CN115836223A

CN115836223A - 钙防卫蛋白测定

Info

Publication number: CN115836223A
Application number: CN202180034810.7A
Authority: CN
Inventors: 约阿希姆·赫格·莫滕森; 多维莱·辛格维奇特; 蒂娜·玛农-詹森; 莫滕·阿塞尔·卡斯达尔; 安妮-克里斯蒂娜·巴伊-詹森; 西格纳·霍姆·尼尔森; 安妮卡·汉默斯加德·汉森; 詹尼·玛丽·比洛·桑德; 黛安娜·朱莉·利明; 尼古拉斯·维卢姆森; 克里斯蒂娜·詹森
Original assignee: Nordic Bioscience AS
Current assignee: Nordic Bioscience AS
Priority date: 2020-05-13
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2023-03-21
Also published as: EP4150337A1; US20230184787A1; WO2021229016A1; JP2023527702A; KR20230009421A

Abstract

本文公开了用于检测并量化生物流体样品中人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)生成的钙防卫蛋白片段的免疫测定方法；以及用于此类方法的单克隆抗体和测定试剂盒。该方法可以用于在患者中检测、监测和/或确定以炎症为特征或表现出炎症的疾病的状态或严重程度。

Description

钙防卫蛋白测定

技术领域

本发明涉及用于检测和优选量化生物流体样品中人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)生成的钙防卫蛋白片段的免疫测定方法，以及此类方法用于在患者中检测、监测和/或确定以炎症为特征或表现出炎症的疾病(诸如但不限于炎症驱动的疾病)的状态或严重程度的用途。本发明还涉及用于此类方法的单克隆抗体和测定试剂盒。

背景技术

钙防卫蛋白在细胞内，尤其是在中性粒细胞内表达，并且占中性粒细胞总胞质物质的约60％¹。钙防卫蛋白是TLR受体的配体，并且具有相对蛋白酶抗性²。中性粒细胞是来自骨髓细胞谱系的特化造血细胞，并且是来自先天性免疫系统的细胞亚群。中性粒细胞充当抵御病原体和细菌侵袭的第一道防线，并且因此在发炎的组织中也高度表达^3–5。

钙防卫蛋白可以在患有炎性肠病(IBD)的患者的粪便(粪便钙防卫蛋白)中进行测量¹，其中粪便钙防卫蛋白已被证明是用于区分IBD患者和肠易激综合征患者的稳健的夹心法-ELISA生物标志物^6–8。由于血清/血浆样品比粪便样品更容易处理，并且由于已经证明粪便稠度会影响粪便钙防卫蛋白水平，而且一天与一天之间甚至粪便与粪便之间的差异也很大，因此也已经对许多粪便钙防卫蛋白进行测试以查看它们是否也可以应用于血清/血浆样品。然而，钙防卫蛋白具有非常短的血浆半衰期(5小时)⁹，并且目前关于血清/血浆钙防卫蛋白及其作为IBD的适用生物标志物的可用数据存在争议^10–15。

中性粒细胞的激活导致中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular trap，NET)的产生，其中细胞分泌所有的其细胞核和胞质物质以试图捕获并削弱例如侵袭的细菌¹⁶。由于NET的形成，钙防卫蛋白和人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)将被分泌到发炎的组织中¹⁷。结果，组织和细胞外基质(ECM)和其他分泌的蛋白质将被HNE降解，这将导致包含蛋白质片段的新表位的生成^18,19。另外，还已经证明HNE与IBD中的组织炎症有关²⁰。已证明在来自IBD患者和临床前模型的血清中测量了包含胶原蛋白降解和形成的蛋白质片段的新表位，并与临床疾病参数相关^18,21–25。

炎症诱导的钙防卫蛋白和HNE的释放也发生在其他疾病中。慢性阻塞性肺病(COPD)和特发性肺纤维化(IPF)的特征是广泛的炎症和细胞外基质(ECM)的重塑，并且这可能导致肺功能随着时间的严重下降^34,35。中性粒细胞在受COPD影响的肺中非常丰富，并引起持续的组织伤害³⁶。IPF患者通过纤维化变化经历类似的持续性损伤，其中已经在IPF患者的支气管肺泡灌洗液中看到HNE释放的增加³⁷。中性粒细胞是炎症的细胞反应者，并且能够释放蛋白酶NE和蛋白质钙防卫蛋白二者³⁸。

炎症也使得倾向于癌症的发展并促进肿瘤发生的所有阶段。癌细胞以及周围的基质细胞和炎性细胞参与精心设计的相互作用，以形成炎性肿瘤微环境(TME)³⁹。免疫检查点抑制剂(诸如但不限于抗PD-1疗法)是一类用于治疗癌症诸如转移性黑色素瘤的药物。然而，与转移性黑色素瘤患者中对于抗PD-1疗法和其他此类免疫检查点抑制剂的反应和抗性相关的外周生物标志物代表了未满足的医疗需求。高中性粒细胞活性也与免疫检查点抑制剂失效有关，部分原因是NET的释放已被证明可以保护肿瘤细胞免受细胞毒性攻击。如上所述，HNE和钙防卫蛋白是主要的NET成分。

发明内容

本发明人建立如下理论，包含由HNE生成的钙防卫蛋白片段的新表位可以是活动性局部组织炎症和包括中性粒细胞的活动性白细胞的量度，而不是全身性炎症或循环白细胞的量度。此外，本发明人现已开发出稳健且可靠的免疫测定，用于检测并量化在生物流体诸如血清和血浆中包含钙防卫蛋白片段的HNE生成的新表位，并且已经证明了所述免疫测定在疾病诸如IBD、COPD、IPF、转移性黑色素瘤、SCLC NSCLC、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病关节炎和骨关节炎中评价炎症和疾病活动度中的用途。

因此，在本发明的第一方面涉及一种用于检测HNE生成的钙防卫蛋白片段的免疫测定方法，所述方法包括使人生物流体样品与单克隆抗体接触,所述单克隆抗体特异性识别并结合由所述HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列组成的HNE生成的新表位，以及检测所述单克隆抗体与所述样品中的肽之间的结合。

优选地，所述检测是定量的，并且所述方法进一步包括确定所述单克隆抗体与所述样品中的肽之间的结合量。

在优选的实施方式中，所述方法是用于在患者中检测和/或监测疾病的进展和/或确定疾病的状态或严重程度的免疫测定方法，其中，所述疾病是以炎症为特征或表现出炎症的疾病，所述方法包括使获自所述患者的生物流体样品与所述单克隆抗体接触，检测并确定所述单克隆抗体与所述样品中的肽之间的结合量，以及将所述结合量与和正常健康受试者相关的值和/或与和疾病的已知状态或严重程度相关的值和/或与在先前时间点从所述患者获得的值和/或与预定截止值相关联。

疾病可以是炎症驱动的疾病，诸如炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、干燥综合征或狼疮。

在优选的实施方式中，疾病是炎性肠病(IBD)。特别地，免疫测定方法可以是用于检测和/或监测炎性肠病(IBD)类型诸如溃疡性结肠炎(UC)和/或克罗恩病(CD)的进展和/或确定炎性肠病(IBD)类型诸如溃疡性结肠炎(UC)和/或克罗恩病(CD)的状态或严重程度的方法。

在另一优选的实施方式中，疾病是类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病关节炎或骨关节炎。

在其他优选的实施方式中，疾病可以是慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)或哮喘。

在还其他实施方式中，疾病可以是癌症。癌症可以例如是乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、头颈癌、膀胱癌。癌症可以例如是转移性癌症。在特定实施方式中，癌症可以例如是转移性黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。

当方法是用于确定疾病的状态或严重程度的方法时，所述方法可以例如用于评估疾病是活动性的还是缓解的；或用于评估可能的患者生存期或无进展生存期；或用于评估对医疗干预的可能反应，诸如用一种或多种药物(诸如一种或多种化疗剂(即细胞毒剂)和/或免疫检查点抑制剂)治疗的可能的患者生存期或无进展生存期)。

