CN115838393B

CN115838393B - 用于fapi合成的中间体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115838393B
Application number: CN202310124318.XA
Authority: CN
Inventors: 吴晓明; 王相玉; 何田; 杨清宝; 成琳
Original assignee: Yantai Lannacheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yantai Lannacheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-02-16
Filing date: 2023-02-16
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2043-02-16
Also published as: CN115838393A

Abstract

本发明提供用于伊文思蓝修饰的FAPI合成的中间体，其结构如式I。本发明还提供制备该中间体的方法，包括(S)‑N‑(2‑(2‑氰基吡咯烷‑1‑基)‑2‑氧代乙基)‑6‑(3‑(哌嗪‑1‑基)丙氧基)喹啉‑4‑甲酰胺与丁二酸酐反应的产物与叔丁基(S)‑(6‑氨基‑1‑((4'‑氨基‑3,3'‑二甲基‑[1,1'‑联苯]‑4‑基)氨基)‑1‑氧代己‑2‑基)氨基甲酸酯偶联反应，反应后产物脱保护，再经取代反应，得到的化合物经水解反应得到式I结构的中间体。本发明还提供该中间体在合成伊文思蓝修饰的FAPI中的应用。用本发明中间体合成伊文思蓝修饰的FAPI可提高生产效率，降低生产成本，适合工业化生产。

I。

Description

用于FAPI合成的中间体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物合成领域，具体涉及用于伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）合成的中间体及其制备方法，以及该中间体在合成LNC1004中的应用。

背景技术

以成纤维细胞活化蛋白（FAP）为靶点的分子成像放射性示踪剂在肿瘤诊断中显示出了良好的临床前和临床结果。LNC1004作为一种新开发的伊文思蓝修饰的成纤维细胞活化蛋白抑制剂（伊文思蓝修饰的FAPI），其化学名为2,2',2''-(10-(2-(((S)-1-((4'-((E)-(8-氨基-1-羟基-5,7-二磺萘-2)-基)二氮烯基)-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯基]-4-基)氨基)-6-(4-(4-(3-((4-((2-((S)-2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氧)丙基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酰胺)-1-氧代己基-2-基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三氟乙酸盐。现有技术对LNC1004进行¹⁷⁷Lu标记后用于肿瘤靶向治疗，发现伊文思蓝片段的加入可以延长循环半衰期来改善药代动力学（PK），从而增加肿瘤摄取并提高放射治疗效果。因此放射性标记的LNC1004可作为一种新型的长效癌症治疗药物。

现有技术中，文献Evans blue-modified radiolabeled fibroblast activationprotein inhibitor as long-acting cancer therapeutics, Theranostics 2022; 12(1): 422-433报道了用于合成LNC1004的以下合成路线：

。

此路线主要有以下缺点：

1）将带磺酸基的伊文思蓝片段作为起始物料合成该伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004），使整条合成路线中涉及的中间体极性增大，难以利用传统的后处理手段（如萃取、柱层析等）进行分离纯化，而采用制备液相纯化增大分离难度，且效率低，不宜工业化生产。

2）采用DOTA-NHS进行最终片段的偶联，DOTA-NHS本身结构不稳定，高温下易分解、开环，导致副反应较多，收率低，且DOTA-NHS本身价格昂贵，导致总体成本较高。

因此，为了有利于LNC1004的工业化放大生产，有必要改进其合成方法。

发明内容

鉴于上述技术背景，本发明所要解决的技术问题是如何提高LNC1004合成的收率、降低成本，使其更适合工业化放大生产。

本发明的首要目的在于：提供一种新的化合物，作为关键中间体用于合成伊文思蓝修饰的FAPI，通过该关键中间体合成伊文思蓝修饰的FAPI不仅可以降低生产成本，而且可显著提高生产效率和收率，适合大规模的工业化生产。

本发明的第二个目的在于：提供制备所述关键中间体的方法。

本发明的再一个目的在于：提供利用所述关键中间体合成伊文思蓝修饰的FAPI的方法，即所述关键中间体在合成伊文思蓝修饰的FAPI中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供用于伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）合成的中间体，结构如式I所示：

I。

第二方面，本发明提供制备本发明所述中间体的方法，包括如下步骤：

a) (S)-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺（化合物II）与丁二酸酐发生反应得到化合物III；

b)化合物III与叔丁基(S)-(6-氨基-1-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酸酯（化合物IV）经偶联反应及处理后得到化合物V；

c)所述化合物V经脱保护反应得到化合物VI，然后经过取代反应及处理后得到化合物VII；

d)所述化合物VII经水解反应及处理后得到式I结构的所述中间体；

具体的反应式如下：

。

本发明优选的方案中，所述的步骤b)具体为：在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入步骤a)得到的化合物III与叔丁基(S)-(6-氨基-1-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酸酯（化合物IV），然后加入一种缩合剂和一种有机碱，在20~45℃下搅拌反应1~8小时，经处理后得到化合物V。

