CN115820476A

CN115820476A - 一株德氏乳杆菌及其应用

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Publication number: CN115820476A
Application number: CN202211372665.6A
Authority: CN
Inventors: 廖梅香
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-11-03
Also published as: CN115820476B

Abstract

本发明公开了一株德氏乳杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，该菌株被命名为ProfMIC‑229，已于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221352的德氏乳杆菌。实验表明，ProfMIC‑229具有抗衰老、提升皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一株德氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物的技术领域，具体地涉及一株德氏乳杆菌及其应用。

背景技术

光老化是皮肤外在老化最主要的形式，而导致皮肤光老化的主要原因就是紫外线辐射。皮肤在老化的过程中，细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分随着皮肤衰老而显着减少。此外，多种因素如线粒体损伤、炎症反应等产生的活性氧增加，使得氧化应激增加，老化受损细胞无法及时清除，从而导致了皮肤衰老。在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，清除细胞内受损的蛋白质和脂质，修复DNA，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用。另外，减少细胞凋亡，降低细胞炎症，增加细胞外基质的合成以及减少其降解，提升细胞的抗氧化能力等都已被证实能够减缓皮肤细胞衰老，寻求多层次多维度的抗衰老物质是目前的研究热点。

皮肤微生物在皮肤免疫的成熟和稳态中发挥着重要作用，大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生，最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达。皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白也可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。研究表明，皮肤微生态的变化与银屑病、特应性皮炎、痤疮和慢性伤口等多种炎症性和感染性疾病的发生和发展相关。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供了一株德氏乳杆菌及其应用。

本发明的其一目的是提供了德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，该菌株被命名为ProfMIC-229，已于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221352的德氏乳杆菌。

较佳地，采样于传统雪莲菌发酵牛奶，将该样品处理后在生理盐水中震荡混匀，取上清液划线于MRS固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-229；

在革兰氏染色镜检下菌株ProfMIC-229革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成白色、表面光滑不透明的圆形菌落，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

本发明的另一目的是提供了上述德氏乳杆菌在制备改善肌肤状况的产品中的应用，其中，所述改善肌肤状况包括抗衰老、提升皮肤抗菌能力中的至少一种。

一些实施方案中，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因由COL1A1、COL13A1、SPTSSA、TIMP1、SMAD3、MKX、LN、FN中的至少一种组成。

一些实施方案中，所述抗衰老为上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达、上调细胞自噬相关基因LC3B的表达或上调免疫调节因子相关基因MOR的表达中的其中一种。

一些实施方案中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因由P38MAPK、MMP家族中的至少一种组成。

一些实施方案中，所述抗衰老为下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因由BAX、Caspase家族中的至少一种组成。

一些实施方案中，所述提升皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB1和/或LL-37的表达。

本发明的再一目的是提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述德氏乳杆菌原料制成。

一些实施方案中，所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的德氏乳杆菌包括如下所示的至少一种：

(1)德氏乳杆菌的活菌和/或灭活菌；

(2)德氏乳杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。

本发明公开的德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)ProfMIC-229，其保藏编号为CCTCC No:M 20221352的德氏乳杆菌。实验表明，ProfMIC-229具有抗衰老、提升皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

生物保藏说明

德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)ProfMIC-229，于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC No:M 20221352。

具体实施方式

本发明提供了德氏乳杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的德氏乳杆菌菌株ProfMIC-229，采样于传统雪莲菌发酵牛奶，经16S rDNA鉴定为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。

进一步，本发明提供的德氏乳杆菌ProfMIC-229在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液、灭活菌体。

体外细胞实验表明，本发明的德氏乳杆菌ProfMIC-229具有上调HaCaT细胞外基质相关的I型胶原蛋白α链基因COL1A1，丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA，组织金属蛋白酶抑制物I基因TIMP1，信号转导蛋白基因SMAD3，以及细胞自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3β基因LC3B表达的作用，基因相对表达倍数1.16～1.71。

体外细胞实验表明，本发明的德氏乳杆菌ProfMIC-229具有上调HFF细胞外基质相关的层粘连蛋白LN、纤维连接蛋白FN，I型胶原蛋白α链基因COL1A1，类胶原膜蛋白13α链基因COL13A1，丝氨酸棕榈酰转移酶基因SPTSSA，莫霍克蛋白MKX，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因MOR，以及抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2表达的作用，基因相对表达倍数1.13～2.83；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的BCL2-Associated X蛋白基因BAX和半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，基因相对表达倍数0.24～0.80。

体外细胞实验表明，本发明的德氏乳杆菌ProfMIC-229具有上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB1和LL-37表达的作用，基因相对表达倍数1.25～3.60。