所述单克隆抗体可以特异性识别并结合HNE生成的新表位，所述新表位由任何HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列，诸如下文表2中列出的任何肽组成。然而，在某些优选的实施方式中，所述单克隆抗体特异性识别并结合选自以下HNE生成的钙防卫蛋白片段之一的肽的N末端或C末端序列：

KLGHPDTLNQGEFKELV(本文中也称为“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)

RKDLQNFLKKENKNEKV(“NBH-223”)(SEQ ID NO:2)

RKDLQNFLKKENKNEKVI(SEQ ID NO:3)

EHIMEDLDTNADKQL(SEQ ID NO:4)

SHEKMHEGDEGPGHHHKPGLGEGTP(“NBH-224”)(SEQ ID NO:5)

YRDDLKKLLET(“NBH-225”)(SEQ ID NO:6)

WFKELDINTDGAV(“NBH-226”)(SEQ ID NO:7)

在特别优选的实施方式中，所述单克隆抗体特异性识别并结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)的N末端或C末端序列。

在某些优选的实施方式中，所述单克隆抗体特异性识别并结合所述HNE生成的钙防卫蛋白片段的所述N末端序列。优选地，所述单克隆抗体不会特异性识别或结合所述N末端氨基酸序列的N延伸的延长形式或所述N末端氨基酸序列的N截短的缩短形式。在这点上，“所述N末端氨基酸序列的N延伸的延长形式”意指延伸超出序列的N末端的一个或多个氨基酸。类似地，“所述N末端氨基酸序列的N截短的缩短形式”意指从序列的N末端去除的一个或多个氨基酸。因此，例如，当单克隆抗体特异性识别并结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)的N末端序列时，“N延伸的延长形式”将是VKLGHPDTLNQ…(SEQ ID NO:8)，并且“N截短的缩短形式”将是LGHPDTLNQ…(SEQ ID NO:9)。

在某些其他实施方式中，所述单克隆抗体特异性识别并结合所述HNE生成的钙防卫蛋白片段的所述C末端序列，其中优选地所述单克隆抗体不会特异性识别或结合所述C末端氨基酸序列的C延伸的延长形式或所述C末端氨基酸序列的C截短的缩短形式。在这点上，“所述C末端氨基酸序列的C延伸的延长形式”意指延伸超出序列的C末端的一个或多个氨基酸。类似地，“所述C末端氨基酸序列的N截短的缩短形式”意指从序列的C末端去除的一个或多个氨基酸。因此，例如，当单克隆抗体特异性识别并结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)的C末端序列时，“C延伸的延长形式”将是…LNQGEFKELVR(SEQ ID NO:10)，并且“C截短的缩短形式”将是…LNQGEFKEL(SEQ ID NO:11)。

所述单克隆抗体优选地是针对包括所述N末端或C末端序列的合成肽产生的单克隆抗体。因此，例如，当单克隆抗体特异性识别并结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)的N末端序列时，单克隆抗体可以是针对具有序列KLGHPDTLNQ(SEQ ID NO:12)的合成肽产生的单克隆抗体，使得单克隆抗体特异性识别并结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(SEQ ID NO:1)的N末端序列。用于产生针对合成肽的单克隆抗体的合适的示例性方案描述于下文的实施例中。

在某些示例性实施方式中，当单克隆抗体特异性识别和结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)的N末端序列，并且优选地不会特异性识别或结合所述N末端氨基酸序列的N延伸的延长形式或所述N末端氨基酸序列的N截短的缩短形式时，所述单克隆抗体可以优选地包括选自以下的一个或多个互补决定区(CDR)：

CDR-L1:KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:13)

CDR-L2:GASTRES(SEQ ID NO:14)

CDR-L3:LNDHSYPYT(SEQ ID NO:15)

CDR-H1:DHVIN(SEQ ID NO:16)

CDR-H2:EIYPGSGSTYYNEKFKG(SEQ ID NO:17)

CDR-H3:FAY(SEQ ID NO:18)

优选地，单克隆抗体包括上面列出的CDR序列的至少2、3、4、5或6个。

优选地，单克隆抗体具有包括以下CDR序列的轻链可变区：

CDR-L1:KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQ ID NO:13)

CDR-L2:GASTRES(SEQ ID NO:14)和

CDR-L3:LNDHSYPYT(SEQ ID NO:15)。

优选地，单克隆抗体具有包括CDR之间的框架序列的轻链，其中，所述框架序列与以下轻链序列中的CDR之间的框架序列基本相同或基本相似(其中CDR以粗体和下划线示出，并且框架序列以斜体示出)

优选地，单克隆抗体具有包括以下CDR序列的重链可变区：

CDR-H1:DHVIN(SEQ ID NO:16)

CDR-H2:EIYPGSGSTYYNEKFKG(SEQ ID NO:17)和

CDR-H3:FAY(SEQ ID NO:18)。

优选地，单克隆抗体具有包括CDR之间的框架序列的重链，其中，所述框架序列与以下重链序列中的CDR之间的框架序列基本相同或基本相似(其中CDR以粗体和下划线示出，并且框架序列以斜体示出)

优选地，所述单克隆抗体包括轻链可变区序列：

(CDR为粗体和下划线；框架序列为斜体)

和/或重链可变区序列：

(CDR为粗体和下划线；框架序列为斜体)

生物流体样品可以是任何类型的生物流体，诸如例如血液、尿、滑液、血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)或血浆。然而，在优选的实施方式中，生物流体样品是血浆或血清。

免疫测定可以是但不限于竞争测定或夹心法测定。类似地，免疫测定可以是但不限于酶免疫测定(EIA)或放射免疫测定。优选地，免疫测定是竞争测定。优选地，免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)，诸如特别是竞争ELISA。

在第二方面，本发明涉及一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性识别并结合由HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列组成的HNE生成的新表位。单克隆抗体适用于根据本发明第一方面的免疫测定，并且根据本发明第二方面的单克隆抗体的优选和其他任选实施方式将从对用于本发明第一方面的单克隆抗体及其优选和其他任选实施方式的上述讨论中变得明显。

在第三方面，本发明涉及免疫测定试剂盒，所述免疫测定试剂盒包括根据本发明第二方面的单克隆抗体，以及以下中的至少一种：

-链霉亲和素包被的孔板；

-包括与生物素连接的所述N末端或C末端序列的生物素化肽；

-用于夹心法免疫测定的第二抗体；

-包括所述N末端或C末端序列的校准肽；

-抗体生物素化试剂盒；

-抗体HRP标记试剂盒；以及

-抗体放射性标记试剂盒。

在优选的实施方式中，免疫测定试剂盒包括根据本发明第二方面的单克隆抗体，以及以下的一种、两种或全部：

-链霉亲和素包被的孔板；

-包括与生物素连接的所述N末端或C末端序列的生物素化肽；以及

-包括所述N末端或C末端序列的校准肽。

例如，当单克隆抗体结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)的N末端序列时，合适的生物素化肽可以是具有序列KLGHPDTLNQ-L-生物素(SEQ ID NO:23)的肽，其中L是任选的接头。类似地，当单克隆抗体结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQID NO:1)的N末端序列时，合适的校准肽可以是具有序列KLGHPDTLNQ(SEQ ID NO:12)的肽。

定义

如本文所用，术语“肽”和“多肽”同义使用。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指完整抗体及其保留完整抗体的结合特异性的片段，诸如例如Fab片段、Fv片段或本领域技术人员已知的其他此类片段。保留相同结合特异性的抗体可以包含相同的互补决定区(CDR)。抗体的CDR可以使用本领域已知的方法，诸如Kabat et al.³³描述的方法来确定。

如实例中所述，抗体可以从B细胞克隆生成。抗体的同种型可以通过对人IgM、IgG或IgA同种型或人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类特异的ELISA来确定。可以使用其他合适的方法来鉴定同种型。

生成的抗体的氨基酸序列可以使用标准技术来确定。例如，可以从细胞中分离RNA，并用于通过逆转录生成cDNA。然后使用扩增抗体重链和轻链的引物来对cDNA进行PCR。例如，对所有VH(可变重链)序列的前导序列特异的引物可以连同与位于先前已确定的同种型的恒定区中的序列结合的引物一起使用。可以使用与κ或λ链的3’端结合的引物连同与Vκ或Vλ前导序列退火的引物来扩增轻链。可以生成全长重链和轻链并测序。

