CN115843784A - 一种car-nk细胞保存液及其制备方法、保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种CAR‑NK细胞保存液及其制备方法、保存方法，包括以下成分：无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮和人血清白蛋白；所述氨基酸为L‑谷氨酰胺、L‑亮氨酸、L‑苏氨酸、L‑门冬氨酸中的至少一种；所述维生素B为维生素B2和/或维生素B6。本发明制备获得的CAR‑NK细胞保存液，60h后CAR‑NK细胞活率均维持在91％以上，在150h后CAR‑NK细胞活率均维持在83％以上，本发明的CAR‑NK细胞保存液，可有效延长CAR‑NK细胞的保存时间，维持CAR‑NK细胞的活力，能够较好地保证CAR‑NK细胞体外保存情况下，对肿瘤细胞仍具有较好的杀伤功能表达。

Description

一种CAR-NK细胞保存液及其制备方法、保存方法
技术领域
本发明涉及细胞保存液技术领域，特别涉及一种CAR-NK细胞保存液及其制备方法、保存方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural kllr ell,NK cell)，是机体重要的免疫细胞，是人体非特异性免疫功能的一类颗粒淋巴细胞群，通过分泌多种细胞因子，起到杀伤靶细胞的作用。近年来，出现了NK细胞用于治疗多种肿瘤疾病的研究热点。
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy,CAR-T疗法)，是一种治疗肿瘤靶细胞的疗法，已有两种CAR-T产品用于临床治疗。CAR-T疗法的原材料为患者自体T细胞，经过激活、改造成CAR-T细胞，通过靶向识别体内肿瘤细胞，并释放更多的效应因子，达到针对性地杀灭肿瘤细胞，有效治疗恶性肿瘤。但CAR-T的制备过程较为繁琐，周期也较长，且可能会出现移植物抗宿主病等风险。鉴于CAR-T疗法的局限性，目前，研究人员致力于使用CAR-NK用于治疗难治性的肿瘤疾病。
在可提高CAR-NK细胞活性，维持其杀伤活性，并避免CAR-NK细胞的遗传变异或冷冻损伤等问题的细胞保存液中，进行有效保存CAR-NK细胞，是有效提高CAR-NK细胞用于细胞疗法的重要因素。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种CAR-NK细胞保存液及其制备方法、保存方法，可提高CAR-NK细胞活性，维持其杀伤活性，并避免CAR-NK细胞的遗传变异或冷冻损伤等问题，有效保存CAR-NK细胞，提高CAR-NK细胞用于治疗肿瘤疾病的细胞疗法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种CAR-NK细胞保存液，包括以下成分：无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮和人血清白蛋白；
所述氨基酸为L-谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-门冬氨酸中的至少一种；
所述维生素B为维生素B2和/或维生素B6；
无患子皂苷、桑黄酮可减轻CAR-NK细胞的损失程度，减少炎性细胞因子的产生，延长CAR-NK细胞的存活时间，并改善保护液组分的渗透，改善CAR-NK细胞的保护作用，提高CAR-NK细胞的活性。
进一步说明，包括以下成分：0.1-0.2mg/L无水葡萄糖、5-15mg/L氨基酸、5-8mg/L维生素B、10-18μmol/L辅酶Q10、30-50mg/mL无患子皂苷、50-70mg/L桑黄酮和0.4-0.8mg/L人血清白蛋白。
更进一步说明，包括以下成分：0.1-0.2mg/L无水葡萄糖、8-12mg/L氨基酸、6-7mg/L维生素B、10-12μmol/L辅酶Q10、40-45mg/mL无患子皂苷、50-55mg/L桑黄酮和0.4-0.6mg/L人血清白蛋白。
进一步说明，所述氨基酸为L-谷氨酰胺、L-亮氨酸和L-门冬氨酸的用量比为1：1-2：1-2；所述维生素B为维生素B2。
更进一步说明，还包括PGE2(前列腺素E2)和糖萜素；每1mL的CAR-NK细胞保存液中加入20-32μg所述PGE2和0.5-0.6μg所述糖萜素。
糖萜素具有抗菌、抗氧化和抗应激等功效，糖萜素的寡糖可为CAR-NK细胞提供主要能源物质，潜在刺激CAR-NK细胞的增长，有助于维持CAR-NK细胞的活力，延缓CAR-NK细胞的衰老凋亡机制。
本发明选用的无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮、人血清白蛋白、PGE2和糖萜素制备的CAR-NK细胞保存液，可有效避免CAR-NK细胞的遗传变异或冷冻损伤等问题，提高CAR-NK细胞的稳定性和活性。
进一步说明，一种CAR-NK细胞保存液的制备方法，包括如下制备步骤：将无水葡萄糖、氨基酸和维生素B溶解于注射水中，加入人血清白蛋白，混合，加入辅酶Q10、无患子皂苷和桑黄酮，混合，得CAR-NK细胞保存液。
进一步说明，所述细胞保存液的pH值为7.4-7.6，细胞保存液的渗透压为320-331mmol/L。
进一步说明，一种CAR-NK细胞的保存方法，将CAR-NK细胞与上述CAR-NK细胞保存液混合。
更进一步说明，所述CAR-NK细胞保存液中CAR-NK细胞的密度为(1-2)×106个/mL。
