CN115837081A - 一种环状rna分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，所述环状RNA分子为circTXNIP，其水牛源序列如SEQ ID NO:1所示，过表达circTXNIP促进circTXNIP编码肽生成，进而成肌细胞的增殖与分化随之增加；所述circTXNIP与脂质体形成circTXNIP核酸复合物作为制备治疗肌肉损伤的药物的组分。本发明提供的circTXNIP翻译后产生的circTXNIP编码肽能促进肌肉损伤后的修复，因此circTXNIP有望开发作为核酸类药物用于制备治疗肌肉损伤的药物，可通过局部肌肉注射应用于治疗肌肉损伤。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用。
背景技术
骨骼肌是一种生命体不可或缺的组织，在运动、新陈代谢和体内稳态中起至关重要的作用。骨骼肌发育大致可分为胚胎发育和出生后发育两个阶段，在胚胎时期肌纤维数目快速增加，出生后肌纤维总数目虽基本保持不变，但肌纤维的直径会持续增加以达到合适的肌肉体积。这个持续性的过程离不开成肌细胞的增殖与分化。
这些过程除了受基因、信号通路、转录因子及miRNA等调控，还受到circRNA的复杂调控。CircRNA是一种由线性RNA转录通过可变剪接将3'和5'端通过共价键相连而形成的一种环状内源性RNA，不容易被核酸外切酶降解，与线性RNA相比结构更稳定。研究表明circRNA是各种生理病理过程中基因表达的关键调节因子，在调节人类和动物肌肉发育及其相关生理病理过程中发挥着独特的作用。由于缺乏翻译所需的5'帽和poly(A)尾，人们过去普遍认为circRNA在本质上是非编码的环状RNA，但近年来有研究发现，带有IRES(Internal ribosome entry site)序列的circRNA翻译产生了多肽。人工circRNA在体外翻译系统中可有效翻译，以独立于5'帽结构的方式编码功能肽。此外有报道带有N6-甲基腺苷(m6A)修饰的circRNA的翻译，该修饰可以替代IRES用于翻译起始。研究CircZNF609是最早报道的含有IRES的circRNA之一，并翻译成一种蛋白在肌肉细胞中调节其向肌肉分化的过程。环状RNA CircFAM188B编码一种调节鸡骨骼肌卫星细胞增殖和分化的蛋白质，这些研究结果显示circRNA可通过编码多肽调控肌肉生成过程。
目前肌肉损伤主要依靠机体自身启动修复机制，临床上肌肉拉伤主要是休息静养，局部理疗为主，一般先冷敷，24小时后在局部热敷后使用活血化瘀的药物，比如氟比洛芬巴布膏、云南白药气雾剂和肿痛气雾剂喷雾等。也可选择口服活血化瘀类的中成药，比如活血止痛胶囊、三七粉或者三七胶囊、虎力散胶囊等。如果局部肿胀特别严重，可以使用消肿脱水的药物，比如静脉输入甘露醇。如果同时对神经造成损伤，需要口服营养神经的药物，比如甲钴胺或者维生素B1。损伤后会引起明显疼痛，需要根据疼痛程度选用非甾体抗炎镇痛药物，如果是轻度疼痛，可以选择塞来昔布胶囊进行止痛，如果是中度的疼痛，可以选择布洛芬缓释胶囊，如果损伤比较严重，出现重度的疼痛，选择曲马多缓释片。不严重的肌肉损伤，二周左右可以恢复，严重的肌肉损伤则需要较长时间才能逐渐恢复。
这些药物对肌肉损伤的作用各不相同，肌肉损伤后淤血与肌肉组织碎片将引起机体炎症免疫反应，消炎镇痛类药物能有效减少炎症免疫反应程度，减少患者痛苦，但会延长肌肉修复时间。甲钴胺等营养神经的药物能有效帮助肌肉内神经细胞重塑，促进肌肉再生，却无法直接促进肌肉再生。可见目前临床采用的药物并没有直接促进肌肉组织再生的功能，治疗药物主要以减轻患者痛苦，提供营养等辅助功效为代表，主要依靠人体肌肉的自我再生启动修复功能。
核酸类药物能直接促进肌肉细胞增殖分化，促进肌肉组织再生，但是目前尚无直接治疗受损肌肉的核酸类药物的报道。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用。本发明提供的circTXNIP分子能作为核酸类药物，通过肌肉局部注射的方式给药，起效迅速且代谢较快，安全性高。circTXNIP分子进入肌肉组织内能翻译为circTXNIP编码肽，直接促进肌肉细胞增殖分化，促进肌肉组织再生。
本发明公开一种环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，所述环状RNA分子为circTXNIP，其水牛源序列如SEQ ID NO:1所示，过表达circTXNIP促进circTXNIP编码肽生成，进而成肌细胞的增殖与分化随之增加。