本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：ProfMIC-229的分离

从传统雪莲菌发酵牛奶中采样；将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清液划线于MRS固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-229。

革兰氏染色镜检：菌株ProfMIC-229为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2：ProfMIC-229的核酸鉴定

1、16S rDNA基因序列分析：

挑取单菌落置MRS液体培养基中，37℃培养过夜后，12000r/min转速离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出ProfMIC-229菌株为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)。

实施例3：ProfMIC-229调节光老化HaCaT细胞外基质/细胞自噬/炎症因子相关基因表达实验

1、ProfMIC-229上清液及灭活菌体制备：

挑取德氏乳杆菌ProfMIC-229单菌落于MRS液体培养基，37℃培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀＝0.2，121℃，30min、0.28Mpa灭活，12000r/min转速离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量PBS重悬，稀释调整OD₆₀₀＝0.2，为灭活菌体。

2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm²的紫外线UVB照射损伤。

3、ProfMIC-229添加

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因COL1A1、SPTSSA、TIMP1、SMAD3，细胞自噬相关基因LC3B的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F＝2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验＝CT_实验-CT_{内参(实验)}；

△CT_对照＝CT_对照-CT_{内参(对照)}；

△△CT＝△CT_实验-△CT_对照。

上清液上调细胞外基质相关基因COL1A1、SPTSSA和TIMP1，细胞自噬相关基因LC3B。结果见下表：

灭活菌体上调细胞外基质基因COL1A1和SMAD3。结果见下表：

结果显示加入ProfMIC-229具有促进HaCaT细胞外基质合成、促进细胞自噬的抗衰老作用。

实施例4：ProfMIC-229调节氧化损伤HFF细胞外基质/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因表达实验

1、ProfMIC-229上清液及灭活菌体制备：

制备方法参照实施例3。

2、HFF细胞制备及H₂O₂诱导氧化损伤

将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H₂O₂进行刺激，37℃静置1h。

3、ProfMIC-229添加

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)。每组3平行，37℃培养过夜。

4、qPCR法检测细胞外基质/免疫调节因子/抑制细胞凋亡/降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因LN、FN、COL1A1、COL13A1、MKX和SPTSSA，免疫调节因子相关基因MOR，抑制细胞凋亡相关基因BCL-2；以及降解细胞外基质相关基因MMP家族和P38MAPK，细胞凋亡相关基因BAX和Caspase家族基因的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液上调细胞外基质相关基因LN、FN、COL1A1和COL13A1，免疫调节因子相关基因MOR；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族和P38MAPK，细胞凋亡相关基因BAX和Caspase家族。结果见下表：

灭活菌体上调细胞外基质相关基因LN、MKX和SPTSSA，抑制凋亡基因相关基因BCL-2；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因BAX。结果见下表：

结果显示加入ProfMIC-229具有促进HFF细胞外基质合成、增加细胞免疫调节因子、减少细胞凋亡、减少细胞外基质降解的抗衰老作用。

实施例5：ProfMIC-229上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验

1、ProfMIC-229上清液及灭活菌体的制备：

制备方法参照实施例3。

2、HaCaT细胞制备

将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×10⁵细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。

3、ProfMIC-229添加及LPS刺激

将上清液5％(V/V)、灭活菌体10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞中(对照组分别以等体积PBS替代上清液/灭活菌体)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。

4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数

将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、DEFB1和LL-37基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

上清液上调抗菌肽基因S100A7和S100A8，结果见下表：

灭活菌体上调抗菌肽基因S100A7、S100A8、DEFB1和LL-37，结果见下表：

结果显示ProfMIC-229具有促进抗菌肽基因表达的作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，该菌株被命名为ProfMIC-229，已于2022年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221352的德氏乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的德氏乳杆菌，其特征在于，采样于传统雪莲菌发酵牛奶，将该样品处理后在生理盐水中震荡混匀，取上清液划线于MRS固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ProfMIC-229；

3.权利要求1～2任一项所述的德氏乳杆菌在制备改善肌肤状况的产品中的应用，其中，所述改善肌肤状况包括抗衰老、提升皮肤抗菌能力中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因由COL1A1、COL13A1、SPTSSA、TIMP1、SMAD3、MKX、LN、FN中的至少一种组成。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达、上调细胞自噬相关基因LC3B的表达或上调免疫调节因子相关基因MOR的表达中的其中一种。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因由P38MAPK、MMP家族MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP10中的至少一种组成。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因由BAX、Caspase家族Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9中的至少一种组成。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提升皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB1和/或LL-37的表达。

9.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，由包括权利要求1～2任一项所述的德氏乳杆菌原料制成。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的德氏乳杆菌包括如下所示的至少一种：

(1)德氏乳杆菌的活菌和/或灭活菌；

(2)德氏乳杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。