括天敌昆虫、白僵菌和绿僵菌以及核型多角体病毒等。
微孢子是一类胞内专性寄生真菌，目前报道的微孢子有超200属，1500多种，其中绝大多数微孢子以昆虫作为典型寄主。昆虫微孢子在自然界中普遍发生，是调控昆虫种群密度的重要因素之一。微孢子具有生活周期短，产孢力强，成熟孢子具有很强的抗逆性，能在寄主体外长时间存活，除了经口水平传播还能经卵垂直传播，微孢子对人畜天敌无害，且对环境友好，这些优点使微孢子作为生物防治资源具有广阔的前景。目前用微孢子防治草地贪夜蛾的报道很少，且国内还未有现相关的研究报道。因此，寻找一种对草地贪夜蛾具有防治作用的微孢子显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种草地贪夜蛾微孢子及其应用和人工扩繁方法，高效防治草地贪夜蛾。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子，所述草地贪夜蛾微孢子保藏名称为NF-CAU1，拉丁文为Nosema fruegiperda，保藏日期：2022年8月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45251。
本发明还提供了一种草地贪夜蛾微孢子的人工扩繁方法，包括如下步骤：
（1）将草地贪夜蛾微孢子液和饲料混合后饲喂草地贪夜蛾；
（2）饲喂的草地贪夜蛾死亡或羽化后将其加水研磨，过滤后得到孢子粗提液；
（3）将孢子粗提液一次离心，取上清液二次离心，弃上清液得到孢子沉淀；
（4）将孢子沉淀洗涤后和Percoll溶液混合，离心后弃上清，得到扩繁后的草地贪夜蛾微孢子。
作为优选，步骤（1）中所述混合时草地贪夜蛾微孢子液和饲料的比例为1微升：6~10立方毫米。
作为优选，步骤（1）中所述草地贪夜蛾为3龄草地贪夜蛾幼虫。
作为优选，步骤（2）中所述草地贪夜蛾和水的质量比为1头虫：1~2毫升水。
作为优选，步骤（2）中所述过滤时采用3~5层的纱布。
作为优选，步骤（3）中所述一次离心的转速为400~600r/min，一次离心的时间为40~80s；所述二次离心的转速为1800~2200r/min，二次离心的时间为4~6min。
作为优选，步骤（4）中所述离心的转速为9000~11000r/min，离心的时间为35~45min。
本发明还提供了所述的人工扩繁方法得到的草地贪夜蛾微孢子。
本发明还提供了所述的草地贪夜蛾微孢子在防治草地贪夜蛾中的应用。
本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子及其应用和人工扩繁方法，所述草地贪夜蛾微孢子保藏名称为NF-CAU1，拉丁文为Nosema fruegiperda，保藏日期：2022年8月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45251。本发明的草地贪夜蛾微孢子从野外诱集的鳞翅目昆虫成虫中分离得到，能够高效侵染、致病草地贪夜蛾，并且便于人工大量扩繁。其侵染并致病半数四龄幼虫仅需575个孢子/头。四龄幼虫接种后，半数死亡剂量为7593个孢子/头，具有较高的毒力。接种后，每头被侵染虫子的产孢量显著高于接种量，有利于微孢子的生产。因此，该微孢子能够用于草地贪夜蛾的生物防治，具有良好的推广效果。
保藏说明
草地贪夜蛾微孢子保藏名称为NF-CAU1，拉丁文为Nosema fruegiperda，保藏日期：2022年8月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.45251。
附图说明
图1为野外诱集鳞翅目成虫分离微孢子（400X）；
图2为室内人工扩繁后微孢子（400X）；
图3为基于SSUrRNA， Nosema frugiperda与其他微孢子的系统发育树；
图4为4龄幼虫接种不同剂量微孢子羽化率；
图5为接种不同剂量死亡草地贪夜蛾个体产孢量。
具体实施方式
本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子，所述草地贪夜蛾微孢子保藏名称为NF-CAU1，拉丁文为Nosema fruegiperda，保藏日期：2022年8月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45251。
本发明还提供了一种草地贪夜蛾微孢子的人工扩繁方法，包括如下步骤：
（1）将草地贪夜蛾微孢子液和饲料混合后饲喂草地贪夜蛾；
（2）饲喂的草地贪夜蛾死亡或羽化后将其加水研磨，过滤后得到孢子粗提液；
（3）将孢子粗提液一次离心，取上清液二次离心，弃上清液得到孢子沉淀；