进一步，所述circTXNIP与脂质体形成circTXNIP核酸复合物作为制备治疗肌肉损伤的药物的组分。
进一步，所述circTXNIP核酸复合物作为制备治疗肌肉损伤的药物的组分时，每公斤受损肌肉用量为300-1000μg。
进一步，所述治疗肌肉损伤的药物是注射剂。
本发明所述制备治疗肌肉损伤的药物，是在肌肉受损部位局部注射。
进一步，用于线性表达所述circTXNIP编码肽的小鼠源DNA序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步，用于线性表达所述circTXNIP编码肽的人源DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
与现有技术相比，本发明在应用中具备以下有益效果：
1、TXNIP基因编码硫氧还蛋白结合蛋白，是与硫氧还蛋白(TRX)结合的互作蛋白。硫氧还蛋白结合蛋白通过抑制硫氧还蛋白功能而介导氧化应激、诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖等生物学调控作用。circTXNIP由TXNIP基因转录本经剪切环化产生，因此circTXNIP编码肽对成肌细胞的增殖分化起到重要调控功能。本发明提供的circTXNIP翻译后产生的编码多肽简写为circTXNIP-peptide，即circTXNIP编码肽，circTXNIP编码肽能促进肌肉损伤后的修复，因此circTXNIP有望开发作为核酸类药物用于制备治疗肌肉损伤的药物，可通过局部肌肉注射应用于治疗肌肉损伤。
2、本发明采用将circTXNIP核酸复合物开发为注射剂的形式对产生肌肉损伤的局部肌肉进行注射给药，该circTXNIP核酸复合物在肌肉内能翻译形成circTXNIP编码肽，随后通过circTXNIP编码肽显著促进肌纤维修复。相比于目前临床肌肉损伤用药(如：消炎镇痛类药物能有效减少炎症免疫反应程度，减少患者痛苦，但会延长肌肉修复时间；甲钴胺等营养神经的药物能有效帮助肌肉内神经细胞重塑，但无法直接促进肌肉再生)，circTXNIP核酸复合物能直接有效促进受损肌肉修复，填补了肌肉损伤治疗的空白。
3、circTXNIP核酸复合物修复肌肉的优势在于与传统药物依赖自身启动缓慢的修复机制不同，circTXNIP编码的circTXNIP编码肽能直接促进成肌细胞增殖与分化，通过试验在损伤的肌肉处注射circTXNIP核酸复合物后，与对照组相比表现为损伤肌纤维更快启动修复，原本依靠肌肉正常再生需要14天以上，注射了circTXNIP核酸复合物7天后，损伤部位周围炎性细胞浸润较对照组显著减少，说明肌肉修复过程显著加快，且肌纤维完整性好于对照组。具体表现为肌束间距减少，肌纤维横截面形态规则，边缘清晰结构完整，这些现象都表明肌肉处于良好的修复过程。其次分子检测相关基因表达也证明，circTXNIP核酸复合物显著促进了肌肉再生相关基因表达。这样直接促进肌肉修复的功能，是目前临床用药所尚不具备的。
附图说明
图1为成肌细胞与肌肉组织circTXNIP编码肽表达检测结果示意图；
图2为成肌细胞中过表达circTXNIP效率检测；
图3为成肌细胞中干扰circTXNIP效率检测；
图4为过表达circTXNIP后EdU检测细胞增殖；
图5为干扰circTXNIP后CCK8检测细胞增殖；
图6为流式分析过表达circTXNIP水牛成肌细胞周期变化；
图7为过表达circTXNIP后水牛成肌细胞增殖标志基因表达检测；
图8为干扰circTXNIP水牛成肌细胞增殖基因qPCR检测；
图9为过表达circTXNIP成肌细胞分化肌管统计；
图10为过表达circTXNIP成肌细胞分化相关蛋白免疫印迹检测；
图11为小鼠胫骨前肌损伤模型构建；
图12为体内过表达circ TXNIP效率检测；
图13为切片和HE染色观察胫骨前肌修复过程；
图14为qPCR检测肌再生相关基因表达；
图15为蛋白免疫印迹检测肌再生相关蛋白表达；
图16为过表达circTXNIP肌损伤部位免疫荧光检测与荧光强度分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料及其来源：
(1)从正规厂商购买2只4-5月龄青年新西兰大白兔，饲养于广西大学兔繁育中心，用于兔源一抗的制备。水牛3-5月龄胎牛由南宁本地屠宰厂获得，用于成肌细胞的原代分离。4周龄C57BL/6品系的SPF实验小鼠购自购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于广西大学实验基地小鼠繁育中心；