如本文所用，抗体的CDR之间的框架氨基酸序列与另一种抗体的CDR之间的框架氨基酸序列在以下情况下“基本相同”或“基本相似”：如果它们具有至少70％、80％、90％或至少95％的相似性或同一性。相似或相同的氨基酸可以是连续的或不连续的。框架序列可以包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。氨基酸置换可以是保守的，这意指置换的氨基酸具有与原始氨基酸相似的化学特性。技术人员会理解哪些氨基酸具有相似的化学特性。例如，以下氨基酸组具有相似的化学特性，诸如大小、电荷和极性：第1组Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；第2组Asp、Asn、Glu、Gln；第3组His、Arg、Lys；第4组Met、Leu、Ile、Val、Cys；第5组Phe Thy Trp。

程序诸如CLUSTAL程序可以用于比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列，并通过视情况在任一序列中插入间隔(space)来找到最佳比对。可以计算最佳比对的氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)。程序如BLASTx将比对相似序列的最长延伸，并为拟合分配一个值。因此当发现了几个相似区域，每个区域具有不同的评分时，可以获得比较。在本发明中考虑了这两种类型的分析。优选在框架序列的整个长度上计算同一性或相似性。

如本文所用，术语“N末端”是指多肽的末端，即在多肽的N末端(extremity)，并且不应解释为在其一般方向上的含义。同样地，术语“C末端”是指多肽的末端，即在多肽的C末端，并且不应解释为在其一般方向上的含义。

如本文术语中所用，术语“竞争免疫测定”是指一种免疫测定，其中样品中存在的靶标肽(如果有的话)与已知量的肽靶标(其例如结合到固定底物或被标记)竞争与抗体的结合，这是本领域技术人员已知的技术。

如本文所用，术语“靶标肽”是指包括HNE生成的新表位或由HNE生成的新表位组成的肽，该HNE生成的新表位由HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列组成，其被单克隆抗体特异性识别并结合。

如本文所用，术语“夹心法免疫测定”是指使用至少两种抗体来检测样品中的抗原的免疫测定，并且是本领域技术人员已知的技术。

如本文所用，术语“ELISA”(酶联免疫吸附测定)是指一种免疫测定，其中使用与酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶连接的抗体来检测样品中存在的靶标肽(如果有的话)。然后通过与生成可测量产物的底物一起孵育来评估酶的活性。因此可以检测和/或量化样品中靶标肽的存在和/或量。ELISA是本领域技术人员已知的技术。

如本文所用，术语“结合量”是指单克隆抗体与靶标肽之间结合的定量，所述定量通过将生物流体样品中靶标肽的测量值与校准曲线比较来确定，其中，校准曲线是使用已知浓度的靶标肽的标准样品产生的。在下文公开的特定测定中，其在生物流体中测量具有由HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端序列KLGHPDTLNQGEFKELV(“NBH-222”)(SEQ ID NO:1)组成的HNE生成的新表位的靶标肽，使用已知浓度的具有N末端氨基酸序列KLGHPDTLNQ(SEQ.ID No.12)(并且其可以尤其由氨基酸序列KLGHPDTLNQ(SEQ ID NO:12)组成)的校准肽的标准样品来产生校准曲线。将生物流体样品中测量的值与校准曲线进行比较，以确定样品中靶标肽的实际量。

如本文所用，“预定截止值”意指在统计学上确定为指示患者中的疾病(即以炎症为特征或表现出炎症的疾病，诸如例如炎症驱动的疾病)或其特定状态或严重程度(诸如活动性疾病状态或疾病预后)的高度可能性的结合量，其中患者样品中靶标肽的测量值等于或高于统计截止值对应于至少70％概率、优选至少75％概率、更优选至少80％概率、更优选至少85％概率、更优选至少90％概率、最优选至少95％概率存在所述疾病或其所述特定状态或严重程度。

如本文所用，术语“与正常健康受试者相关的值和/或与已知疾病状态或严重程度相关的值”意指通过免疫测定方法确定的被认为是健康(即没有疾病(即以炎症为特征或表现出炎症的疾病，诸如例如炎症驱动的疾病))的受试者的靶标肽的标准化量，和/或通过免疫测定方法确定的已知患有已知状态或严重程度的疾病(即以炎症为特征或表现出炎症的疾病，诸如例如炎症驱动的疾病)的受试者的靶标肽的标准化量。

附图说明

图1:钙防卫蛋白蛋白质S100A9和S100A8(A和B)及其由人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)生成的片段的序列概述。HNE切割点由向下箭头(↓)描绘，其中所得HNE生成的片段中的一些以灰色突出显示，并且形成指定为NBH-222、NBH-223、NBH-224、NBH-225和NBH-226的片段的N末端新表位的全部或起始的N-末端序列以较深的灰色阴影突出显示。

图2:包含HNE切割的钙防卫蛋白、全长钙防卫蛋白或HNE的样品中CPa9-HNE(NBH-222的N末端新表位)的相对丰度，如通过质谱法测试的(A)；CPa9-HNE抗体和测定的反应性，如针对选择肽、延长肽、截短肽和无义肽测试的(B)；以及包含HNE切割的钙防卫蛋白、全长钙防卫蛋白或HNE的样品中CPa9-HNE的丰度，如通过CPa9-HNE抗体和测定法检测的(C)。

图3:CPa9-HNE与粪便钙防卫蛋白(粪便-CP)和中性粒细胞计数的Spearman rho相关性(A和B)。

图4:来自炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)患者和健康受试者的血清中CPa9-HNE的测量水平(A和C)，以及相关的ROC曲线(B、D和E)。将数据描述为平均值与平均值标准误差(SEM)。星号(*)表示显著差异：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001

图5:CPa9-HNE和粪便钙防卫蛋白(粪便-CP)与溃疡性结肠炎的内窥镜评分(MES)和克罗恩病的内窥镜评分(SES-CD)的相关性(A-D)。R＝相关系数，P＝P值，SES-CD＝克罗恩病的简单内窥镜评分，MES＝Mayo内窥镜评分。

图6:在健康受试者、临床缓解的UC患者和患有活动性疾病的UC患者中测量的CPa9-HNE水平和相关的ROC曲线(A-C)；在临床缓解的UC患者和患有活动性疾病的UC患者中测量的粪便-CP水平和相关的ROC曲线(D和E)；以及CPa9-HNE与部分mayo评分(pMayo)以及Trulove和Witts(TW评分)的相关性(F和G)。

图7:(A)COPD患者和健康对照中CPa9-HNE的血清生物标志物水平。数据示出为Tukey箱线图，测量范围下限(LLMR)以虚线表示。通过双尾Mann-Whitney检验发现了显著性。(B)示出CPa9-HNE在COPD患者中的诊断能力的ROC曲线。AUC:0.9996。

图8:(A)IPF患者和健康对照中CPa9-HNE的血清生物标志物水平。数据示出为Tukey箱线图，LLMR以虚线表示。通过双尾曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验发现了显著性。(B)示出CPa9-HNE在IPF患者中的诊断能力的ROC曲线。AUC:0.9813。

图9:通过在第75个百分位数(Q1+Q2+Q3与Q4)分组(二分法)，评估与基线CPa9-HNE相关的用PD-1抑制剂治疗的患有转移性黑色素瘤患者的无进展生存期和总生存期的Kaplan Meier图。

图10:肺癌患者和对照中CPa9-HNE的血清生物标志物水平。数据示出为散点图，线位于中值，并且测量范围下限(LLMR)表示为虚线。通过最初测试正态性和对数正态性然后应用Dunnett多重比较检验发现了显著性。

图11:关节病患者和健康对照中CPa9-HNE的血清生物标志物水平。数据示出为Tukey箱线图。

实施例

在以下实施例中描述的本公开的实施方式旨在帮助理解本公开，并且不应被解释为以任何方式限制如在以下随后的权利要求中限定的本公开的范围。提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何产生并使用所描述的实施方式的完整公开和描述，并非旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有实验。已努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，以及压力是大气压或接近大气压。