更进一步说明，所述混合24h后，每1mL的CAR-NK细胞保存液中加入20-32μg的PGE2和0.5-0.6μg的糖萜素。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明选用无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮和人血清白蛋白，科学配比，制备获得的CAR-NK细胞保存液，60h后CAR-NK细胞活率均维持在91％以上，在150h后CAR-NK细胞活率均维持在83％以上，本发明的CAR-NK细胞保存液，可有效延长CAR-NK细胞的保存时间，维持CAR-NK细胞的活力，同时，在CAR-NK细胞保存液后期混合24h加入PGE2和糖萜素，更有利于维持CAR-NK细胞的活力。
本发明制备的CAR-NK细胞保存液能够较好地保证CAR-NK细胞体外保存情况下，对肿瘤细胞仍具有较好的杀伤功能表达。本发明制备的CAR-NK细胞保存液，可提高CAR-NK细胞活性，维持其杀伤活性，并避免CAR-NK细胞的遗传变异或冷冻损伤等问题，有效保存CAR-NK细胞。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-一种CAR-NK细胞保存液
一种CAR-NK细胞保存液，配方如下表1所示：
表1CAR-NK细胞保存液配方
项目 单位 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4 试验组5
无水葡萄糖 mg/L 0.1 0.2 0.1 0.2 0.2
氨基酸 mg/L 8 15 5 12 12
维生素B mg/L 5 8 6 7 7
辅酶Q10 μmol/L 10 18 10 12 12
无患子皂苷 mg/L 30 50 40 45 45
桑黄酮 mg/L 50 70 50 55 55
人血清白蛋白 mg/L 0.4 0.8 0.4 0.6 0.6
PGE2 μg/mL 20 32 20 32 -
糖萜素 μg/mL 0.5 0.6 0.5 0.6 -
pH值 - 7.44 7.63 7.56 7.52 7.49
渗透压 mmol/L 321 331 328 324 323
其中，氨基酸：实施例1、实施例3和实施例5为用量比1：2：1的L-谷氨酰胺、L-亮氨酸和L-门冬氨酸；实施例2为用量比1：1：1的L-谷氨酰胺、L-亮氨酸和L-门冬氨酸；实施例4为用量比1：1的L-谷氨酰胺和L-苏氨酸。
维生素B：实施例2为维生素B6，其余为维生素B2。
按照上述配方将无水葡萄糖、氨基酸和维生素B溶解于注射水中，加入人血清白蛋白，混合，加入辅酶Q10、无患子皂苷和桑黄酮，混合，分别获得试验组1-5的CAR-NK细胞保存液，调整配方中的pH值，检测渗透压如配方表所示。
实施例2-CAR-NK细胞的保存方法
试验组1-4：PBS重悬CAR-NK细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，分别加入试验组1-4的CAR-NK细胞保存液，混合24h后，按照上述配方分别加入PGE2和糖萜素，混合，采用台盼蓝及计数仪检测CAR-NK细胞的活率。
试验组5：PBS重悬CAR-NK细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，加入试验组5的CAR-NK细胞保存液，混合，采用台盼蓝及计数仪检测CAR-NK细胞的活率。
对照组1：PBS重悬CAR-NK细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，加入对照组1的CAR-NK细胞保存液，混合，采用台盼蓝及计数仪检测CAR-NK细胞的活率，对照组1为根据试验组3的相同配方，将无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、人血清白蛋白、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮、PGE2和糖萜素一起混合，获得对照组1的CAR-NK细胞保存液，具体制备方法为：按照试验组3的配方，将无水葡萄糖、氨基酸和维生素B溶解于注射水中，加入人血清白蛋白，混合，加入辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮、PGE2和糖萜素，混合，调整pH值为7.52，检测渗透压为343mmol/L。
对比组1：PBS重悬CAR-NK细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，加入对比组1的CAR-NK细胞保存液，混合，采用台盼蓝及计数仪检测CAR-NK细胞的活率，对比组1为根据试验组3的相同配方，将无患子皂苷和桑黄酮替换为PGE2和糖萜素，具体制备方法为：按照试验组3的配方，将无水葡萄糖、氨基酸和维生素B溶解于注射水中，加入人血清白蛋白，混合，加入辅酶Q10、PGE2和糖萜素，混合，调整pH值为7.46，检测渗透压为318mmol/L。
表2CAR-NK细胞在不同时间的活率
项目 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4 试验组5 对照组1 对比组1
60h 92％ 91％ 96％ 95％ 93％ 88％ 80％
150h 84％ 83％ 89％ 85％ 83％ 76％ 66％