(2)pCD2.1载体为本试验表达质粒；siRNA由广州锐博生物科技公司设计并合成序列。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成；
(3)本研究所用抗体及货号：β-actin：66009-1-Ig，CyclinD1：WL01435a，PCNA：WL03213，CDK2：60312-1-Ig，MyoD：18943-1-AP，MyoG：
67082-1-Ig，MyHC：ab207926，TPM1：28477-1-AP，SKP1：10990-2-AP,PAX7：bs-2413R，HRP标记二抗：Anti-Rabbit：SA00001-2，Anti-Mouse：
SA00001-1；
(4)胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司。EdU试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司。ECL超敏发光液、Tween20和脱脂奶粉购自北京索莱宝科技有限公司。T4连接酶与核酸内切酶均购自美国Thermo公司；
CCK8试剂盒、细胞转染试剂和荧光定量PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。DAPI试剂、FITC荧光标记二抗和HRP标记二抗购自Proteintech公司。10x TBS储液、10x PBS储液和10x转膜液储液购自上海生工生物有限公司。细胞DMEM培养基、胎牛血清和青链霉素均购自美国Gibco公司。体内转染DNA试剂EntransterTM-invivo购自北京EngreenBiosystem公司；樱花牌OCT购自广西助研生物有限公司；心脏毒素购自上海恪敏生物科技有限公司；福尔马林溶液购自上海生工有限公司；中性树胶、苏木素和伊红溶液购自索莱宝公司；定量PCR试剂购自南京诺唯赞生物公司；粘附性载玻片购于众泰公司。
实施例1：水牛肌肉原代细胞的分离培养
(1)屠宰场送来的胎牛小心剥离胎膜，皮肤表面用75％酒精擦拭消毒；
(2)用无菌眼科剪和镊子剥离皮肤和筋膜，剥离背腰最长肌；
(3)转移至75％酒精中，随后用PBS溶液洗净表面酒精后，再转移至含有2×双抗的37℃预热的PBS溶液中充分浸泡；
(4)迅速将取出的胎牛背腰最长肌转移至入无菌细胞培养室，用另一套灭菌后的眼科剪和镊子剔除肌肉间结缔组织和血管；
(5)加适量1×PBS，用无菌眼科剪将肌肉样品剪碎至肉糜状态；
(6)剪碎的肉糜中加入2～4mL胶原酶Ⅱ溶液，于37℃下消化2h；
(7)1,200rpm/min，离心5min后弃去上清，加入适量胰蛋白酶溶液，于37℃下消化30min；
(8)消化结束后，加入相同体积DMEM完全培养基(DMEM加入10％ Gibco胎牛血清)终止胰蛋白酶活性；
(9)轻轻用移液器吹散组织团，先经100μm细胞筛过滤，再经70μm细胞筛过滤，收集过滤后的细胞悬液；
(10)将细胞悬液1,000rpm/min离心5min，弃去上清，细胞用PBS溶液清洗两遍后，用完全培养基重悬放至CO2培养箱培养；
(11)1.5h后，吸取未贴壁细胞换皿培养弃去，贴壁细胞为肌肉内成纤维细胞；
(12)每48h用DMEM原代成肌细胞完全培养基换液一次，直到细胞生长至密度约80％，对细胞传代培养或冻存；
(13)细胞汇合度达到75％后将生长培养基弃去，更换成诱导分化培养基(DMEM包含2％马血清)对获得的成肌细胞进行诱导分化。
实施例2：利用PCR方法扩增circTXNIP全长及其核苷酸序列测序
1、总RNA提取
首先用胰蛋白酶消化实施例1分离诱导分化获得的成肌细胞，PBS溶液清洗2遍，离心后收集细胞，加入1mL Trizol裂解液置于冰上。加入Trizol裂解液后的提取步骤如下：
(1)用涡旋仪进行震荡，使细胞均匀分布于裂解液，冰上裂解10min；
(2)随后加入200μl氯仿，震荡后置于冰上10min；
(3)4℃,12,000rpm/min离心10min，小心吸取无色上清液体；
(4)加入等体积预冷的甲醇溶液，上下颠倒混匀，于4℃离心机以12,000rpm/min离心15min，弃去溶液；
(5)用预冷的RNase-free水配制的75％乙醇溶液清洗RNA沉淀，随后离心弃去液体；
(6)待RNA中乙醇挥发，加入适量的RNase-free水溶解RNA。
2.cDNA合成