在以下实施例中，采用了以下材料和方法。

方法

钙防卫蛋白的体外切割

通过将纯化的钙防卫蛋白(由蛋白质S100A9和S100A8构成的异二聚体)添加至Eppendorf管中并以100:1的蛋白质:蛋白酶比率添加人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)(10ug钙防卫蛋白/0.1ug HNE)，在体外生成钙防卫蛋白片段。24小时后通过添加5mM EDTA终止缓冲液来抑制蛋白水解反应。仅包含蛋白酶缓冲液或不含HNE的钙防卫蛋白或不含钙防卫蛋白的HNE的Eppendorf管用作实验对照。

质谱分析

将100μl切割的样品或对照用反相Vydac UltraMicro Spin C18柱(HarvardApparatus,cat#74-7206)根据制造商的说明脱盐。在配备有Easy nano-LC 1000系统(ThermoFisher Scientific)的四极杆Orbitrap台式质谱仪QExactive(ThermoScientific)上进行非靶向质谱分析。在填充有2μm颗粒的75μm×25cm AcclaimPepmap^TMRSLC C18毛细管柱(ThermoFisher Scientific)上进行分离。使用+2000V的喷雾电压和275℃的加热离子转移设置进行去溶剂化。使用300nl/min的流速和线性二元梯度进行在线反相分离85min。梯度从3％溶剂B开始4min，然后在64min内达到35％溶剂B，然后在5min内达到45％溶剂B。最后，有机溶剂浓度在5min内增加到90％并在90％保持7min。在Orbitrap质量分析仪中记录MS扫描(400–1200m/z)，设置为200m/z下分辨率为70,000，1×10⁶自动增益控制(AGC)目标和100ms最大离子注入时间(44)。MS随后是数据相关的碰撞诱导的解离，以2×10⁴强度阈值、2m/z隔离宽度和启用30秒的动态排除对15个最强的多电荷离子以17,500的分辨率进行MS/MS扫描。

钙防卫蛋白片段鉴定

使用智人(Homo sapiens)蛋白质组(UniProt蛋白质组ID UP000005640，n20200使用Proteome Discoverer 2.1软件(ThermoFisher Scientific)于2015年12月6日下载)从发现数据中进行鉴定。处理工作流由以下节点组成：用于光谱预处理的光谱选择器(前体质量范围：100–10000Da；S/N阈值：1.5)，Sequest-HT搜索引擎(蛋白质数据库：参见上文；酶：无酶；最大缺失切割位点：2；肽长度范围6-144个氨基酸；前体质量公差：10ppm；片段质量公差：0.02Da；动态修饰：氧化；静态修饰：半胱氨酸脲甲基化(carbamidomethylation)；以及用于肽验证的渗滤器(FDR<0.01，基于肽q值)。使用在Proteome Discoverer 2.1(ThermoFisher Scientific)中开发的专有算法对肽强度进行量化。

单克隆抗体生产和克隆表征

简而言之，如下进行单克隆抗体的生成，该单克隆抗体靶向由HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列组成的HNE生成的新表位(更具体地说，靶向HNE生成的钙防卫蛋白片段(称为“NBH-222”)的N末端新表位，也称为“CPa9-HNE”)。

使用弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)用200μL乳化抗原和50μg免疫原性肽(KLGHPDTLNQ-GGC-Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)(SEQ ID NO:24))皮下免疫4至6周大的Balb/C小鼠)。以两周间隔对小鼠进行免疫，直到达到稳定的血清滴度水平。选择具有最高血清滴度的小鼠进行单克隆抗体生产。使小鼠休息一个月，并且然后用100μL 0.9％氯化钠(NaCl)溶液中的50μg免疫原性肽静脉内免疫。3天后，分离脾细胞以用于细胞融合。简而言之，将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，并且然后使用半培养基方法在培养皿中克隆。将克隆铺板到96孔微量滴定板中，并使用有限稀释度来确保单克隆生长。使用链霉亲和素包被的板(Roche,Hvidovre,Denmark,cat.11940279)在间接竞争ELISA中筛选上清液对选择肽(KLGHPDTLNQ(SEQ ID NO:12))和天然材料(血清和切割材料)的反应性。根据制造商的说明(GE healthcare Life Sciences,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)，使用蛋白质G柱纯化具有最佳反应性的克隆。测试这些克隆对选择肽和延长肽、截短肽和无义肽的反应性(参见表1)，并且选择对选择肽示出最高选择性的克隆用于单克隆抗体生产和测定开发。确定了生物素化肽和抗体之间的最佳孵育缓冲液、时间、温度和最佳比率。

还对选择用于生产和测定开发的单克隆抗体进行测序，并确定了CDR和同种型。链的序列如下(CDR为下划线和粗体；N末端信号肽和C末端恒定区为斜体)：

重链序列(小鼠IgG1同种型)

轻链序列(小鼠κ同种型)

免疫测定(ELISA)方案

由HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列组成的HNE生成的新表位的水平(更具体地CPa9-HNE，即HNE生成的钙防卫蛋白片段NBH-222的N末端新表位的水平)通过如下进行的固相竞争酶联免疫吸附测定在样品中进行评估。

通过与生物素化抗原一起在室温下孵育30分钟，用生物素化抗原(KLGHPDTLNQ-K-生物素(SEQ ID NO:27))包被用链霉亲和素(Roche Diagnostic’s cat.No.11940279,Hvidovre,Denmark)预包被的96孔板。丢弃未结合的生物素化包被抗原，并使用标准化ELISA洗板机(

Instruments,Microplate washer,ELx405 Select CW,USA，威努斯基)用洗涤缓冲液(25mM TRIZMA、50mM NaCl、0.036％ Bronidox L5、0.1％吐温20)洗涤孔。样品在包含1％牛血清白蛋白(Sigma Aldrich,目录号a-7906,≥98纯度)的孵育缓冲液中稀释，以保持蛋白质稳定性并且用于封闭。将样品和对照添加至孔中并与针对HNE生成的新表位(CPa9-HNE)的第一单克隆抗体在20℃下孵育1小时并以300rpm搅拌。丢弃未结合的第一抗体和样品，并用洗涤缓冲液洗涤孔。随后，将HRP缀合的AffiniPure兔抗小鼠IgG第二抗体(Jackson目录号315-035-045)添加至孔中并在20℃下孵育1小时。通过在洗涤缓冲液中洗涤孔来丢弃未结合的第二抗体。将化学发光底物(Roche Diagnostic目录号11582950001)添加至孔中(100μl/孔)，并将板在室温下孵育3分钟，之后读取板。最后，使用ELISA读取器(VersaMAX；Molecular Devices,Wokingham Berkshire,UK)来量化板在440nm和650nm处发出的相对光单位(RLU)。使用4参数数学拟合模型来绘制标准曲线。

免疫测定开发

为了测试上述测定的稳健性，测试了稀释回收、血清中的肽掺加、分析物稳定性、冷冻/解冻、抗体特异性(可用性(sanity)测试)、干扰(溶血、生物素和血清中掺加的脂质)、之间/内部变异和生物相关性(切割材料、血清和血浆)。

IBD患者中的生物学验证

患者人口统计

测试来自由总计29名UC和72名CD患者组成的患者群体的血清样品。从电子病历记录和问卷调查中获得人口统计数据、疾病史和疗法。在纳入时测量人体测量参数。在可用的情况下，患者的内窥镜下疾病活动度基于CD的简单内窥镜评分(SES-CD)和UC的Mayo内窥镜评分(MES)。MES评分用于添加有关疾病扩展的信息²⁶。也将炎症活动度定义为使用克罗恩病活动度指数(CDAI)、部分Mayo评分(pMayo)和C-反应蛋白(CRP)的临床和生化疾病活动度的组合。基于内窥镜评分的患者分层如下：SES-CD(缓解＝0-2，轻度＝3-6，中度＝7-15，严重>15)，MES(缓解＝0-2，轻度＝3-6，中度＝7-15，重度>15)。将临床和生化活性定义为：对于CD为CDAI≥150或CRP>5，以及对于UC为pMayo>1或CRP>5。通过蒙特利尔(Montreal)分型评估疾病严重程度和范围。

