CN115850351A - 一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶催化法合成α‑熊果苷的纯化方法，该方法包括以下步骤：1)将酶催化反应液过滤除去菌体，得到滤液；2)将滤液调至酸性，之后用大孔极性吸附树脂吸附滤液中的α‑熊果苷及对苯二酚，经洗脱、溶剂置换后，得到混合液；3)将混合液调至碱性，使对苯二酚反应生成对苯二酚盐，之后用DEΑE‑阴离子高分子聚合填料去除混合液中的对苯二酚盐，得到纯化后的α‑熊果苷液。与现有技术相比，本发明具有产物纯度高、无有机溶剂残留、生产过程中无污染排放的特点。

Description

一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法

技术领域

本发明属于α-熊果苷制备技术领域，涉及一种从酶催化法合成α-熊果苷的反应液中分离出高纯度α-熊果苷的纯化方法。

背景技术

熊果苷是一种氢醌苷类化合物，是酪氨酸酶的抑制剂，能阻断多巴及多巴醌的合成，从而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用。天然提取物中含的是β-熊果苷，但α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上，有效性和安全性高于β-熊果苷。然而，α-熊果苷化学合成比较难，易形成α-熊果苷和β-熊果苷的混合物，分离难度大。因此，越来越多的研究倾向于用微生物法或酶法合成α-熊果苷。

酶催化法合成α-熊果苷采用麦芽糖、对苯二酚做原料，在酶催化反应结束后会有少量的对苯二酚残余，而对苯二酚是一种已知的皮肤致敏物，禁用于护肤品中，因此，在α-熊果苷的分离纯化过程中若不能有效除去对苯二酚，会直接影响产品质量甚至导致产品不合格。

目前市场对对苯二酚残留量要求极高，需要小于10ppm或者未检出，但目前生产α-熊果苷的工艺在分离纯化过程中，基本都是先通过弱极性大孔吸附树脂去除色素分子，再通过强极性大孔吸附树脂吸附，使α-熊果苷和对苯二酚按极性不同进行分离，这种分离方法因α-熊果苷和对苯二酚极性差异不大，对苯二酚很难彻底去除干净，效率较低，很难应用于工业化生产。

公开号为CN103483401Α的中国发明专利公开了一种从α-熊果苷发酵液中分离对苯二酚的方法，其通过磷酸三丁酯进行多次萃取与反萃取，并需引入无机盐，因此该方法工艺复杂，且所使用的磷酸三丁酯对环境不友好。

发明内容

本发明的目的是针对现有纯化方法成本高、效率低，且效果不理想的问题，提供一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法。本发明利用大孔极性吸附树脂与DEΑE-阴离子高分子聚合填料进行两步操作，从酶催化法合成α-熊果苷的反应液中分离α-熊果苷，具有产物纯度高、无有机溶剂残留、生产过程中无污染排放的特点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，该方法包括以下步骤：

1)将酶催化反应液过滤除去菌体，得到滤液；

2)将滤液调至酸性，之后用大孔极性吸附树脂吸附滤液中的α-熊果苷及对苯二酚，经洗脱、溶剂置换后，得到混合液；

3)将混合液调至碱性，使对苯二酚反应生成对苯二酚盐，之后用DEΑE-阴离子高分子聚合填料去除混合液中的对苯二酚盐，得到纯化后的α-熊果苷液。

进一步地，步骤1)中，所述的酶催化反应液中含有菌体、麦芽糖、磷酸盐、α-熊果苷及对苯二酚。

进一步地，步骤1)中，将酶催化反应液通过中空纤维膜过滤，除去菌体。

进一步地，所述的中空纤维膜的截留分子量为6000-10000Dr。

进一步地，步骤2)中，用盐酸将滤液调至pH值为1-3。

进一步地，步骤2)中，用乙醇溶液进行洗脱；洗脱前，先用平衡液清洗大孔极性吸附树脂。

进一步地，溶剂置换过程为：先旋转蒸发去除乙醇，得到干粉，之后将干粉溶于水中。

进一步地，步骤3)中，将混合液调至pH值为9-10。

进一步地，步骤3)中，用氢氧化钠将混合液调至碱性。

进一步地，步骤3)中，纯化后的α-熊果苷液经低温冻干，得到α-熊果苷干粉。

与现有技术相比，本发明在分离纯化酶催化反应液中的α-熊果苷时，先通过中空纤维膜过滤除去菌体，之后用大孔极性吸附树脂吸附α-熊果苷及杂质对苯二酚，再用DEΑE-阴离子高分子聚合填料吸附去除对苯二酚，从而得到高纯度、不含有机溶剂的α-熊果苷液，经低温冻干可进一步得到得α-熊果苷干粉，具有产物纯度高、无有机溶剂残留、生产过程中无污染排放的特点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明提供了一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，包括以下步骤：

1)将酶催化反应液过滤除去菌体，得到滤液；

2)将滤液调至酸性，之后用大孔极性吸附树脂吸附滤液中的α-熊果苷及对苯二酚，经洗脱、溶剂置换后，得到混合液；

3)将混合液调至碱性，使对苯二酚反应生成对苯二酚盐，之后用DEΑE-阴离子高分子聚合填料去除混合液中的对苯二酚盐，得到纯化后的α-熊果苷液。

步骤1)中，酶催化反应液中含有菌体、麦芽糖、磷酸盐、α-熊果苷及对苯二酚。将酶催化反应液通过中空纤维膜过滤，除去菌体。中空纤维膜的截留分子量为6000-10000Dr。

