CN115820502A - 一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物新材料技术领域，尤其涉及一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备及其应用。本发明所述木驹形杆菌，拉丁文名为Komagataeibacter hansenii；保藏编号为CCTCC NO：M2022186。本发明还涉及该伤口敷料的制备以及该伤口敷料在使用时具有促凝血及抑菌的效果。应用于体外创伤的伤口止血、抑菌、愈合等医疗领域。

Description

一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备及其应用

技术领域

本发明涉及生物新材料技术领域，尤其涉及一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备及其应用。

背景技术

临床上使用的传统敷料主要是医用脱脂棉纱布、棉垫和凡士林纱布等，具有简单保护、防止感染的功能。然而，传统敷料无法保持伤口湿润，导致伤口愈合迟缓；敷料纤维使用时有异物感，容易与创面新生肉芽组织结合导致创面的疤痕产生，同时因为剥离困难导致患者痛苦。

细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)是某些细菌合成的由葡萄糖单体分子以β-1，4-糖苷键聚合而成的高分子生物胞外多糖。除了具有优良的生物相容性和生物可降解性外，还具有纳米网状结构，高纯度、高抗张强度以及高持水性等独特性质。

黄连(C.chinensis)是常见的抗菌消炎中药，临床上长期用于抗肠道细菌感染、降热镇痛，也是最常见的中药材料之一。现代医学证明，其特殊的药理性质主要与其根茎中所含生物碱相关，其中主要包括小檗碱、黄连碱、等多种生物碱。

本发明要解决传统伤口敷料因为生物相容性差导致伤口容易粘连、愈合慢、伤口凝血困难等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑菌、止血新型复合伤口敷料，用于体外创伤的伤口止血、抑菌、愈合等医疗领域。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株木驹形杆菌，拉丁文名为Komagataeibacter hansenii；保藏编号为CCTCC NO：M2022186。

本发明还提供了木驹形杆菌产细菌纤维素的过程。

本发明进一步提供了一种抑菌、止血新型复合伤口敷料，包括所述细菌纤维素和黄连。

优选地，所述细菌纤维素为木驹形杆菌发酵物。

优选地，所述黄连为黄连水提物。

优选地，所述黄连水提物的规格为15～25：1。

优选地，所述黄连水提物的质量分数为10～70％。

优选地，所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将木驹形杆菌接种至培养基中，培养，灭菌，得细菌纤维素；

(2)将步骤(1)得到的细菌纤维素与黄连水提物混合。

优选地，所述HS培养基包括：1～3％葡萄糖，0.2～0.8％酵母提取物，0.2～0.8％胰蛋白胨，0.24～0.31％磷酸氢二钠和0.112～0.118％柠檬酸，余量为水。

优选地，所述培养的温度为25～35℃，所述培养的pH为6～7，所述培养的时间为4～11d。

优选地，所述灭菌是将木驹形杆菌发酵物与NaOH溶液混合后高压灭菌，所述高压灭菌的温度为118～124℃，所述高压灭菌的时间为15～25min。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明所体现的促凝血、止血特性来源于复合材料中的黄连提取物，而目前还没有研究证明黄连提取物有促凝血、止血的功效，而在本研究中细菌纤维素-黄连提取物复合材料展现出了优异的促凝血特性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为BC-50％黄连提取物复合材料(BC-CC5)的形态，a：湿膜；b：干膜；

图2为BC-黄连提取物复合材料的SEM图像，a：BC；b：黄连提取物；c-f：负载10％、30％、50％和70％黄连提取物的BC；

图3为BC-黄连提取物复合材料的FT-IR；

图4为BC-黄连提取物复合材料对三种细菌的抑菌性，a：金黄色葡萄球菌；b：铜绿假单胞菌；c：大肠杆菌；Standard drug：磺胺嘧啶银乳膏；

图5为BC-黄连提取物复合材料的促凝血(全凝血)指数。

生物保藏说明

木驹形杆菌，拉丁文名为Komagataeibacter hansenii；

该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学；保藏时间为：2022.03.03；保藏编号为CCTCC NO：M2022186。