统计分析

为了实现正态分布，在统计分析之前应用了数据的对数转换。应用正态分布数据的学生t-检验(Student's t-test)和单向ANOVA来分析统计差异。如果未通过对数转换实现正态分布，则应用Mann-Whitney U检验和Kruskal Wallis。多重比较校正使用错误发现率方法(FDR＝5％)。靶标肽水平呈现为具有平均值和平均值的标准误差(SEM)的非对数转换数据。

为了评估靶标肽的诊断能力，计算了接受者操作特征(ROC)曲线。P值≤0.05被认为是统计学显著的。使用Graphpad Prism 7.03和MedCalc进行统计分析。使用GraphPadPrism 7.03版制图。

COPD和IPF患者的生物学验证

在来自COPD患者(n＝68)和健康对照(n＝36)以及IPF患者(n＝16)和健康对照(n＝10)的血清中测量CPa9-HNE。

转移性黑色素瘤患者的生物学验证

在来自用抗PD-1疗法(帕博利珠单抗(pembrolizumab))治疗的转移性黑色素瘤患者的治疗前血清中测量CPa9-HNE(n＝35)。在获得同意和由丹麦首都地区道德委员会(Ethics Committee for the Capital Region of Denmark)遵照1975年赫尔辛基宣言的批准后，在海莱乌的哥本哈根大学医院(Copenhagen University Hospital,Herlev)，用作为标准治疗的帕博利珠单抗来治疗患者。血清样品采用盲法测量。单独地以及在调整PDL1表达(≥1％)、乳酸脱氢酶(LDH)、BRAF突变状态和C反应蛋白(CRP)之后，通过Kaplan Meier分析和Cox回归分析来评估CPa9-HNE水平与无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)之间的关联。

SCLC和NSCLC患者的生物学验证

在来自患有小细胞肺癌(SCLC)患者、患有非小细胞肺癌(NSCLC)患者和健康对照的血清中测量CPa9-HNE。

关节疾病患者的生物学验证

在来自患有类风湿性关节炎(n＝15，年龄[范围：39-47])、银屑病关节炎(n＝11，年龄[范围：31-64])、银屑病(n＝12，年龄[范围：27-52])、强直性脊柱炎(n＝11，年龄[范围：35-53])、年轻骨关节炎(n＝13，年龄<51[范围：41-50])、老年骨关节炎(n＝10，年龄>50)患者和健康对照(n＝33)的血清中测量CPa9-HNE。41名患者为女性。

结果

钙防卫蛋白新表位的生成和鉴定

应用UniProt蛋白质组ID UP000005640的非靶向质谱分析和随后的钙防卫蛋白片段鉴定显示，通过HNE从S100A9和S100A8蛋白质二者生成了包含钙防卫蛋白片段的几个新表位(表2和图1)。基于它们的PSM、质量q值和质量PEP评分，五个HNE-生成的钙防卫蛋白片段(NBH-222、NBH-223、NBH-224、NBH-225、NBH-226)被认为是用于测定开发的领跑者。在这些中，由于其PSM计数(表2)及其N末端新表位序列的独特性，选择NBH-222作为钙防卫蛋白(S100A9)片段，用于开发靶向该片段的HNE生成的N末端新表位(CPa9-HNE)的免疫测定。

用于CPa9-HNE的免疫测定开发

特异性、准确性和精确度

质谱数据表明，NBH-222仅存在于包含全长人钙防卫蛋白+人中性粒细胞弹性蛋白酶的样品中，但不存在于仅包含全长人钙防卫蛋白或人中性粒细胞弹性蛋白酶的对照样品中(图2A)。开发了靶向CPa9-HNE(NBH-222的HNE生成的N末端新表位)的单克隆抗体(本文也称为CPa9-HNE抗体)，并将其用于上述ELISA方案(也称为下文称为CPa9-HNE测定)，以及用于当针对选择肽和延长肽、截短肽和无义肽(具有表1中列出的序列)测试在用于该免疫测定时该抗体的特异性。Cpa9-HNE抗体仅表现出对Cpa9-HNE新表位序列的反应性(图2B)。

在包含HNE切割的钙防卫蛋白、或只有完整的全长人钙防卫蛋白或只有人中性粒细胞弹性蛋白酶的样品中，CPa9-HNE抗体只有在存在被人中性粒细胞弹性蛋白酶切割的钙防卫蛋白时才能识别靶标新表位序列(图2C)。CPa9-HNE测定的最终规格如表3中所示。

IBD患者的患者人口统计

来自IBD患者的血清中的CPa9-HNE水平证明与UC患者的粪便钙防卫蛋白水平(即粪便中完整钙防卫蛋白的水平)和中性粒细胞计数相关(图3A和B)。

IBD中的CPa9-HNE血清水平

与健康对照相比，在IBD的血清中CPa9-HNE升高

在来自UC、CD和健康受试者的血清中测量CPa9-HNE的血清水平。与健康受试者相比，IBD患者血清中的CPa9-HNE被证明是健康受试者的～4倍高(AUC:0.92,P<0.0001)(图4A和B)。当将患者分为CD和UC，血清CPa9-HNE在UC和CD患者中同样地升高，并且与健康受试者相比，CD(AUC:0.92,P<0.0001)和UC(AUC:0.94,P<0.0001)患者中的血清CPa9-HNE是健康受试者的～4倍高(图4C、D和E)。

CPa9-HNE与UC和CD中的内窥镜疾病活动度相关

CPa9-HNE与CD(SES-CD:r＝0.057,P<0.0001)和UC(MES:r＝0.71,P＝0.0003)的内窥镜疾病活动度密切相关。粪便-CP与CD的内窥镜疾病活动度相关(SES-CD:r＝0.39,P＝0.005)，但与UC的内窥镜疾病活动度无关(MES:r＝0.31,P＝0.09)(图5C和D)

CPa9-HNE与UC中的临床疾病活动度相关

基于部分Mayo评分将UC患者分为临床缓解和临床活动性疾病，与处于缓解的UC患者(AUC:0.88,P<0.0001)和健康供体(AUC:0.93,P<0.0001)相比，具有临床活动性疾病的UC患者中的CPa9-HNE显著升高(图6A、B和C)。CPa9-HNE的性能与粪便钙防卫蛋白相比，CPa9-HNE表现为与粪便钙防卫蛋白相同或略好，AUC和灵敏度增加(图6A至E)。CPa9-HNE还表现出与UC的部分mayo评分(r＝0.51,P＝0.008)以及Truelove和Witts评分(r＝0.64,P＝0.0005)相关(图6F和G)。

与健康对照相比，COPD患者中的CPa9-HNE升高

在COPD患者和健康对照的血清样品中测量CPa9-HNE。图7A显示了本发明在健康对照(n＝36)和COPD患者(n＝68)之间的差异(p<0.0001)。此外，在接受者操作特征(ROC)曲线中计算诊断能力，曲线下面积(AUC)确定为0.9996，图7B。测量结果不受患者BMI、年龄和性别的影响。

与健康对照相比，IPF患者中的CPa9-HNE升高

在IPF患者(n＝16)和健康对照(n＝10)的血清样品中测量CPa9-HNE图8A显示了本发明在健康对照和IPF患者之间的差异(p<0.0001)。此外，在ROC曲线中计算诊断能力，AUC确定为0.9813，图8B。

高CPa9-HNE与转移性黑色素瘤的较差预后相关

通过Kaplan-Meier分析评价CPa9-HNE与转移性黑色素瘤患者的生存期结果之间的关联。使用第75百分位数切点，发现与具有低CPa9-HNE水平的患者相比，具有高CPa9-HNE水平(>第75百分位数)的患者具有显著更差的PFS(p＝0.011)和OS(p＝0.0002)(图9)。支持此，单变量Cox回归确定了与低CPa9-HNE相比时，高(>第75百分位数)治疗前CPa9-HNE为较差PFS(HR＝3.32,95％CI＝1.25-8.82,p＝0.016)和OS(HR＝11.31,95％CI＝2.27-56.33,p＝0.003)的预测因子(表4)。通过多变量Cox回归，当针对PDL1表达、LDH、BRAF突变和CRP调整时，发现高CPa9-HNE独立预测了差的PFS(HR＝8.22,95％CI＝1.30-52.14,p＝0.025)和OS(HR＝76.87,95％CI＝4.73-1248.57,p＝0.002)(表4)。