(1)除去基因组DNA：在无RNA酶的PCR管中加入以下液体：模板RNA(总RNA用量为1pg-1μg)、4x gDNA wiper Mix 4μL、Rnase-free ddH2O to16μL，混匀；PCR仪42℃，2min；
(2)配制逆转录反应体系：在第一步的反应的离心管管中直接加入5xHisScriptqRT SuperMix 4μL混匀；
(3)进行逆转录反应：37℃，15min；85℃，5s。获得的是水牛成肌细胞cDNA置于-20℃冰箱保存。
3、PCR扩增circTXNIP全长
以水牛成肌细胞cDNA为模板，进行PCR扩增。使用的引物：
circTXNIP-clone-F:5′-AGATTAACATCCATGCTG-3′
circTXNIP-clone-R:5′-CATCACCTTCACAGAATC-3′
根据2x Taq PCR Mastermix说明书进行操作PCR扩增，将获得产物使用琼脂糖凝胶检测，并裁下与目的基因大小相同的条带进行胶回收，把回收产物送上海生工进行sanger测序。测序结果显示circTXNIP全长序列长度为360bp，其RNA序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例3：circTXNIP编码肽的鉴定
1、抗原设计及抗体制备
利用ORF Finder查找circTXNIP全长序列的开放读码框(ORF)，并翻译为氨基酸序列命名为circTXNIP-peptide(circTXNIP编码肽)，序列信息如SEQ ID NO:2所示。通过在线网站基于神经网络算法预测B细胞识别circTXNIP编码肽的抗原表位，参数为：ABCpred，Threshold>0.8，length＝16aa。确定位于N端得分最高抗原肽段的抗原表位氨基酸序列：KAAIVARHTYLANGQT，委托杭州专肽生物有限公司合成；
合成的抗原小肽与免疫佐剂充分混合乳化后，对青年兔执行免疫。免疫程序为：首次免疫(完全弗氏佐剂混合10mg抗原，多点背部皮下注射)，加强免疫3次(不完全弗氏佐剂混合5mg抗原，背部多点皮下注射)。两次免疫间隔时间为10天。免疫结束后,收集兔子抗体血清用于后续实验。
2、免疫荧光
收取实施例1获得的水牛增殖期和分化期成肌细胞，使用PBS漂洗3次后，用4％多聚甲醛固定30min，PBS冲洗3次；0.1％Triton X-100处理30min，PBS洗涤3次；2％山羊血清封闭1h，滴加稀释的circTXNIP编码肽抗体覆盖，4℃孵育过夜。弃除一抗后用PBS清洗，加入稀释的绿色荧光二抗，室温避光孵育1h；PBS洗净后用DAPI溶液在室温下孵育15min；最后用PBS洗三次，使用荧光显微镜观察。如图1A所示，细胞核采用DAPI染色后呈蓝色；细胞质的绿色荧光为circTXNIP编码肽检测的信号，免疫荧光试验同时检测了成肌细胞增殖期与成肌细胞分化期的细胞样品。结果显示成肌细胞增殖期与分化期均检测到circTXNIP编码肽荧光信号，且其主要分布于细胞质中。免疫荧光试验证明了circTXNIP编码肽在成肌细胞增殖期和成肌细胞分化期的细胞质均稳定表达，说明其对成肌细胞正常增殖与分化过程具有重要的生物学意义。
3、蛋白提取及Western Blotting
用含有1％ PMSF的RIPA裂解缓冲液提取成肌细胞或水牛肌肉组织样品中的蛋白质。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，随后用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到NC膜上；用特异性一抗和相应的二抗孵育后，曝光并用ChemiDoc XRS+系统并对图像进行分析。如图1B所示，Western Blotting试验检测到水牛肌肉组织中的circTXNIP-peptide分子量大小介于40-55kDa之间，与预测的理论大小51kDa一致；
通过对circTXNIP编码肽的鉴定，表明circTXNIP编码肽存在于水牛成肌细胞和水牛肌肉组织中，其参与了水牛肌肉发育的调控。
实施例4：构建circTXNIP的过表达载体及干扰RNA
1、circTXNIP的过表达载体构建
设计circTXNIP的全长序列引物，并在上下游引物各加上保护碱基和酶切位点。引物序列为：(下划线部分为酶切位点)：
pCD2.1-circTXNIP-F:GGGGTACCAGATTAACATCCATGCTG；
pCD2.1-circTXNIP-R:CATCACCTTCACAGAATCGGATCCCG；
使用水牛细胞cDNA为模板，PCR扩增克隆circTXNIP全长。将扩增得到的circTXNIP全长序列连接到pCD2.1载体上，得到过表达载体pCD2.1-circTXNIP。