具体实施方式

本发明提供了一种木驹形杆菌，拉丁文名为Komagataeibacter hansenii；保藏编号为CCTCC NO：M2022186。

本发明还提供了木驹形杆菌产细菌纤维素的应用。

本发明进一步提供了一种抑菌、止血新型复合伤口敷料，包括所述细菌纤维素和黄连。

在本发明中，所述细菌纤维素为木驹形杆菌发酵物。

在本发明中，所述黄连优选为黄连水提物。

在本发明中，所述黄连水提物的规格为15～25：1；优选为17～23：1；进一步优选为19～21：1；更优选为20：1。

在本发明中，所述黄连水提物的质量分数为10～70％；优选为30～70％；进一步优选为30～60％；更优选为50％。

在本发明中，所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备方法为将木驹形杆菌接种至培养基中，培养，灭菌，得细菌纤维素；将得到的细菌纤维素与黄连水提物混合。

在本发明中，所述HS培养基包括：1～3％葡萄糖，0.2～0.8％酵母提取物，0.2～0.8％胰蛋白胨，0.24～0.31％磷酸氢二钠和0.112～0.118％柠檬酸，余量为水；优选为1.3～2.7％葡萄糖，0.3～0.7％酵母提取物，0.3～0.7％胰蛋白胨，0.26～0.29％磷酸氢二钠和0.113～0.117％柠檬酸，余量为水；进一步优选为1.7～2.3％葡萄糖，0.4～0.6％酵母提取物，0.4～0.6％胰蛋白胨，0.26～0.27％磷酸氢二钠和0.114～0.116％柠檬酸，余量为水；更优选为2％葡萄糖，0.5％酵母提取物，0.5％胰蛋白胨，0.28％磷酸氢二钠和0.115％柠檬酸，余量为水。

在本发明中，所述培养的温度为25～35℃；优选为27～33℃；进一步优选为29～31℃；更优选为30℃。

在本发明中，所述培养的pH为6～7；优选为6.1～6.9；进一步优选为6.3～6.7；更优选为6.5。

在本发明中，所述培养的时间为4～11d；优选为5～10d；进一步优选为7～9d；更优选为8d。

在本发明中，所述灭菌是将木驹形杆菌发酵物与NaOH溶液混合后高压灭菌。

在本发明中，所述高压灭菌的温度为118～124℃；优选为119～123℃；进一步优选为120～122℃；更优选为121℃。

在本发明中，所述高压灭菌的时间为15～25min；优选为17～23min；进一步优选为19～21min；更优选为20min；

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

BC-黄连提取物复合材料制备

将木驹形杆菌Komagataeibacter hansenii单菌落用接种环挑至HS培养基中，该培养基的主要成分包括2％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.27％(w/v)磷酸氢二钠和0.115％(w/v)柠檬酸。培养温度为30℃、pH值为6.5，培养状态为静置培养，培养时间是7天。用镊子菌液中的气液交汇处白色薄膜(BC)取出，浸入1％(w/v)NaOH水溶液高压灭菌(121℃，20min)后取出备用。

实施例1的复细菌纤维素-黄连提取物合材料的制备方法：

分别将BC薄膜加入制备的10％、30％、50％、70％黄连提取物水溶液，在37℃、180rpm震荡24h，得到细菌纤维素-黄连提取物复合材料BC-CC1，BC-CC3，BC-CC5，BC-CC7。BC-CC5湿膜与干膜下的形态如图1所示。