本发明更优选的方案中，步骤b)所述缩合剂为HATU、HBTU、TBTU、TSTU、PyAOP、PyBOP中的任意一种，最优选HATU；步骤b)所述的有机碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺中的任意一种，最优选N,N-二异丙基乙胺。

本发明优选的方案中，所述的步骤c)具体为：在有机溶剂中，加入步骤b)得到的所述化合物V，而后加入一种有机酸，在20~45℃下搅拌反应1~8小时得到化合物VI，然后加入过量的有机碱，再加入2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（DOTA-TRIS-TBU-ESTERNHS），在15~45℃下搅拌反应1~8小时，经处理后得到化合物VII。

本发明更优选的方案中，步骤c)所述有机溶剂为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或它们两者的混合物中的任意一种，最优选N,N-二甲基甲酰胺；步骤c)所述的有机酸为三氟乙酸、对甲苯磺酸中的任意一种，最优选三氟乙酸；步骤c)所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺中的任意一种，最优选N,N-二异丙基乙胺。

本发明优选的方案中，所述的步骤d)具体为：在有机溶剂中，加入步骤c)得到的所述化合物VII，而后加入一种有机酸，在20~45℃下搅拌反应1~8小时，经处理后得到式I结构的中间体。

本发明更优选的方案中，步骤d)所述有机溶剂为二氯甲烷或乙腈。

本发明更优选的方案中，步骤d)所述有机酸为三氟乙酸、对甲苯磺酸中的任意一种，最优选三氟乙酸。

第三方面，本发明提供利用所述中间体合成伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）的方法，即所述中间体在合成伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）中的应用，包括如下步骤：将结构如式I的所述中间体溶于水，于搅拌条件下在-5~25℃下依次加入盐酸溶液、亚硝酸钠，反应生成重氮盐溶液，然后将1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠混合发生酸碱中和反应生成1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠水溶液，在-5~25℃搅拌下，将所述重氮盐溶液滴入所述1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠水溶液中，反应1~8小时，经后处理得伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）；

具体的反应式如下：

。

本发明优选的方案中，所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L~6mol/L，更优选1~3mol/L；盐酸所用当量（与所述中间体的摩尔比）为1.0~3.0，更优选1.5~2.0；亚硝酸钠所用当量（与所述中间体的摩尔比）为1.0~3.0，更优选1.0~1.5；1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐所用当量（与所述中间体的摩尔比）为1.0~3.0，更优选1.0~1.5；碳酸氢钠所用当量（与所述中间体的摩尔比）为5.0~10.0，更优选8.0~10.0。

本发明所述的合成伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）的方法以合成本发明所述的中间体（式I化合物）为前提，并最终由该中间体与1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐偶联得到LNC1004。与现有的合成方法相比，本发明整体合成方法的区别主要在于：将与1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐的反应放在最后的步骤；引入DOTA基团时采用先偶联带羧基保护的DOTA基团再脱保护的方式。基于上述区别，本发明的优点在于：

1）将1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐与所述中间体的偶联放在合成的最后一步，相比现有合成方法降低了反应中间体的极性，使合成路线中得到所述中间体之前所制备的化合物均可以使用萃取、柱层析等后处理手段进行分离纯化，由此明显提高了整个合成过程的生产效率和收率，适合大规模的工业化生产。

2）引入DOTA基团时采用先偶联带羧基保护的DOTA基团再脱保护的方式，即采用2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（DOTA-TRIS-TBU-ESTER NHS）代替DOTA-NHS参与反应，后续脱掉叔丁酯，可以使合成过程更高效、收率更高、成本更低。首先，由于2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（DOTA-TRIS-TBU-ESTER NHS）化学性质较DOTA-NHS稳定，在反应中本身结构不易被破坏，所以本发明副反应少，单步反应收率更高；第二，由于2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（DOTA-TRIS-TBU-ESTER NHS）极性较DOTA-NHS小，所以在反应得到相应化合物（VII）后，仍可通过柱层析进行分离纯化，适合工业化生产；第三，由于2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（DOTA-TRIS-TBU-ESTER NHS）（约1500元/g）的市场价格较DOTA-NHS（约10000元/g）更低，所以本发明选择2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（DOTA-TRIS-TBU-ESTER NHS）代替DOTA-NHS可大大降低生产成本。

附图说明

图1是实施例1所述的化合物III的质谱图。

图2是实施例1所述的化合物V的质谱图。

图3是实施例1所述的化合物VII的质谱图。

图4是实施例1所述的式I中间体的质谱图。

图5是实施例2所述伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）的质谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：式I所示中间体的制备