2、干扰片段的合成
根据circTXNIP全长序列，其的干扰片段由广州锐博生物科技公司设计并合成序列：ATACTCCTTACTGGAACCT。
实施例5：检测过表达与干扰circTXNIP对水牛成肌细胞增殖能力的影响
1、circTXNIP过表达载体与干扰载体转染水牛成肌细胞
根据试验要求把水牛成肌细胞接种到细胞培养皿中，待细胞密度达到70％时，根据转染试剂说明书，将过表达质粒pCD2.1-circTXNIP和干扰片段si-circTXNIP(pCD2.1质粒、si-NC分别为对照)分别转染至成水牛成肌细胞内，并检测过表达和干扰后细胞内的circTXNIP表达量，以确定过表达和干扰的效果。如图2所示，通过qPCR检测成肌细胞内circTXNIP表达量,图中pCD2.1为转染了空载体质粒的对照组成肌细胞，circTXNIP组为转染过表达质粒pCD2.1-circTXNIP的成肌细胞。circTXNIP组相比于pCD2.1组circTXNIP的相对表达量显著上调7倍左右(p<0.01)，表明了过表达质粒pCD2.1-circTXNIP在水牛成肌细胞中能显著增加circTXNIP的表达。干扰片段的检测如图3所示，转染circTXNIP干扰片段后，circTXNIP表达受到抑制，qPCR检测circTXNIP表达量显著下调至对照组的一半左右，表明转染circTXNIP干扰片段可显著抑制circTXNIP表达(p<0.01)。
2、EDU检测细胞增殖
用96孔板培养水牛成肌细胞待细胞汇合度达到65％，通过脂质体转染试剂将pCD2.1-circTXNIP质粒转染至细胞中。转染后待细胞汇合度达到70％左右，且转染细胞有明显绿色荧光。
EdU标记：用DMEM完全培养基按千分之一比例稀释EdU试剂，制备含10μM终浓度的EdU细胞培养基。96孔板每孔加入100μL的EdU培养基，孵育6h后弃去培养基，用PBS溶液清洗2～3次，每次3min。
细胞固定：每孔加入50μL含4％多聚甲醛的PBS细胞固定液，室温固定30min后弃去固定液。随后每孔加入2mg/mL的甘氨酸溶液50μL，摇床室温孵育5min后，吸去甘氨酸溶液。每孔再用100μL PBS，摇床清洗3min后弃PBS洗液。每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS溶液)孵育10min，弃去液体后PBS清洗1次。
Apollo染色：每孔加入100μL按说明书配制好的Apollo染色液，室温避光孵育30min后弃掉染色反应液。每孔加入100μL含0.5％TritonX-100的PBS清洗细胞4～5次，每次5min。
最后进行细胞核染色：每孔加入100μL Hoechst染色液，室温避光孵育10min后用PBS洗3次，每次3min。清洗完即可加入适量PBS于荧光显微镜下拍照分析。EdU检测水牛成肌细胞增殖的结果如图4所示，其中4A为EdU阳性成肌细胞染色成像图，图中pCD2.1为对照组，circTXNIP组为过表达circTXNIP编码肽的实验组。通过Hochest对所有的细胞核染色，EdU染料对复制过的细胞核染色，最后叠加图中统计EdU染色细胞核占总细胞核百分比，即可得到复制的细胞比例，图4A中细胞核的亮点数目即为染色阳性细胞数目。图4B为EdU阳性细胞统计结果图，从结果图中可见过表达circTXNIP的circTXNIP组EdU阳性细胞比例显著高于pCD2.1对照组(p<0.05)，表明circTXNIP显著促进了成肌细胞增殖。
3、CCK8检测细胞增殖
用96孔板培养水牛成肌细胞待细胞汇合度达到60％，通过转染试剂将si-circTXNIP转染至水牛成肌细胞中干扰circTXNIP表达，以达到降低circTXNIP表达量的效果。转染后24h，待细胞汇合度达到70％左右，更换新的完全培养基每孔100μL，加入10μLCCK-8染料，孵育2h，待橙黄色甲臜染料颜色肉眼可见时，使用多功能酶标仪在450nm波长处测得吸光值，并计算增殖细胞百分比，计算公式为：细胞增殖百分比＝[(A-C)/(B-C)]×100％，其中字母含义为A:实验组吸光值(为含有培养基、细胞、待测物质和CCK-8染料的吸光值)B:对照组吸光值(为含有培养基、细胞、CCK-8染料的吸光值)C:空白组吸光值(为含有培养基、CCK-8染料的吸光值)。通过计算与统计分析，CCK8检测水牛成肌细胞增殖的结果如图5所示，干扰circTXNIP组与对照组相比细胞增殖速率极显著降低了12％左右(p<0.001)。说明干扰circTXNIP组的水牛成肌细胞增殖活动受到极显著抑制，circTXNIP的表达对于水牛成肌细胞的增殖是不可缺少的。