（4）将孢子沉淀洗涤后和Percoll溶液混合，离心后弃上清，得到扩繁后的草地贪夜蛾微孢子。
在本发明中，步骤（1）中所述混合时草地贪夜蛾微孢子液和饲料的比例优选为1微升：6~10立方毫米，进一步优选为1微升：8立方毫米。
在本发明中，所述草地贪夜蛾微孢子液由草地贪夜蛾加水研磨得到，所述草地贪夜蛾和水的质量比优选为1头虫：1~2毫升水，进一步优选为1头虫：1.5毫升水。
在本发明中，步骤（1）中所述草地贪夜蛾优选为3龄草地贪夜蛾幼虫。
在本发明中，步骤（2）中所述草地贪夜蛾和水的质量比优选为1头虫：1~2毫升水，进一步优选为1头虫：1.5毫升水。
在本发明中，步骤（2）中所述过滤时优选采用3~5层的纱布。
在本发明中，步骤（2）中所述纱布优选为脱脂棉纱布，所述纱布的规格优选为：长和宽均为10cm的纱布中经纱和纬纱的数量独立的优选为100~120根，进一步优选为110根。
在本发明中，步骤（3）中所述一次离心的转速优选为400~600r/min，进一步优选为500r/min。
在本发明中，步骤（3）中所述一次离心的时间优选为40~80s，进一步优选为60s。
在本发明中，步骤（3）中所述二次离心的转速优选为1800~2200r/min，进一步优选为2000r/min。
在本发明中，步骤（3）中所述二次离心的时间优选为4~6min，进一步优选为5min。
在本发明中，步骤（4）中所述离心的转速优选为9000~11000r/min，进一步优选为10000r/min。
在本发明中，步骤（4）中所述离心的时间优选为35~45min，进一步优选为40min。
本发明还提供了所述的人工扩繁方法得到的草地贪夜蛾微孢子。
本发明还提供了所述的草地贪夜蛾微孢子在防治草地贪夜蛾中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 野外诱集鳞翅目成虫分离草地贪夜蛾微孢子
1.样品采集：
在广西壮族自治区南宁市郊区采集多种鳞翅目昆虫成虫，冷冻保存，用于显微镜检验是否存在微孢子。
2、镜检及微孢子大小测量
将存在微孢子的鳞翅目成虫按照1头虫：1毫升水的比例加入无菌水研磨，用四层纱布过滤得到粗提液，制成临时玻片，显微镜（400倍）下观察微孢子形态，并用OPT系统测量微孢子大小。
实施例2 草地贪夜蛾微孢子人工扩繁
取上述粗提液涂抹在饲料上饲喂3龄草地贪夜蛾幼虫，每天观察，收集死亡幼虫于4℃冷藏保存，等所有虫死亡（或羽化）后，将所有虫子集体研磨，四层纱布过滤后收获新鲜微孢子粗提液。将粗提液500r/min离心1分钟取上清以去掉大颗粒虫体杂质，2000r/min离心5分钟去上清，将沉淀用无菌水洗涤，重复3次，得到纯化的微孢子液。再将该微孢子悬液加入90%Percoll溶液，10000r/min离心40分钟，弃上清，将沉淀用无菌水洗涤3次，得到纯的微孢子悬液，4℃保存备用。
实施例3 草地贪夜蛾微孢子DNA提取及SSUrRNA基因系统发育树构建
取实施例2制备的微孢子悬液，使用植物基因组DNA提取试剂盒（Simgen），按照说明书提取微孢子DNA。使用18F：5’-CACCAGGTTGATTCTGCC-3’（SEQ ID NO.1）和1537R：5‘-TTATGATCCTGCTAATGGTTC-3’（SEQ ID NO.2）引物对其小亚基核糖体RNA（SSUrRNA）基因进行扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的条带经胶回收试剂盒回收纯化后，再利用pMDTM18-T Vector Cloning Kit 进行克隆，取阳性菌落的菌液送生工公司测序。以测序获得的微孢子SSUrRNA 序列与GenBank 上的Nosema、
Vairimorpha以及Paranosema属的微孢子序列进行比较分析，利用MEGAX软件构建系统发育树。
实施例4 生物测定
取实施例2制备的微孢子悬液将其配制成109，108，107，106，105孢子/毫升悬液，取4龄第一天草地贪夜蛾饥饿6小时后，每头幼虫分别取食含有5×106，5×105，5×104，5×103，5×102个孢子的2×2×2mm的饲料块，对照组只有干净的饲料，设置4个重复，每个重复24头幼虫。等幼虫取食完毕后再加入干净的饲料，每天观察是否有虫死亡，计算半数死亡剂量LD50和半数侵染剂量ID50，羽化率和产孢量。
结果：
1、形态特征
从野外诱集鳞翅目成虫中分离出的微孢子在光学显微镜下（400倍）呈卵圆形，具有折光性，平均大小为3.44±0.19×1.90±0.15 µm（平均值±标准差）（图1）。
2、分子特征
测序结果显示该株微孢子的SSUrRNA基因全长1232bp，其中CG含量33.9%，具体序列如SEQ ID NO.3所示。