实施例2

BC-黄连提取物复合材料的表征

复合材料的SEM表征：

将实施例1得到的冻干的BC-黄连提取物固定到靶台的导电胶上，在喷金器里面真空喷金1分钟后用于SEM测定。在电压10kV下观察复合材料的微观形貌与纤维结构。结果如图2，2a是BC，呈现规则的网状纤维结构，2b是是黄连提取物，呈不规则块状，图2c、d、e、f分别是BC-CC1、BC-CC3、BC-CC5、BC-CC7复合材料的SEM电镜图，黄连提取物均匀分布在细菌纤维素网状结构的孔隙中，证明黄连提取物被成功载到细菌纤维素中。

实施例3

复合材料的FT-IR表征：

将实施例1得到的细菌纤维素、BC-黄连提取物复合材料冷冻干燥至衡重(恒重)后，取出放入研钵中，按1：50的比例加入干燥的溴化钾后一起研磨，使用压片机压2min，成片后对样品的化学结构进行FT-IR测试。测试条件：扫描范围为4500～400cm^-1，分辨率为2或4cm^-1，扫描次数为32或64次。结果如图3所示，BC-黄连提取物复合材料几乎保留了细菌纤维素的所有特征峰：3348，2897，1639，1162，1060cm^-1等，3347cm^-1处强吸收峰代表O-H的伸缩振动峰，它是由纤维素分子间的氢键所引起的；在2894cm^-1处的吸收峰是由C-H基团的伸缩振动峰引起；在1626cm^-1处代表了纤维素中葡萄糖羰基(C-O)的特征吸收峰，而1164cm^-1则表示了C-O-C官能团的振动峰；而在1800～1000cm^-1范围内，BC-黄连提取物复合材料谱图中既保留了细菌纤维素的特征峰，又显现黄连主要成分盐酸小檗碱(黄连素)的几乎全部特征峰，包括：1603，1567，1508，1482，1387，1233，1103cm^-1等。再次印证黄连提取物被成功载入到BC。

实施例4

BC-黄连提取物复合材料的应用

BC-黄连提取物复合材料的抑菌性：

将实施例1得到的BC-黄连提取物复合材料作抑菌性检验(琼脂扩散法)：制备本实施方式的直径为6mm的圆盘状各浓度细菌纤维素-黄连提取物复合材料，磺胺嘧啶银乳膏(市售的抑菌性烧伤敷料)作为阳性对照，BC膜作为阴性对照；将圆盘状BC-黄连提取物复合材料、阴性及阳性对照组圆片贴到包含铜绿假单胞菌，大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的LB固体培养基上，隔夜培养，观察并记录圆片周围的抑菌圈直径。结果如图4和表1所示，BC对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌均没有抑制作用，各浓度BC-黄连提取物复合材料对铜绿假单胞菌也没有抑制作用，但对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，BC-CC3对金黄色葡萄球菌的抑菌性最大，达到了12.38±1.3mm。各浓度BC-黄连提取物复合材料对大肠杆菌的抑制效果并不显著，最大浓度BC-CC7对大肠杆菌的抑菌圈直径只有8.7±0.7mm。说明细菌纤维素-黄连提取物复合材料对革兰氏阳性菌有更好的抑制效果。

表1BC-黄连提取物复合材料的抑菌圈统计

实施例5

BC-黄连提取物复合材料的促凝血特性检验(全血凝实验)：

将尺寸为2cm×2cm的BC、各浓度BC-黄连提取物复合材料、具有凝血效果的明胶海绵(阳性药)分别放置在一次性培养皿中，加热至37℃保持10min。

添加100μL含抗凝剂枸橼酸钠的SD大鼠血液(体积比9：1)和10μL 0.2MCaCl₂在每个材料中心，培养皿在37℃放置10min。之后分别向培养皿中加入25μL蒸馏水，在37℃、30rpm摇动10min。在摇动过程中，未凝结成凝块且未粘附在材料上的红细胞用蒸馏水溶血。