4、流式分析细胞周期
使用60mm皿培养水牛成肌细胞待细胞汇合度达到65％，通过转染试剂将pCD2.1-circTXNIP过表达质粒转染至细胞中进行表达。转染后待细胞汇合度达到75％左右，利用胰酶消化，收获细胞用于细胞周期分析。收获的细胞用PBS洗涤2次，1,000rpm/min离心5min后弃去上清。随后在涡旋仪上用-20℃预冷含75％乙醇的PBS溶液重悬细胞，-20℃固定细胞过夜。固定后的细胞离心去除乙醇溶液，再用PBS溶液洗涤2次。加入FxCycleTM PI/NnaseStaining Solution染液于室温避光孵育细胞30min。随后通过流式细胞仪(Thermo,AttuneNxT)分析细胞周期，仪器分析参数设置如下:FSC-100V；SSC-300V；流速12.5μL/min；Singlecell记录10,000个；阈值FSC-25^1e3。产生的数据通过FlowJo 10软件分析各细胞周期的比例。
流式分析细胞周期的结果如图6所示，通过PI染色结合流式细胞术分析了各时期的细胞比例，图中2N、S、4N，对应细胞间期、分裂S期和分裂中后期。从图6A中可直观看出过表达circTXNIP组的S期比例为38.9％，高于pCD2.1对照组的25.4％，表明circTXNIP可能增加了水牛成肌细胞处于增殖期的比例。进一步，对细胞周期统计分析的结果如图6B所示，2N期细胞比例显著低于对照组(p<0.05)，circTXNIP组S期比例高于pCD2.1对照组，但差异不显著(p>0.05)。这些结果均说明circTXNIP作用于水牛成肌细胞，使更多水牛成肌细胞处于细胞增殖周期，进而加速了水牛成肌细胞的增殖过程。
5、qPCR及蛋白免疫印迹试验检测过表达和干扰circTXNIP对水牛成肌细胞基因表达的调控作用
按照实例2方法提取水牛成肌细胞总RNA，利用反转录试剂盒进行反转录，将RNA反转录为cDNA，通过qPCR技术检测水牛成肌细胞增殖相关基因PCNA、CyclinD1和CDK2在RNA水平的表达变化情况。同时，按照实例3方法提取细胞内蛋白，利用蛋白免疫印迹技术检测circTXNIP及水牛成肌细胞增殖相关基因PCNA、cyclinD1和CDK2在蛋白水平的表达变化情况。
如图7所示，水牛成肌细胞过表达circTXNIP后，对水牛成肌细胞增殖标志基因的转录和蛋白表达进行了检测。其中图7A为PCNA、CyclinD1和CDK2在转录水平的表达变化情况，图中可见过表达circTXNIP组的PCNA与CDK2基因表达显著高于对照组。图7B为蛋白免疫印迹技术检测增殖相关基因蛋白表达，结果显示PCNA，CyclinD1以及CircTXNIP-pep蛋白均显著高于对照组，这表明水牛成肌细胞中过表达circTXNIP，显著促进PCNA和CyclinD1蛋白水平表达。CircTXNIP-pep蛋白是由circTXNIP编码产生，其在过表达circTXNIP组升高也证明了随着circTXNIP表达增加其编码蛋白也相应增加，再次应证了circTXNIP可编码多肽。
与之相反，干扰circTXNIP对成肌细胞增殖基因的相对表达量具有下调作用。如图8所示，通过qPCR检测CyclinD1和PCNA基因表达在干扰circTXNIP组显著下调(p<0.05)，而CDK2基因表达量减少但差异不显著。综合图7结果可知，circTXNIP对水牛成肌细胞的增殖具有促进作用，干扰了circTXNIP水牛成肌细胞增殖基因受到显著抑制，导致细胞增殖速率变慢。
实施例6：检测过表达circTXNIP对水牛成肌细胞分化能力的影响
1、细胞转染及诱导分化
将水牛骨骼肌卫星细胞接种至不同型号的培养皿中，培养至细胞密度达到60％以上，按照转染试剂说明书将pCD2.1-circTXNIP过表达质粒和pCD2.1对照质粒分别转染成水牛成肌细胞。转染后继续培养细胞，细胞密度的达到75％左右，换用2％马血清DMEM进行诱导分化。
2、分化肌管统计
肌管总数统计的方法如下：首先在四倍镜下对两组细胞各拍摄20个不同视野，通过放大寻找具有明显折光性的融合肌管，用Image J软件在图上标记统计。统计后分析不同视野内肌管总数(图9B)，随后后用Graphpad软件绘制作图。肌管融合细胞数目统计：免疫荧光染色后每组拍摄30张，分别统计各组每条肌管中的细胞核数目(图9C)。如图9A所示两组免疫荧光染色的肌管以及四倍镜下有明显折光性的融合肌管，其中免疫荧光染色方法与实施例3一致，肌管染色后呈现绿色荧光，细胞核染色后呈蓝色荧光，免疫荧光染色为了明显区分肌管轮廓与肌管中的细胞核以方便统计分析。