将该序列与GenBank上的家蚕微孢子Nosema bombycis 的SSUrRNA序列进行对比，二者相似度达99.92%，与棉铃虫微孢子Nosema heliothidis相似度达99.84%，基于SSUrRNA序列，利用MEGA-X软件将该微孢子与已知的11株微孢子一起构建系统发育树，结果显示，该微孢子位于Nosema属类群中（图3），表明该微孢子为Nosema属，由于该微孢子能特异性侵染并致死草地贪夜蛾，将该微孢子命名为草地贪夜蛾微孢子Noseam frugiperda。
3、微孢子对草地贪夜蛾幼虫的致病力
测定了该微孢子对草地贪夜蛾幼虫所有阶段的总体侵染率，结果表明其侵染半数草地贪夜蛾的剂量（ID50）为575个孢子，侵染90%所需剂量（ID90）为50455个孢子。测定了4龄草地贪夜蛾接种后，在24天内该微孢子对草地贪夜蛾幼虫的毒力，其结果表明半数致死剂量（LD50）为7593个孢子，致死90%（LD90）宿主所需剂量为2.09×106个孢子。在接种5个浓度梯度下（5×106，5×105，5×104，5×103，5×102个），羽化率分别为0、2.1%、13.7%、36.8%、62.0%，对照组羽化率为74.0%（图4）。测定了在接种不同剂量后死亡个体的产孢量，结果显示平均产孢量分别为118.4×106，103.6×106，70.5×106，59.5×106，14.3×106个孢子（图5）（接种剂量分别为5×106，5×105，5×104，5×103，5×102个孢子）。
由以上实施例可知，本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子及其应用和人工扩繁方法，所述草地贪夜蛾微孢子保藏名称为NF-CAU1，拉丁文为Nosema fruegiperda，保藏日期：2022年8月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45251。本发明的草地贪夜蛾微孢子从野外诱集的鳞翅目昆虫成虫中分离得到，能够高效侵染、致病草地贪夜蛾，并且便于人工大量扩繁。其侵染并致病半数四龄幼虫仅需575个孢子/头。四龄幼虫接种后，半数死亡剂量为7593个孢子/头，具有较高的毒力。接种后，每头被侵染虫子的产孢量显著高于接种量，有利于微孢子的生产。因此，该微孢子能够用于草地贪夜蛾的生物防治，具有良好的推广效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种草地贪夜蛾微孢子，其特征在于，所述草地贪夜蛾微孢子保藏名称为NF-CAU1，拉丁文为Nosema fruegiperda，保藏日期：2022年8月3日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.45251。
2.一种草地贪夜蛾微孢子的人工扩繁方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将草地贪夜蛾微孢子液和饲料混合后饲喂草地贪夜蛾；
（2）饲喂的草地贪夜蛾死亡或羽化后将其加水研磨，过滤后得到孢子粗提液；
（3）将孢子粗提液一次离心，取上清液二次离心，弃上清液得到孢子沉淀；
（4）将孢子沉淀洗涤后和Percoll溶液混合，离心后弃上清，得到扩繁后的草地贪夜蛾微孢子。
3.根据权利要求2的人工扩繁方法，其特征在于，步骤（1）中所述混合时草地贪夜蛾微孢子液和饲料的用量比为1微升：6~10立方毫米。
4.根据权利要求3的人工扩繁方法，其特征在于，步骤（1）中所述草地贪夜蛾为3龄草地贪夜蛾幼虫。
5.根据权利要求4的人工扩繁方法，其特征在于，步骤（2）中所述草地贪夜蛾和水的比例为1头虫：1~2毫升水。
6.根据权利要求5的人工扩繁方法，其特征在于，步骤（2）中所述过滤时采用3~5层的纱布进行过滤。
7.根据权利要求6的人工扩繁方法，其特征在于，步骤（3）中所述一次离心的转速为400~600r/min，一次离心的时间为40~80s；所述二次离心的转速为1800~2200r/min，二次离心的时间为4~6min。
8.根据权利要求2~7任意一项的人工扩繁方法，其特征在于，步骤（4）中所述离心的转速为9000~11000r/min，离心的时间为35~45min。
9.权利要求2~8任意一项所述的人工扩繁方法得到的草地贪夜蛾微孢子。
10.权利要求1或9所述草地贪夜蛾微孢子在防治草地贪夜蛾中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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