CN115806895A - 嗜酸乳杆菌tw01菌株及其益生菌组合物与用途 - Google Patents
嗜酸乳杆菌tw01菌株及其益生菌组合物与用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115806895A CN115806895A CN202111085653.0A CN202111085653A CN115806895A CN 115806895 A CN115806895 A CN 115806895A CN 202111085653 A CN202111085653 A CN 202111085653A CN 115806895 A CN115806895 A CN 115806895A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus acidophilus
- strain
- test
- bacterial strain
- lactobacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 title claims abstract description 73
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 title claims abstract description 63
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 title claims abstract description 63
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 30
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 16
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002778 food additive Substances 0.000 claims description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 abstract description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 6
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 19
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000007413 intestinal health Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000001819 pancreatic juice Anatomy 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 2
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 241000866650 Lactobacillus paraplantarum Species 0.000 description 1
- 241000186684 Lactobacillus pentosus Species 0.000 description 1
- 241001468192 Leuconostoc citreum Species 0.000 description 1
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 1
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 239000003858 bile acid conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000007910 chewable tablet Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 230000010235 enterohepatic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007941 film coated tablet Substances 0.000 description 1
- 206010016766 flatulence Diseases 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 210000004258 portal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006190 sub-lingual tablet Substances 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
本发明是一种嗜酸乳杆菌株TW01及其组合物与用途，所使用的菌株源自于咖啡发酵液中分离。该嗜酸乳杆菌株TW01(L.acidophilus)，在耐酸与耐胆盐试验中，都显示有良好的耐受性，且对细胞激素的诱导能力佳，达到人体肠胃道菌相平衡的目标，其用途可以使用于人体肠胃道免疫调节功能的保健功效益生菌。
Description