与健康对照相比，SCLC和NSCLC患者中的CPa9-HNE升高

在来自患有小细胞肺癌(SCLC)患者、患有非小细胞肺癌(NSCLC)患者和健康对照的血清中测量CPa9-HNE。肺癌患者经历了CPa9-HNE血清水平的统计学显著增加，其中检查了小细胞肺癌(SCLC)(p＝0.0435,n＝10,中位数＝212.1[IQR 164.0-407.1])和非小细胞肺癌(NSCLC)(p＝0.0467,n＝10,中位数＝281.3[IQR 186.8-385.8])二者(图10)。

与健康供体相比，关节疾病中的CPa9-HNE升高

在来自患有类风湿性关节炎(n＝15，年龄[范围：39-47])、银屑病关节炎(n＝11，年龄[范围：31-64])、银屑病(n＝12，年龄[范围：27-52])、强直性脊柱炎(n＝11，年龄[范围：35-53])、年轻骨关节炎(n＝13，年龄<51[范围：41-50])、老年骨关节炎(n＝10，年龄>50)患者和健康对照(n＝33)的血清中测量CPa9-HNE。与健康对照相比，所有关节疾病中的CPa9-HNE生物标志物均显著升高，其中与健康对照相比，对于强直性脊柱炎(p<0.001)、银屑病关节炎(p<0.001)、年轻骨关节炎(p<0.001)和类风湿性关节炎(p<0.01)患者观察到最大差异(图11)。

讨论

在该研究中，发明人已经证明CPa9-HNE测定在技术上是稳健的，作为尤其用于检测IBD、COPD、IPF、SCLC、NSCLC、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病关节炎和骨关节炎以及评估疾病活动度的基于血清的测定，具有生物学和临床相关性。此外，本发明人已经证明CPa9-HNE测定对患有转移性黑色素瘤的患者具有预后价值。

如表3所示，包含钙防卫蛋白片段(NBH-222)的CPa9-HNE在4℃下在血清中稳定最少48小时，这也意指在血清和血浆中这种包含新表位的片段具有比完整钙防卫蛋白长得多的半衰期，完整钙防卫蛋白在血浆中具有的半衰期仅为5小时⁹，尽管已证明其在粪便中稳定7天¹。这可能解释了粪便钙防卫蛋白测定在应用于血清/血浆时临床适用性差的原因，其测定性能与CRP相似^10-12。CPa9-HNE片段在血清中的高稳定性(在4℃下最少48小时)可以通过它是钙防卫蛋白的降解产物/代谢物，使该片段对进一步降解更具抵抗力这一事实来解释。另外，CPa9-HNE测定也比粪便钙防卫蛋白测定更灵敏，因为它测量的是纳克/mL而不是微克/克²⁷。

钙防卫蛋白结合金属离子例如钙和锌离子的能力使其对金属蛋白酶(MMP)降解具有高度抵抗力，因为MMP需要锌离子才能激活。HNE是一种丝氨酸蛋白酶并且不需要被金属离子激活，并且它因此能够降解钙防卫蛋白并生成包含钙防卫蛋白片段的HNE衍生的新表位^5,28–30。因此，CPa9-HNE水平可以代表局部组织炎症，因为包含CPa9-HNE的片段仅由活化的中性粒细胞和其他活化的白细胞并且仅在HNE的存在下生成。这与完整钙防卫蛋白形成对比，完整钙防卫蛋白可以由未活化的循环白细胞并且在一定程度上由也表达钙防卫蛋白的上皮细胞随机释放到循环和粪便中^10,31,32。

CPa9-HNE被证明在CD和UC患者的血清中非常丰富，表明作为辅助诊断IBD的替代生物标志物具有很高的潜力。这与粪便钙防卫蛋白一致，因为这种生物标志物可以可靠地区分IBS和IBD患者^6–8。此外，CPa9-HNE还与CD和UC的粪便钙防卫蛋白、中性粒细胞计数和疾病活动度相关，表明CPa9-HNE可以用于监测疾病活动度，并且可以作为内窥镜评估CD和UC的替代生物标志物。

CPa9-HNE测定还阐明了与健康对照相比，患有肺病COPD和IPF的患者之间存在显著差异。CPa9-HNE测定测量由中性粒细胞弹性蛋白酶生成的钙防卫蛋白上的特定切割位点。因此，这些结果表明NE在这些肺病中具有更高的活性。

基于血清CPa9-HNE的基线(治疗前)浓度，CPa9-HNE测定也被证明预测了用抗PD-1疗法治疗的患有转移性黑色素瘤患者的总生存率和无进展生存率。

最后，CPa9-HNE还示出与健康对照相比在肺癌患者(SCLC和NSCLC二者)的血清中，以及与健康对照相比在类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病关节炎和骨关节炎患者的血清中显著升高。

结论

CPa9-HNE ELISA被证明对于以体外切割样品和人IBD血清样品二者中的新表位具有高度特异性，是HNE介导的钙防卫蛋白降解的新血清生物标志物。CPa9-HNE与CD和UC患者高度相关，并表现出区分IBD患者与健康供体的高诊断准确性。此外，CPa9-HNE还与CD和UC的内窥镜疾病活动度(分别为SES-CD和MES)相关。CPa9-HNE还与UC的临床疾病活动度评分(部分Mayo评分以及Trulove和Witts评分)相关。因此，CPa9-HNE是CD和UC的疾病活动度的替代生物标志物，并且其表现至少与粪便-CP一样好或略好。因此，CPa9-HNE是一种新的临床相关生物标志物，用于IBD诊断和检测疾病活动，以及还有包括以下项的其他炎症驱动的疾病，疾病包括类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、干燥综合征和狼疮。其也可用于预测或监测治疗功效，例如在TNF-α、维多组单抗(vedolizumab)和乌司奴单抗(ustekinumab)前瞻性研究中。

此外，CPa9-HNE已被证明是肺疾病诸如COPD和IP、转移性疾病诸如转移性黑色素瘤以及肺癌诸如SCLC和NSCLC的临床相关生物标志物。

在本说明书中，除非另有明确说明，否则词语“或”的含义是当满足所述条件的任一者或两者时返回真值的算符，而不是算符“异或”，后者要求只满足其中一个条件。如本文所用，词语“包括(comprising)”意指“包括(including)”或“由……组成”。本文承认的所有在先前教导通过援引并入本文。

参考文献

1.

AG.,Fagerhol MK.,Aadland E.,et al.Assessment of theneutrophil dominating protein calprotectin in feces.A methodologicstudy.Scand J Gastroenterol 1992；27(9):793–8.Doi:10.3109/00365529209011186.

2.Stephan JR.,Nolan EM.Calcium-induced tetramerization and zincchelation shield human calprotectin from degradation by host and bacterialextracellular proteases.Chem Sci 2016；7(3):1962–75.Doi:10.1039/c5sc03287c.

3.Levine AP.,Segal AW.What Is wrong with granulocytes in inflammatorybowel diseases.Dig Dis 2013；31:321–7.Doi:10.1159/000354686.

4.Geboes K.Histopathology of Crohn’s Disease and UlcerativeColitis.Inflammatory Bowel Disease,vol.18.2003.p.255–76.

5.Wéra O.,Lancellotti P.,Oury C.The Dual Role of Neutrophils inInflammatory Bowel Diseases.J Clin Med 2016；5(12):118.Doi:10.3390/jcm5120118.

6.Gionchetti P.,Dignass A.,Danese S.,et al.3rd European evidence-based consensus on the diagnosis and management of Crohn’s disease 2016:Part2:Surgical management and special situations.J Crohn’s Colitis 2017；11(2):135–49.Doi:10.1093/ecco-jcc/jjw169.

7.Schoepfer AM.,Trummler M.,Seeholzer P.,et al.Discriminating IBDfrom IBS:comparison of the test performance of fecal markers,bloodleukocytes,CRP,and IBD antibodies.Inflamm Bowel Dis 2008；14(1):32–9.Doi:10.1002/ibd.20275.