取(S)-N-(2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)-6-(3-(哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-4-甲酰胺（化合物II）10.06g加入70ml二氯甲烷溶解，然后依次向其中加入16.9ml的DIPEA、丁二酸酐2.81g，在室温下搅拌反应2小时，通过柱层析纯化得到化合物III 7.32g，收率59.54%，理论[M-H]^-=549.25，实测[M-H]^-=549.24826。其结构表征谱图见图1。

化合物V的制备

在70ml的N,N-二甲基甲酰胺中，依次加入化合物III 7.20g、(S)-(6-氨基-1-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酸酯（化合物IV）5.83g、HATU 6.12g、DIPEA 2.66g，室温下搅拌反应2小时，通过柱层析纯化得到化合物V11.66g，收率91.30%，理论[M+H]⁺=973.53，实测[M+H]⁺=973.52750。其结构表征谱图见图2。

化合物VII的制备

在200ml的N,N-二甲基甲酰胺中，加入化合物V 11.50g，而后加入三氟乙酸77.86ml，在40~45℃下搅拌反应1小时得到化合物VI，然后加入N,N-二异丙基乙胺234ml，再加入2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯（DOTA-TRIS-TBU-ESTER NHS）7.5g，在室温下搅拌反应6小时，将反应液旋干后加200ml二氯甲烷溶解，有机相水洗2次，无水硫酸钠干燥有机相，然后将有机相旋干经过柱层析纯化得到化合物VII 20.85g，收率123.51%（含无机盐），理论[M+H]⁺=1427.85，实测[M+H]⁺=1427.84403。其结构表征谱图见图3。

式I中间体的制备

取化合物VII 20.5g，加入350ml二氯甲烷和350ml三氟乙酸，在40~45℃下搅拌反应1小时后将反应液滴加到3.5L甲基叔丁基醚中搅拌析出固体，过滤后经过制备液相纯化得到式I结构的中间体10.36g，收率56.30%，理论[M+H]⁺=1259.66，([M+2H]/2)⁺=630.33，实测([M+2H]/2)⁺=630.33554。其结构表征谱图见图4。

本实施例的反应式如下：

。

实施例2：伊文思蓝修饰的FAPI（LNC1004）的制备

将实施例1制备的所述中间体（化合物I）10.3g溶于135ml水中，搅拌下在0~10℃下依次加入8.7ml的2mol/L的盐酸溶液和0.618g的亚硝酸钠，反应生成重氮盐溶液，然后将碳酸氢钠6.9g溶于135ml水中，再加入1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐3.1g，发生酸碱中和反应生成1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠水溶液，在0~10℃搅拌下，将所述重氮盐溶液滴入所述1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠水溶液中，反应1小时后将反应液旋干，经制备液相纯化得到伊文思蓝修饰的可被放射性标记的成纤维细胞活化蛋白抑制剂（LNC1004）7.01g，收率53.91%，理论([M+2H]/2)⁺=795.31，实测 ([M+2H]/2)⁺=795.30666。其结构表征谱图见图5。

本实施例的反应式如下：

。

对比实施例1：

化合物2的合成：

在50ml烧瓶中分别投入叔丁基(4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基甲酸酯（化合物1）(0.31g，1.0mmol)和4ml的乙腈，冰浴，将2M的盐酸1.5ml滴加进反应瓶中，反应15min，再将亚硝酸钠(0.068g，1.0mmol)溶解在2ml水中，再次滴加进反应瓶中，反应半个小时，作为A液待用。另外准备一个50ml的反应烧瓶，加入1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐(0.33g，1.0mmol)、碳酸钠(0.105g，1.0mmol)以及5ml水组成B液，冰浴，将A液缓慢滴加入B液，冰浴搅拌反应2h。经制备液相纯化，冷冻干燥得到纯的化合物2，产率47％。

化合物3的合成：

在冰浴条件下，将化合物2(0.52g,1.0mmol)溶解在三氟乙酸中，将体系升温到室温反应2h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将粗产物经制备液相纯化，冷冻干燥得到纯的化合物3，产率73％。

化合物4的合成：

在100ml烧瓶中分别投入化合物3(0.54g，1.0mmol)、Boc-Lys(Fmoc)-OH(0.47g,1.0mmol)、HATU(0.38g,1.0mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.26g,2.0mmol)以及10ml的N,N-二甲基甲酰胺。反应混合物搅拌至反应结束，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物。将粗产物经制备液相纯化，冷冻干燥得到纯的化合物4，产率47％。