技术领域
本发明是一种嗜酸乳杆菌株TW01及其组合物与用途，尤其是指一种由咖啡发酵液分离培养而成的乳杆菌株，该乳杆菌的菌株接种于Lactobacilli MRS broth(MRSB)，并于厌氧环境37℃以上，至少培养24小时后，置入冷冻柜中保存；再由冷冻柜中取出，进行二次活化，采集原始菌液，进行耐受性试验。其中，嗜酸乳杆菌株TW01(L.acidophilus)，本身具备耐酸以及耐胆盐的耐受性程度，均高于其他菌株，呈现良好的耐酸以及耐胆盐的特质，其用途可以运用于增强人体肠胃道免疫调节功能，有开发为保健功效益生菌的高效潜力。
背景技术
嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)是常见的益生菌菌种之一，是一种自然存在于人体体内的细菌，主要位于人体肠胃道中，其功能在于维持体内菌相平衡的环境，预防以及抑制有害细菌生长，避免有害细菌危害人体健康。嗜酸乳杆菌的生命周期都非常短暂，如果没有经过其他因素的破坏，其生命周期平均为五天，但是现代人生活压力大，导致饮食不正常，体内环境非常不利于嗜酸乳杆菌存活，因此会造成体内含量过低。为了改善此缺失，必须养成正常作息的习惯，培养适合嗜酸乳杆菌存活的体内环境，或者主动增加食用益生菌，由人体外部的补充，让嗜酸乳杆菌顺利抵达肠胃道，尤其可以停留于小肠的器官发挥功效，才可以调整体内机能，维持肠胃道的平衡。
人体肠道中，有超过一千种以上的细菌、霉菌、酵母菌等，其中，嗜酸乳杆菌就是对于人体有益的菌种，当外在压力或饮食习惯辛辣油腻造成体内负担，形成坏菌增多的体内环境，导致肠胃道菌丛不平衡，尤其是小肠坏菌增加，会造成腹泻、胀气等不适感，造成急性发炎性肠道疾病，或者肠道长期慢性发炎等病症。目前要改善肠道疾病最有效的方法，是以药物治疗为主，主要是服用消炎药、免疫调节剂、类固醇、抗生素等常用药物，但是药物服用过多，会造成药物成瘾，或者产生人体其他副作用，也有可能会诱发肠道微生物从药物分解出毒性产物，对人体造成负担，人类的肠道微生物，对于不同药物代谢的差异程度，都会造成医生用药的评估与压力。
其次，要改善肠道疾病的方法，是以定期定量服用嗜酸乳杆菌株及其组合物，该益生菌已长期安全广泛使用在食品制造过程，国内外掌管健康食品的政府机关部门，以及具备专业知识能力的人，都已透过检查其感染性、代谢活性、内生活性、药物动力学、致病性与致病力等实验，来确认其安全性，实验数据显示在健康的人身上，使用益生菌发生有害作用的报告几乎趋近于零。但是，目前业界所遇到的问题点在于，益生菌对酸碱值、温度、湿度、空气与光线等环境因素非常敏感，一旦做成制剂，活的菌落形成单位(CFU，colony-formingunit)的数量，就会随着益生菌菌种的自然生命周期而减少，为了要让益生菌有效，必须让益生菌能在胃肠道存活、丛生与复制，否则益生菌无法发挥既有的功效，或者原本既有的功效，会因为益生菌对于酸碱值的高度敏感性，而造成功效急速递减或完全灭失。
先前技术所遇到的困难，在于嗜酸乳杆菌存活率低落，在外在自然界环境或者内在人体肠道环境，都会受到酸碱值、温度、湿度、空气与光线等环境因素影响，该情况是嗜酸乳杆菌典型的先天特征，无法透过后天实验进行改善。因此，导致市售嗜酸乳杆菌产品成分与效用差异很大，相对而言，会直接影响到市场售价，甚至高单价的嗜酸乳杆菌产品，并不代表是高效用的保证，消费者不具备专业知识，很难辨识嗜酸乳杆菌是否为好的益生菌。实际上，嗜酸乳杆菌的效用，必须溯源到该嗜酸乳杆菌的菌株，该菌株本身是否具备有高度耐酸、耐胆盐的耐受性，可以顺利停留在小肠器官，是一个重要的指标，原因在于当食物进入小肠，小肠会刺激胆排出胆汁，而胰脏分泌胰液、小肠腺分泌肠液，胆汁与胰液。胆汁、胰液、小肠液呈强碱性可中和胃酸的强酸性，由此可知，良好的嗜酸乳杆菌特征，必须要有高度的耐酸、耐碱性，才能够顺利在小肠发挥功效。
嗜酸乳杆菌本身对于环境的敏感程度高，很容易因为所处的环境因素而大幅影响其效用，所以在源头培养并筛选高度具备耐酸、耐碱能力的嗜酸乳杆菌，是非常重要的实验过程，高度耐酸、耐碱的嗜酸乳杆菌，可以经由口中服用，顺利抵达肠道并且发挥效用，不受人体内部高酸碱度的影响，才是良好的嗜酸乳杆菌，此嗜酸乳杆菌可以运用于益生菌产品的制造。经由研究显示，益生菌剂量需要108CFU以上，才能增加益生菌在胃肠道生存与丛生到适合数量，如果未达108CFU，该益生菌的功效无法发挥，甚至无法达到菌种丛生的最低数量，无法达到既定的成效；倘若无法发挥功效，纵然每天定时定量服用具有嗜酸乳杆菌的保健产品，甚至加量服用，其成效也会无法彰显，其效用等同于没有服用。
发明内容
有鉴于先前技术的缺失，以及先前技术所面临的困难，本发明内容着重于培养以及筛选具备高度耐酸、耐胆盐的嗜酸乳杆菌TW01，并且将该菌株运用在肠道健康与免疫调节功能的保健食品。本发明的嗜酸乳杆菌TW01，所使用的菌株自咖啡发酵液中分离，该咖啡发酵液是由台湾古坑咖啡渣进行发酵处理，再由其咖啡发酵液进行分离，所取得的特定菌株。
本发明的嗜酸乳杆菌TW01，为德国DSMZ(全称为Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，即德国微生物菌种保藏中心)保藏编号为DSM 33990的生物保藏材料，保藏日期为2021年8月2日，名称为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus TW01，该嗜酸乳杆菌TW01特征在于有良好的耐受性，尤其在耐酸以及耐胆盐的试验中，有显著的良好存活反应，其中，该菌株对于细胞激素的诱导能力佳，本身具备高效潜力可以开发为肠道健康与免疫调节功能的益生菌产品。