8.Chang M-H.,Chou J-W.,Chen S-M.,et al.Faecal calprotectin as a novelbiomarker for differentiating between inflammatory bowel disease andirritable bowel syndrome.Mol Med Rep 2014；10(1):522–6.Doi:10.3892/mmr.2014.2180.

9.Hammer HB.,

Fagerhol MK.,et al.Calprotectin(a majorleucocyte protein)is strongly and independently correlated with jointinflammation and damage in rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis 2007；66(8):1093–7.Doi:10.1136/ard.2006.064741.

10.Kopi TA.,Shahrokh S.,Mirzaei A.,et al.The role of serumcalprotectin as a novel biomarker in inflammatory bowel diseases:A reviewstudy.Gastroenterol Hepatol from Bed to Bench 2019；12(3):183–9.Doi:10.22037/ghfbb.v12i3.1591.

11.Meuwis MA.,Vernier-Massouille G.,Grimaud JC.,et al.Serumcalprotectin as a biomarker for Crohn’s disease.J Crohn’s Colitis 2013；7(12):e678–83.Doi:10.1016/j.crohns.2013.06.008.

12.McCann RK.,Smith K.,Gaya DR.Aprospective single centre pilotevaluation of a serum calprotectin assay in unselected GI patients.ClinBiochem 2017；50(9):533–6.Doi:10.1016/j.clinbiochem.2017.01.006.

13.Carlsen K.,Malham M.,Hansen LF.,et al.Serum Calprotectin inAdolescents With Inflammatory Bowel Disease—A Pilot Investigation.J PediatrGastroenterol Nutr 2019；68(5).

14.Malham M.,Carlsen K.,Riis L.,et al.Plasma calprotectin is superiorto serum calprotectin as a biomarker of intestinal inflammation in ulcerativeColitis.Scand J Gastroenterol 2019；54(10):1214–9.Doi:10.1080/00365521.2019.1665097.

15.Kalla R.,Kennedy NA.,Ventham NT.,et al.Serum Calprotectin:A NovelDiagnostic and Prognostic Marker in Inflammatory Bowel Diseases.Am JGastroenterol 2016；111(12).

16.Kirov S.,Sasson A.,Zhang C.,et al.Degradation of the extracellularmatrix is part of the pathology of ulcerative colitis.Mol Omi 2019；15(1):67–76.Doi:10.1039/c8mo00239h.

17.Urban CF.,Ermert D.,Schmid M.,et al.Neutrophil Extracellular TrapsContain Calprotectin,a Cytosolic Protein Complex Involved in Host Defenseagainst Candida albicans 2009；5(10).Doi:10.1371/journal.ppat.1000639.

18.Mortensen JH.,Manon-Jensen T.,Jensen MD.,et al.Ulcerative colitis,Crohn’s disease,and irritable bowel syndrome have different profiles ofextracellular matrix turnover,which also reflects disease activity in Crohn’sdisease.PLoS One 2017；12(10):1–16.Doi:10.1371/journal.pone.0185855.

19.Kristensen JH.,Karsdal MA.,Sand JM.,et al.Serological assessmentof neutrophil elastase activity on elastin during lung ECM remodeling.BMCPulm Med 2015；15(1):53.Doi:10.1186/s12890-015-0048-5.

20.Magro F.,Gionchetti P.,Eliakim R.,et al.Third European Evidence-based Consensus on Diagnosis and Management of Ulcerative Colitis Part 1:Definitions,Diagnosis,Extra-intestinal Manifestations,Pregnancy,Cancer,Surveillance,Surgery,and Ileo-anal Pouch Disorders.J Crohn’s Colitis 2017:1–115.Doi:10.1093/ecco-jcc/jjx008.

21.Mortensen JH.,Godskesen LE.,Jensen MD.,et al.Fragments ofCitrullinated and MMP-degraded Vimentin and MMP-degraded Type III CollagenAre Novel Serological Biomarkers to Differentiate Crohn’s Disease fromUlcerative Colitis.J Crohn’s Colitis 2015:jjv123.Doi:10.1093/ecco-jcc/jjv123.

22.van Haaften WT.,Mortensen JH.,Karsdal MA.,et al.Misbalance in typeIII collagen formation/degradation as a novel serological biomarker forpenetrating(Montreal B3)Crohn’s disease.Aliment Pharmacol Ther 2017；(August2016).Doi:10.1111/apt.14092.

23.Goffin L.,Fagagnini S.,Vicari A.,et al.Anti-MMP-9 Antibody:APromising Therapeutic Strategy for Treatment of Inflammatory Bowel DiseaseComplications with Fibrosis.Inflamm Bowel Dis 2016；22(9):2041–57.Doi:10.1097/MIB.0000000000000863.

24.Lindholm M.,Manon-Jensen T.,Madsen GI.,et al.Extracellular MatrixFragments of the Basement Membrane and the Interstitial Matrix AreSerological Markers of Intestinal Tissue Remodeling and Disease Activity inDextran Sulfate Sodium Colitis.Dig Dis Sci 2019.Doi:10.1007/s10620-019-05676-6.

25.Mortensen JH.,Lindholm M.,Langholm LL.,et al.The intestinal tissuehomeostasis–the role of extracellular matrix remodeling in inflammatory boweldisease.Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2019；00(00):1–17.Doi:10.1080/17474124.2019.1673729.

26.Lobatón T.,Bessissow T.,De Hertogh G.,et al.The Modified MayoEndoscopic Score(MMES):A New Index for the Assessment of Extension andSeverity of Endoscopic Activity in Ulcerative Colitis Patients.J CrohnsColitis 2015；9(10):846–52.Doi:10.1093/ecco-jcc/jjv111.

27.Labaere D.,Smismans A.,Van Olmen A.,et al.Comparison of sixdifferent calprotectin assays for the assessment of inflammatory boweldisease.United Eur Gastroenterol J 2014；2(1):30–7.Doi:10.1177/2050640613518201.

28.

The Role of Neutrophil Elastase in ChronicInflammation.Am J Respir Crit Care Med 1994；150(6_pt_2):S114–7.Doi:10.1164/ajrccm/150.6_Pt_2.S114.

29.Alfakry H.,Malle E.,Koyani CN.,et al.Neutrophil proteolyticactivation cascades:a possible mechanistic link between chronic periodontitisand coronary heart disease.Innate Immun 2016；22(1):85–99.Doi:10.1177/1753425915617521.

30.Gouni-Berthold I.Neutrophil-elastase in chronic inflammatory boweldisease:A marker of disease activity？Hepatogastroenterology 1999；46(28):2315–20.

31.Fukunaga S.,Kuwaki K.,Mitsuyama K.,et al.Detection of calprotectinin inflammatory bowel disease:Fecal and serum levels and immunohistochemicallocalization.Int J Mol Med 2017:107–18.Doi:10.3892/ijmm.2017.3244.

32.Tardif MR.,Chapeton-Montes JA.,Posvandzic A.,et al.Secretion ofS100A8,S100A9,and S100A12 by Neutrophils Involves Reactive Oxygen Species andPotassium Efflux.J Immunol Res 2015；2015.Doi:10.1155/2015/296149.

33.Kabat,E.A.,T.T.Wu,H.M.Perry,K.S.Gottesman and C.Foeller(1987),Sequences of Proteins of Immunological Interest,United States Department ofHealth and Human Services,Bethesda,Md.,p.1

34.Martinez FJ,Collard HR,Pardo A,Raghu G,Richeldi L,Selman M,SwigrisJJ,Taniguchi H,Wells AU.Idiopathic pulmonary fibrosis.Nat Rev DisPrimers.2017 Oct 20；3:17074.doi:10.1038/nrdp.2017.74.PMID:29052582.

35.Sand JM,Martinez G,Midjord AK,Karsdal MA,Leeming DJ,LangeP.Characterization of serological neo-epitope biomarkers reflecting collagenremodeling in clinically stable chronic obstructive pulmonary disease.ClinBiochem.2016 Oct；49(15):1144-1151.doi:10.1016/j.clinbiochem.2016.09.003.Epub2016 Sep 7.PMID:27614218.