由上述结果表明，试验组1-5在60h后，CAR-NK细胞活率均维持在91％以上，在150h后CAR-NK细胞活率均维持在83％以上，表明本发明选用无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮和人血清白蛋白，科学配比，制备获得的CAR-NK细胞保存液，可有效延长CAR-NK细胞的保存时间，维持CAR-NK细胞的活力，同时，在CAR-NK细胞保存液后期混合24h加入PGE2和糖萜素，更有利于维持CAR-NK细胞的活力，但过早加入PGE2和糖萜素，CAR-NK细胞的活率有所降低，且下降速率较快。
糖萜素具有抗菌、抗氧化和抗应激等功效，糖萜素的寡糖可为CAR-NK细胞提供主要能源物质，潜在刺激CAR-NK细胞的增长，有助于维持CAR-NK细胞的活力，延缓CAR-NK细胞的衰老凋亡机制。无患子皂苷、桑黄酮可减轻CAR-NK细胞的损失程度，减少炎性细胞因子的产生，延长CAR-NK细胞的存活时间，并改善保护液组分的渗透，改善CAR-NK细胞的保护作用，提高CAR-NK细胞的活性。
实施例3-CAR-NK细胞的杀伤活性
选用肿瘤细胞株K562(培养至对数生长期)，作为靶细胞，按效靶比20：1和40：1调整细胞浓度，分别从CAR-NK细胞保存液中取保存60h和150h的CAR-NK细胞，将靶细胞和效应细胞混合，置于96孔培养板上培养，同时设靶细胞和效应细胞对照组，以及空白组，将96孔培养板板置于培养箱内，于37℃、5％CO2条件下培养24h，加入CCK8试剂10μL，于37℃、5％CO2条件下继续培养4h后，于450nm处测定OD值，计算公式：杀伤活性(％)＝[1-(A0-A1)/A2]×100％，A0为靶细胞和效应细胞OD值，A1为效应细胞OD值，A2为靶细胞OD值。
采用公开号CN113016782B的细胞保存液作为对照品，即，每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白5mL、复方电解质注射液90mL、复方氨基酸注射液(14AA-SF)5mL、L-谷氨酰胺0.01g、无水葡萄糖0.1g，调整CAR-NK细胞密度为1×106个/mL，加入对照品的细胞保存液中，分别从细胞保存液中取保存60h和150h的CAR-NK细胞，重复上述实验，计算CAR-NK细胞的杀伤活性。
表3CAR-NK细胞在不同时间的杀伤率
Figure BDA0004028667580000061
由上述结果表明，试验组3对肿瘤细胞株K562具有较好的杀伤活性，随着效靶比的提高，杀伤功能提高，同时，随着保存时间的延长，杀伤活性降低较少，本发明制备的CAR-NK细胞保存液能够较好地保证CAR-NK细胞体外保存情况下，对肿瘤细胞仍具有较好的杀伤功能表达。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CAR-NK细胞保存液，其特征在于，包括以下成分：无水葡萄糖、氨基酸、维生素B、辅酶Q10、无患子皂苷、桑黄酮和人血清白蛋白；
所述氨基酸为L-谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-门冬氨酸中的至少一种；
所述维生素B为维生素B2和/或维生素B6。
2.根据权利要求1的一种CAR-NK细胞保存液，其特征在于，包括以下成分：0.1-0.2mg/L无水葡萄糖、5-15mg/L氨基酸、5-8mg/L维生素B、10-18μmol/L辅酶Q10、30-50mg/mL无患子皂苷、50-70mg/L桑黄酮和0.4-0.8mg/L人血清白蛋白。
3.根据权利要求2的一种CAR-NK细胞保存液，其特征在于，包括以下成分：0.1-0.2mg/L无水葡萄糖、8-12mg/L氨基酸、6-7mg/L维生素B、10-12μmol/L辅酶Q10、40-45mg/mL无患子皂苷、50-55mg/L桑黄酮和0.4-0.6mg/L人血清白蛋白。
4.根据权利要求1的一种CAR-NK细胞保存液，其特征在于，所述氨基酸为L-谷氨酰胺、L-亮氨酸和L-门冬氨酸的用量比为1：1-2：1-2；所述维生素B为维生素B2。
5.根据权利要求1的一种CAR-NK细胞保存液，其特征在于，还包括PGE2和糖萜素；每1mL的CAR-NK细胞保存液中加入20-32μg所述PGE2和0.5-0.6μg所述糖萜素。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的一种CAR-NK细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：将无水葡萄糖、氨基酸和维生素B溶解于注射水中，加入人血清白蛋白，混合，加入辅酶Q10、无患子皂苷和桑黄酮，混合，得CAR-NK细胞保存液。
7.根据权利要求6的一种CAR-NK细胞保存液的制备方法，其特征在于，所述细胞保存液的pH值为7.4-7.6，细胞保存液的渗透压为320-331mmol/L。
8.一种CAR-NK细胞的保存方法，其特征在于，将CAR-NK细胞与权利要求1～5任意一项所述的CAR-NK细胞保存液混合。
9.根据权利要求8的一种CAR-NK细胞的保存方法，其特征在于，所述CAR-NK细胞保存液中CAR-NK细胞的密度为(1-2)×106个/mL。
10.根据权利要求8的一种CAR-NK细胞的保存方法，其特征在于，所述混合24h后，每1mL的CAR-NK细胞保存液中加入20-32μg的PGE2和0.5-0.6μg的糖萜素。
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