步骤2)中，用盐酸将滤液调至pH值为1-3。用乙醇溶液进行洗脱；洗脱前，先用平衡液清洗大孔极性吸附树脂。溶剂置换过程为：先旋转蒸发去除乙醇，得到干粉，之后将干粉溶于水中。

步骤3)中，用氢氧化钠将混合液调至pH值为9-10。纯化后的α-熊果苷液经低温冻干，得到α-熊果苷干粉。

实施例：

一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，具体操作如下：

1)将酶催化反应液通过中空纤维膜过滤，除去菌体，得到滤液。

中空纤维膜过滤采用外压型纤维超滤膜柱，截留分子量为6000-10000Dr，下进液上流岀得滤液。

2)大孔极性吸附树脂分离。

分离目的：

大孔极性吸附树脂吸附滤液中的α-熊果苷及杂质对苯二酚，穿出麦芽糖和磷酸盐(此步不对α-熊果苷进行分离，目的是去除麦芽糖及磷酸盐，这种分离方式的作用是吸附α-熊果苷的同时，树脂在pH＝1-3时氢醌的保留强度增加，使进样流岀液中不含不能直接排放的对苯二酚，减少了污水处理费用。

分离过程：

大孔极性吸附树脂：Seplite.LX-lGE(西安蓝晓科技新材料股份有限公司生产)，颗粒度：0.1-0.6mm。

色谱柱尺寸：直径50mm×长度1000mm，柱体积：1.962L。

流动相：平衡液：纯净水用盐酸调pH至2.0；

洗脱液：30％(体积分数)乙醇溶液；

再生液：80％(体积分数)乙醇溶液。

取滤液5L，含α-熊果苷130g、对苯二酚4.8g，用盐酸调pH至2.0，以0.5BV/h的流速从柱尾由下至上进样，进样结束后用3倍柱体积的平衡液洗柱，再用2倍柱体积的洗脱液洗柱并收集α-熊果苷洗脱液。

用3倍柱体积的再生液洗柱，再用5倍柱体积的平衡液洗柱，即可再次进样分离。

检测结果：30％(体积分数)乙醇溶液洗脱收集体积：4L；

α-熊果苷：113.5g，收率87.3％；

对苯二酚：3.85g；

麦芽糖：未检出。

α-熊果苷洗脱液经旋转蒸发脱乙醇，得到的干粉用1L的纯净水溶解。

3)DEΑE-阴离子交换色谱层析。

分离原理：

对苯二酚的酚羟基具有弱酸性，可以失去一个或两个质子生成相应的酚盐负离子。旋蒸干粉加少量水溶解并调pH至弱碱性，对苯二酚反应生成带负电荷的酚盐，吸附在DEΑE-阴离子高分子聚合填料上，α-熊果苷与DEΑE-阴离子高分子聚合填料作用力小，基本不吸附而穿出柱体，从而实现与对苯二酚的分离。

分离过程：

层析填料：DEΑE-阴离子高分子聚合填料(上海渔霁生物技术有限公司生产)，颗粒度：50-80μm。

柱尺寸：直径40mm×长度500mm，柱体积：0.628L。

UV检测：280nm，分离流速：0.5BV/h。

分离样品检测：α-熊果苷：113.5g/L，对苯二酚：3.85g/L。

分离流动相：平衡液：纯净水；

再生液：80％(体积分数)乙醇溶液。

进样，以0.5BV/h流速进样1L体积，当UV基线升高时开始收集α-熊果苷流出液，进样结束用平衡液洗至UV基线下降，停止收集α-熊果苷。用5倍柱体积的再生液洗柱，再用5倍柱体积的平衡液洗柱，即可再次进样分离。

检测结果：α-熊果苷：109g，收率：96％，杂质对苯二酚未检出。

纯度：99.7％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)将酶催化反应液过滤除去菌体，得到滤液；

2)将滤液调至酸性，之后用大孔极性吸附树脂吸附滤液中的α-熊果苷及对苯二酚，经洗脱、溶剂置换后，得到混合液；

3)将混合液调至碱性，使对苯二酚反应生成对苯二酚盐，之后用DEΑE-阴离子高分子聚合填料去除混合液中的对苯二酚盐，得到纯化后的α-熊果苷液。

2.根据权利要求1所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述的酶催化反应液中含有菌体、麦芽糖、磷酸盐、α-熊果苷及对苯二酚。

3.根据权利要求1所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，将酶催化反应液通过中空纤维膜过滤，除去菌体。

4.根据权利要求3所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，所述的中空纤维膜的截留分子量为6000-10000Dr。

5.根据权利要求1所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，用盐酸将滤液调至pH值为1-3。

6.根据权利要求1所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，用乙醇溶液进行洗脱；洗脱前，先用平衡液清洗大孔极性吸附树脂。

7.根据权利要求6所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，溶剂置换过程为：先旋转蒸发去除乙醇，得到干粉，之后将干粉溶于水中。

8.根据权利要求1所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，步骤3)中，将混合液调至pH值为9-10。

9.根据权利要求1所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，步骤3)中，用氢氧化钠将混合液调至碱性。

10.根据权利要求1所述的一种酶催化法合成α-熊果苷的纯化方法，其特征在于，步骤3)中，纯化后的α-熊果苷液经低温冻干，得到α-熊果苷干粉。