36.Jasper AE,McIver WJ,Sapey E,Walton GM.Understanding the role ofneutrophils in chronic inflammatory airway disease.F1000Res.2019；8:F1000Faculty Rev-557.Published 2019 Apr 26.doi:10.12688/f1000research.18411.1

37.Obayashi Y,Yamadori I,Fujita J,Yoshinouchi T,Ueda N,Takahara J.Therole of neutrophils in the pathogenesis of idiopathic pulmonaryfibrosis.Chest.1997 Nov 5；112(5):1338-43.doi:10.1378/chest.112.5.1338.PMID:9367478.

38.Hoskin TS,Crowther JM,Cheung J,et al.Oxidative cross-linking ofcalprotectin occurs in vivo,altering its structure and susceptibility toproteolysis.Redox Biol.2019；24:101202.doi:10.1016/j.redox.2019.101202

39.Greten FR,Grivennikov SI.Inflammation and Cancer:Triggers,Mechanisms,and Consequences.Immunity.2019 Jul 16；51(1):27-41.doi:10.1016/j.immuni.2019.06.025.PMID:31315034；PMCID:PMC6831096。

序列表

<110> 北欧生物科技公司(NORDIC BIOSCIENCE A/S)

<120> 钙防卫蛋白测定

<130> PPI22172138GB

<150> GB2100902.2

<151> 2021-01-22

<150> GB2007087.6

<151> 2020-05-13

<160> 37

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu

1 5 10 15

Val

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys

1 5 10 15

Val

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys

1 5 10 15

Val Ile

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Glu His Ile Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His

1 5 10 15

Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro

20 25

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Tyr Arg Asp Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu

1 5

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln

1 5 10

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Leu Asn Asp His Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Asp His Val Ile Asn

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

Phe Ala Tyr

1

<210> 19

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

20 25 30

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser

35 40 45

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu

50 55 60

Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Asn Asp His Ser Tyr Pro Tyr Thr

65 70 75 80

<210> 20

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

Asp His Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu

1 5 10 15

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu

20 25 30

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr

35 40 45

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

50 55 60

Phe Cys Ala Trp Phe Ala Tyr

65 70

<210> 21

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Asn

85 90 95

Asp His Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

100 105 110

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> 10

<223> Gln被生物素化，任选地经由接头

<400> 23

Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln

1 5 10

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> 13

<223> Cys与钥孔血兰蛋白结合

<400> 24

Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln Gly Gly Cys

1 5 10

<210> 25

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asp His Val Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly

130 135 140

Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys

145 150 155 160

Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu

195 200 205

Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr

225 230 235 240

Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp

275 280 285

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

290 295 300

Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp

355 360 365

Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile

370 375 380

Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn

385 390 395 400

Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys

420 425 430

Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu

435 440 445

Ser His Ser Pro Gly Lys

450

<210> 26

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Ala Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Leu Asn Asp His Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys

145 150 155 160

Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile

165 170 175

Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln

180 185 190

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr

195 200 205

Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His

210 215 220

Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235 240

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> 11

<223> Lys被生物素化

<400> 27

Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln Lys

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu

1 5 10

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Glu His Ile Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser

1 5 10 15

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 30

Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile

1 5 10

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 31

Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu

1 5 10 15

<210> 32

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 32

His Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys

1 5 10 15

Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro

20

<210> 33

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 33

Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His

1 5 10 15

His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly Thr Pro

20 25

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 34

His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly

1 5 10 15

Glu Gly Thr Pro

20

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 35

Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser

1 5 10

<210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 36

Ser His Glu Lys Met His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His

1 5 10 15

Lys Pro Gly

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 37

Ile Asp Val Tyr His Lys Tyr Ser Leu Ile

1 5 10

Claims

1.一种用于检测HNE生成的钙防卫蛋白片段的免疫测定方法，所述方法包括使人生物流体样品与单克隆抗体接触,所述单克隆抗体特异性识别并结合由所述HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列组成的HNE生成的新表位，以及检测所述单克隆抗体与所述样品中的肽之间的结合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测是定量的，并且其中，所述方法进一步包括确定所述单克隆抗体与所述样品中的肽之间的结合量。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法是用于在患者中检测和/或监测疾病的进展和/或确定疾病的状态或严重程度的免疫测定方法，其中，所述疾病是以炎症为特征或表现出炎症的疾病，所述方法包括使获自所述患者的生物流体样品与所述单克隆抗体接触，检测并确定所述单克隆抗体与所述样品中的肽之间的结合量，以及将所述结合量与和正常健康受试者相关的值和/或与和疾病的已知状态或严重程度相关的值和/或与在先前时间点从所述患者获得的值和/或与预定截止值相关联。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述疾病是炎症驱动的疾病。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述疾病是炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或特发性肺纤维化(IPF)。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述疾病是癌症。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述疾病是转移性黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述单克隆抗体是针对包括所述N末端或C末端序列的合成肽产生的单克隆抗体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述单克隆抗体特异性识别并结合选自以下HNE生成的钙防卫蛋白片段之一的肽的N末端或C末端序列：

KLGHPDTLNQGEFKELV(SEQ ID NO:1)

RKDLQNFLKKENKNEKV(SEQ ID NO:2)

RKDLQNFLKKENKNEKVI(SEQ ID NO:3)

EHIMEDLDTNADKQL(SEQ ID NO:4)

SHEKMHEGDEGPGHHHKPGLGEGTP(SEQ ID NO:5)

YRDDLKKLLET(SEQ ID NO:6)

WFKELDINTDGAV(SEQ ID NO:7)。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述单克隆抗体特异性识别并结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(SEQ ID NO:1)的N末端或C末端序列。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述单克隆抗体特异性识别并结合所述HNE生成的钙防卫蛋白片段的所述N末端序列，并且不会特异性识别或结合所述N末端氨基酸序列的N延伸的延长形式或所述N末端氨基酸序列的N截短的缩短形式。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生物流体样品是血浆或血清。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定是竞争免疫测定。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。

16.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性识别并结合由HNE生成的钙防卫蛋白片段的N末端或C末端序列组成的HNE生成的新表位。

17.根据权利要求16所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体是针对包括所述N末端或C末端序列的合成肽产生的单克隆抗体。

18.根据权利要求16或17所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体特异性识别并结合选自以下HNE生成的钙防卫蛋白片段之一的肽的N末端或C末端序列：

KLGHPDTLNQGEFKELV(SEQ ID NO:1)

RKDLQNFLKKENKNEKV(SEQ ID NO:2)

RKDLQNFLKKENKNEKVI(SEQ ID NO:3)

EHIMEDLDTNADKQL(SEQ ID NO:4)

SHEKMHEGDEGPGHHHKPGLGEGTP(SEQ ID NO:5)

YRDDLKKLLET(SEQ ID NO:6)

WFKELDINTDGAV(SEQ ID NO:7)。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体特异性识别并结合肽KLGHPDTLNQGEFKELV(SEQ ID NO:1)的N末端或C末端序列。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体特异性识别并结合所述HNE生成的钙防卫蛋白片段的所述N末端序列，并且不会特异性识别或结合所述N末端氨基酸序列的N延伸的延长形式或所述N末端氨基酸序列的N截短的缩短形式。

21.一种免疫测定试剂盒，所述免疫测定试剂盒包括根据权利要求16至20中任一项所述的单克隆抗体，以及以下中的至少一种：

-链霉亲和素包被的孔板

-包括与生物素连接的所述N末端或C末端序列的生物素化肽

-用于夹心法免疫测定的第二抗体

-包括所述N末端或C末端序列的校准肽

-抗体生物素化试剂盒

-抗体HRP标记试剂盒

-抗体放射性标记试剂盒。

22.根据权利要求21所述的测定试剂盒，其中，所述免疫测定试剂盒包括根据权利要求16至20中任一项所述的单克隆抗体，以及以下中的一种、两种或全部：

-链霉亲和素包被的孔板

-包括与生物素连接的所述N末端或C末端序列的生物素化肽

-包括所述N末端或C末端序列的校准肽。