为了量化肌细胞的分化水平，本发明统计了四倍镜视野内肌管总数目与免疫荧光染色的单条肌管内细胞核数目。其中图9B为肌管数目统计结果，从图中可见在四倍镜下过表达circTXNIP组肌管数目显著高于对照组(p<0.05)。图9C图为肌管融合细胞数目统计，统计结果显示过表达circTXNIP组肌管融合细胞核数目显著增加，说明circTXNIP促进了成肌细胞融合，加速了成肌细胞向肌管的分化。
3、蛋白免疫印迹
收取分化5天的水牛成肌细胞，提取蛋白，利用蛋白免疫印迹技术检测成肌分化相关基因MyoD1、MyoG和MyHC在蛋白水平的表达变化情况(图10)。在成肌细胞分化状态，我们通过蛋白免疫印迹检测了circTXNIP对成肌细胞分化相关蛋白的表达是否有调控作用。结果如图10所示，MyoD蛋白表达量显著上调，而MyoG和Myhc表达无显著差异。这表明circTXNIP主要通过上调MyoD蛋白表达，进而促进了成肌细胞融合形成肌管，促进了水牛成肌细胞肌源性分化。
实施例7：过表达circTXNIP对小鼠肌肉损伤的影响
1、肌损伤模型构建
5周龄C57/6J小鼠(n＝50)用于构建肌损伤模型。分别在左腿胫骨前肌注射50μL浓度为10μM的心脏毒素，右腿胫骨前肌注射50μL 5％葡萄糖溶液作为对照。注射后24h后取3只处死后，剥离左腿与右腿胫骨前肌经中性福尔马林溶液固定24h后，依次通过10％，20％，30％蔗糖溶液脱水。经OCT包埋，冰冻切片与HE染色观察肌肉损伤情况(图11)，以此判断肌损伤模型构建是否成功。
为了观察circTXNIP编码肽在体内对肌肉发育的调控功能，首先在小鼠胫骨前肌多点注射CTX构建肌肉损伤模型，注射后48h对模型鼠胫骨前肌采样。冰冻切片对肌束横切，如图11所示HE染色后肌肉损伤模型组可以观察到注射部位肌纤维发生明显损伤，并伴有许多炎性细胞浸润(图中苏木素深染散在肌束间的细胞)。而图中对照组肌纤维结构完整紧实，为正常肌肉形态且并无炎性细胞，说明通过肌肉注射CTX成功构建了鼠胫骨前肌损伤模型。
2、体内过表达circTXNIP
确定肌损伤模型构建成功后，按照EntransterTM-in vivo试剂盒说明书进行体内转染试验。经过评估，理论上可以用实施例2构建的水牛源circTXNIP与脂质体形成circTXNIP核酸复合物作为过表达质粒用于治疗小鼠的肌肉损伤。因此在小鼠胫骨前肌损伤部位分别注射实施例2所构建的pCD2.1-circTXNIP与pCD2.1-CIR转染复合物，每周注射1次,一共注射3次转染试剂与质粒复合物。
通过在损伤的胫骨前肌过表达circTXNIP，以此观察circTXNIP在体内对肌肉再生的调控功能。如图12所示，过表达circTXNIP后，circTXNIP相比于对照组表达量提升了400多倍，说明体内转染circTXNIP核酸复合物能显著提高circTXNIP的表达量。
3、检测过表达circTXNIP对小鼠肌损伤修复的影响
通过收取样品进行冰冻切片、HE染色观察肌肉修复情况(图13)。采用细胞水平一致的方法提取肌肉组织RNA和蛋白，利用qPCR检测成肌肉再生相关基因在RNA水平的表达变化情况(图14)。利用WB方法检测检测肌肉再生相关基因在蛋白水平的表达变化情况(图15)。利用免疫荧光方法通过荧光强度对蛋白表达相对定量，观察组织形态的变化以及蛋白在组织中的具体表达部位(图16)。
如图13所示，肌束随着过表达circTXNIP的时间逐渐修复，过表达7天，切片并通过HE染色观察circTXNIP组肌纤维表现出了一定的肌肉修复迹象，而对照组pCD2.1则损伤较为严重，未见明显修复现象。过表达21天时，circTXNIP组肌束修复效果较好，而pCD2.1对照组有部分修复，但仍有许多肌束呈现不规则圆形。表明在体内circTXNIP能持续性地促进肌肉修复，加快了肌肉损伤后再生。
如图14所示，肌再生相关基因表达的qPCR检测结果。过表达14天的circTXNIP组，增殖分化基因表达量普遍增加，其中CDK2、cyclinD1和MyoD表达显著上调。表明在体内circTXNIP通过上调肌细胞相关基因表达，进而促进肌肉修复。