将以上步骤中的血红蛋白溶液用移液枪吸100μL到48孔板中，用酶标仪在波长541nm处测量血红蛋白溶液的吸光度OD值并换算成Abs值。BCI值越低，表明止血敷料的止血性能越好。结果如图6所示：BC的BCI值约为77％，各浓度BC-黄连提取物复合材料BCI值由低到高分别约为52％、47％、64％、95％，而明胶海绵的BCI值约为63％。说明低浓度的BC-黄连提取物具有比阳性对照组更好的促凝血特性，而BC-30％黄连提取物的促凝血效果最好。

实施例6

将实施例1得到的BC-黄连提取物复合材料作促凝血特性检验(体外凝血实验)：

分别称取50mgBC、明胶海绵(阳性对照组)和50mg各浓度BC-黄连提取物复合材料置于24孔板中，于37℃水浴加热5min后，依次向24孔板各孔加入0.50mL抗凝兔血和0.1mL0.2mol/L氯化钙溶液。每隔15s倾斜孔板，观察血液的凝固的程度，直至血液不流动为止，记录凝血时间。其中，空白对照组不加止血材料，只加入氯化钙溶液，阳性对照组加入相同体积的明胶海绵和氯化钙溶液。测试时，每组材料重复3次平行实验并取平均值。结果表明各浓度BC-黄连提取物复合材料的凝血效果均优于明胶海绵(表2)，其中BC-CC3的体外凝血时间最短，只需要3.5±0.38min。BC则不表现凝血效果，结果与先前全血凝实验一致。

表2BC-黄连提取物复合材料的凝血与止血时间统计

实施例7

将实施例1得到的BC-黄连提取物复合材料作促凝血特性检验(大鼠体内断尾止血实验)：

将麻醉后的SD大鼠尾巴尖端5cm处用手术刀将尾巴切断，用滤纸吸去第一滴流出的血液，并将1cm×1cm大小的各浓度BC-黄连提取物复合材料、明胶海绵(阳性对照组)、BC覆盖于伤口处，设置空白对照组。大鼠尾巴滴血测试使用滤纸计数，计时开始每后每隔30s更换滤纸，并观察出血状况，当没有血液滴到滤纸上时，即为止血完毕，记录出血时间。结果如表2所示，各浓度BC-黄连提取物止血效果均优于明胶海绵，其中BC-CC3的止血速度最快，只需要2.5±0.23min。细菌纤维素不具备止血效果。这也印证了全血凝试验与体外凝血试验的结果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株木驹形杆菌，拉丁文名为Komagataeibacterhansenii；保藏编号为CCTCCNO：M2022186。

2.权利要求1所述木驹形杆菌产细菌纤维素的应用。

3.一种抑菌、止血新型复合伤口敷料，其特征在于，包括细菌纤维素和黄连。

4.根据权利要求3所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料，其特征在于，所述细菌纤维素为木驹形杆菌发酵产物。

5.根据权利要求3所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料，其特征在于，所述黄连为黄连水提物；所述黄连水提物的规格为15～25：1。

6.根据权利要求3所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料，其特征在于，所述黄连水提物的质量分数为10～70％。

7.权利要求2～6任一项所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将木驹形杆菌接种至培养基中，培养，灭菌，得细菌纤维素；

(2)将步骤(1)得到的细菌纤维素与黄连水提物混合。

8.根据权利要求7所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备方法，其特征在于，所述HS培养基包括：1～3％葡萄糖，0.2～0.8％酵母提取物，0.2～0.8％胰蛋白胨，0.24～0.31％磷酸氢二钠和0.112～0.118％柠檬酸，余量为水。

9.根据权利要求7所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为25～35℃，所述培养的pH为6～7，所述培养的时间为4～11d。

10.根据权利要求7所述的一种抑菌、止血新型复合伤口敷料的制备方法，其特征在于，所述灭菌是将木驹形杆菌发酵物与NaOH溶液混合后高压灭菌，所述高压灭菌的温度为118～124℃，所述高压灭菌的时间为15～25min。

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