化合物5的制备：

将化合物4使用哌啶（20%[v/v]）在室温下对Fmoc进行脱保护。将反应混合物搅拌1小时，然后在高真空下除去DMF。残余物经制备液相纯化。分离产率为67%。将琥珀酸酐（500mg，5mmol）溶于5ml的DMF中，然后加入到脱去Fmoc保护的化合物4中间体（0.5mmol，375mg）中，然后再加入10mmol DIPEA。将混合物在室温下搅拌12小时，直到完全转化为化合物5。然后，在高真空下除去DMF。将残余物经制备液相纯化（278 mg，64%产率）。

化合物8的制备：

将(S)-4-(3-((4-((2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯（化合物6）（110mg，0.2mmol）和4-甲基苯磺酸一水合物（380mg，2mmol）溶于10ml乙腈中。将反应物在45℃下振荡过夜，得到化合物7。旋蒸除去乙腈并将残余物溶于DMF中。然后，加入化合物5（174 mg，0.2 mmol）、N,N-二异丙基乙胺和（129mg，1 mmol）和HATU（76 mg，0.2mmol）。将反应混合物在室温下搅拌6小时，得到化合物8。在高真空下除去DMF，将残余物制备液相纯化（210 mg，81%产率）。

LNC1004的制备：

室温下，用10%TFA在DCM（v/v）中除去化合物8（26 mg，0.02 mmol）的BOC基团1小时。然后，通过氩气流除去TFA和DCM后，将残余物与1.2当量DOTA-NHS酯和8当量DIPEA在DMF中反应。在室温下搅拌2-3小时后，经制备液相纯化反应混合物，得到所需产物（23mg，73%产率）。

其反应式如下：

。

将本发明实施例1、2与对比实施例1相比可知，对比实施例1经过7步反应合成LNC1004，每步反应后处理均需制备液相纯化，其总收率为：4.09%。而本发明实施例1和2整体合成路线经过6步反应合成LNC1004，其中仅后两步需要制备液相纯化，其总收率为20.38%。可见本发明的合成方法能够显著提高LNC1004的收率。

Claims

1.用于伊文思蓝修饰的FAPI合成的中间体，其特征在于，结构如式I所示：

I。

2.制备权利要求1所述中间体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

b)化合物III与化合物IV叔丁基(S)-(6-氨基-1-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酸酯经偶联反应及处理后得到化合物V；

具体的反应式如下：

。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的b)具体为：在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入a)得到的化合物III与叔丁基(S)-(6-氨基-1-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-联苯]-4-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酸酯，然后加入缩合剂和有机碱，在20~45℃下搅拌反应1~8小时，经处理后得到化合物V；所述缩合剂为HATU、HBTU、TBTU、TSTU、PyAOP、PyBOP中的任意一种；所述的有机碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺中的任意一种。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述缩合剂为HATU。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的有机碱为N,N-二异丙基乙胺。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的c)具体为：在有机溶剂中，加入b)得到的所述化合物V，而后加入有机酸，在20~45℃下搅拌反应1~8小时得到化合物VI，然后加入过量的有机碱，再加入2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯，在15~45℃下搅拌反应1~8小时，经处理后得到化合物VII；所述有机溶剂为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或它们两者的混合物中的任意一种；所述的有机酸为三氟乙酸、对甲苯磺酸中的任意一种；所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺中的任意一种。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的有机酸为三氟乙酸。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的d)具体为：在有机溶剂中，加入c)得到的所述化合物VII，而后加入有机酸，在20~45℃下搅拌反应1~8小时，经处理后得到式I结构的中间体；所述的有机溶剂为二氯甲烷或乙腈；所述有机酸为三氟乙酸、对甲苯磺酸中的任意一种。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述有机酸为三氟乙酸。

12.权利要求1所述中间体在合成伊文思蓝修饰的FAPI中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将结构如式I的所述中间体溶于水，于搅拌条件下在-5~25℃下依次加入盐酸溶液、亚硝酸钠，反应生成重氮盐溶液，然后将1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠混合发生酸碱中和反应生成1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠水溶液，在-5~25℃搅拌下，将所述重氮盐溶液滴入所述1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐和碳酸氢钠水溶液中，反应1~8小时，经后处理得伊文思蓝修饰的FAPI；具体的反应式如下：

。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L~6mol/L。

14. 如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述盐酸溶液的摩尔浓度为1~3 mol/L。

15.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述盐酸溶液加入后盐酸与所述中间体的摩尔比为1.0~3.0。

16.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述盐酸溶液加入后盐酸与所述中间体的摩尔比为1.5~2.0。

17.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述亚硝酸钠与所述中间体的摩尔比为1.0~3.0。

18.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述亚硝酸钠与所述中间体的摩尔比为1.0~1.5。

19.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐与所述中间体的摩尔比为1.0~3.0。

20.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐与所述中间体的摩尔比为1.0~1.5。

21.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述碳酸氢钠与所述中间体的摩尔比为5.0~10.0。

22.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述碳酸氢钠与所述中间体的摩尔比为8.0~10.0。