如图15所示，通过蛋白免疫印迹试验检测肌再生相关蛋白表达，图15中蛋白条带越深表明蛋白表达量越高。可见circTXNIP-peptide组显著上调了PAX7蛋白的表达，说明肌卫星细胞从静息状态被激活，开始大量增殖，补充缺失的肌细胞。此外cyclinD1、PCNA和CDK2蛋白表达上调说明了circTXNIP-peptide组显著促进了细胞增殖过程。增殖的肌细胞并不能直接发挥肌肉的生理功能，肌细胞进一步分化为肌管形成肌纤维才能恢复肌肉收缩的能力。MyoD、MyoG和MyHC表达的增加说明了大量增殖的肌细胞随后进行融合分化，完成这个阶段意味着肌肉修复接近尾声,circTXNIP组促进了MyoD、MyoG和MyHC蛋白的表达，表明circTXNIP通过增加肌肉再生相关蛋白表达加速了肌肉损伤修复作用。
如图16所示，荧光染色和统计分析结果，图中的PAX7的荧光染色图显示，在circTXNIP组肌束周围有较强的荧光信号，而肌卫星细胞常附着于肌束周围，若肌肉受损则激活增殖，因此circTXNIP组激活的肌卫星细胞大量表达PAX7蛋白导致在肌束周围荧光信号强烈。通过免疫荧光染色后用Image J统计平均荧光强度，从统计结果可见PAX7、cyclinD1和MyoD蛋白均显著上调，这些肌肉再生相关蛋白表达促进了肌肉损伤修复。
综上，此外，由于理论上所述circTXNIP编码肽可应用于人骨骼肌损伤的治疗过程，本发明根据以上取得的实验结果，同时提供了理论上可用于小鼠和人线性表达circTXNIP编码肽的序列，这两段序列可连接真核线性表达载体，与转染试剂混合形成核酸复合物注射入骨骼肌内表达circTXNIP编码肽的氨基酸序列。用于小鼠骨骼肌内线性表达circTXNIP编码肽的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，用于人骨骼肌内线性表达circTXNIP编码肽的DNA序列而SEQ ID NO:4所示。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，其特征在于，所述环状RNA分子为circTXNIP，其水牛源序列如SEQ ID NO:1所示，过表达circTXNIP促进circTXNIP编码肽生成，进而成肌细胞的增殖与分化随之增加。
2.根据权利要求1所述环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，其特征在于，所述circTXNIP与脂质体形成circTXNIP核酸复合物作为制备治疗肌肉损伤的药物的组分。
3.根据权利要求2所述环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，其特征在于，所述circTXNIP核酸复合物作为制备治疗肌肉损伤的药物的组分时，每公斤受损肌肉用量为300-1000μg。
4.根据权利要求1所述环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，其特征在于，所述治疗肌肉损伤的药物是注射剂。
5.根据权利要求1所述环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，其特征在于，用于线性表达所述circTXNIP编码肽的小鼠源DNA序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求1所述环状RNA分子在制备治疗肌肉损伤的药物中的应用，其特征在于，用于线性表达所述circTXNIP编码肽的人源DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
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| CN118440941A (zh) * | 2024-07-05 | 2024-08-06 | 江西农业大学 | 环状rna在调控鸭成肌细胞增殖、分化中的应用 |
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2022
- 2022-12-20 CN CN202211642078.4A patent/CN115837081A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118440941A (zh) * | 2024-07-05 | 2024-08-06 | 江西农业大学 | 环状rna在调控鸭成肌细胞增殖、分化中的应用 |
| CN118440941B (zh) * | 2024-07-05 | 2024-09-06 | 江西农业大学 | 环状rna在调控鸭成肌细胞增殖、分化中的应用 |
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