本发明的嗜酸乳杆菌TW01，所使用的菌株自咖啡发酵液中分离，该菌种的分离与初步筛选，是以生理食盐水依照序列稀释，并涂抹于培养基上，需要于厌氧环境中37℃以上，至少培养24小时，再进行初步筛选、染色，并且完成实验菌株的纯化培养。
在菌种耐酸性测试中，因为乳杆菌的存活率易受pH值影响，特别是在pH3以下会对菌体产生最大伤害，所以在相关研究中，乳杆菌的耐酸性实验，是最重要第一阶段应完成的试验，目的在于乳杆菌的菌体对于酸性环境的耐受度，以pH3的体外试验进行乳杆菌的耐酸的研究，结果如图1所示。
本发明的用途在于将该嗜酸乳杆菌TW01，运用于保健肠道的益生菌产品，在肠道中会有胆盐(又称为胆汁酸盐)，原因在于胆盐会排入肠道，被肠道重吸收，重吸收的胆盐，经门脉系统入肝，弥补肝细胞合成胆汁酸能力的不足，经由肝细胞重新摄取，转化为结合型胆汁酸再次排入肠道，于是形成肠肝循环。由此可知，在菌种耐胆盐测试中，是第二阶段应完成的试验，才可以知悉本发明的嗜酸乳杆菌TW01是否具备耐胆盐的特性。
胆盐在消化系统中，具有界面活性剂的特性，该特性对于微生物而言，是一种抑制生长的因子。本实验以0.3％胆盐进行体外胆盐耐受性试验，结果如图1所示，除了K1-2的耐受性较差，大多菌株对0.3％胆盐具有一定程度的耐受性，经240分钟0.3％胆盐溶液反应后，菌株存活量都至少有105CFU/mL以上。
最后，益生菌对于细胞激素影响的测定，以数组测试乳杆菌是否能刺激分化的RAW264.7细胞产生MIL-10、MIL-12p40为专题，进行乳杆菌培养与筛选，并且配置不同乳杆菌样品或LPS，依组别加入孔盘中，也在阴性对照组(negative control)中加入100ul的培养基作为空白对照组，所进行的实验，其收集的样品显示，以酶联免疫吸附分析法Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，分析其细胞激素MIL-10、MIL-12p40。ELISA是常用的一种分子生物检测技术，其特点在于只需要少量样品(100ul)即可进行检测，精准度与敏感性高。
在细胞激素诱导实验中，将巨噬细胞分别加入L.plantarum(F3-4)、L.rhamnosus(S2-1)、L.acidophilus(B-1)、L.rhamnosus(D-1)等菌株，经历24或48小时的培养，测定细胞激素IL-10及IL-12的浓度，并计算IL-10及IL-12的比值，藉此初步筛选具有免疫功效潜力的应用菌株。由图9、图10可知悉，菌株B(L.acidophilus)的浓度最高，以显著性高于其他菌株，也高于LPS所诱导的浓度，显示菌株B为最佳的试验结果，具备高度耐胆盐的耐受性，可以在高浓度的胆盐中具备高存活率，本发明的嗜酸乳杆菌TW01及其组合物，可以运用在肠道益生菌以及免疫调节功能产品的开发与生产。
附图说明
图1为本发明的乳杆菌株肠胃道耐性试验结果。
图2为本发明的菌种鉴定结果。
图3为本发明的F2-2菌株16S rRNA gene sequences鉴定结果。
图4为本发明的F3-4菌株16S rRNA gene sequences鉴定结果。
图5为本发明的S2-1菌株16S rRNA gene sequences鉴定结果。
图6为本发明的K1-2菌株16S rRNA gene sequences鉴定结果。
图7为本发明的B-1菌株16S rRNA gene sequences鉴定结果。
图8为本发明的D-1菌株16S rRNA gene sequences鉴定结果。
图9为本发明的不同益生菌对诱导细胞激素IL-10(A)的结果。
图10为本发明的不同益生菌对诱导细胞激素IL-12(B)的结果。
具体实施方式
本发明的嗜酸乳杆菌TW01，是一种耐酸、耐胆盐的益生菌株，命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus TW01，已于2021年8月2日保藏于德国DSMZ(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，其保藏编号是DSM 33990，德国DSMZ的地址是Inhoffenstraβe 7B，38124 Braunschweig，GERMANY。该菌株有其独特性与新颖性，可以广泛运用在肠道益生菌产品，因此名称当中特别注明TW01，意指中国台湾第一株具有高度耐酸、耐胆盐的嗜酸乳杆菌TW01，也是益生菌株的一种。
本发明经由体外实验，证实本发明的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillusacidophilus TW01)、其代谢产物、以及经由细胞激素诱导试验，藉此筛选具有免疫功效的应用菌株，显示本发明的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)、其代谢产物，于酸性与胆盐性的环境中，都有良好的耐受性，可用于制备肠道益生菌组合物的用途，该组合物是一医药品，或一保健食品，或一食品，经由口服方式给予一个体，在肠道发生功效。
依据本发明，有关细菌培养的操作程序与参数条件、有关混合物的化学分离、化学结构分析的操作程序与参数条件，是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。本文中所使用的，用语“代谢产物”意为培养细菌时，经该细菌代谢后所分泌至细菌培养液中的物质，包含培养该菌的培养液。
本发明所使用的菌株F2-2、F3-4、S2-1、K1-2、B-1、D-1，皆自咖啡发酵液中分离，实验中所使用的药品Ox-bile dehydrated,purified、Sodium chloride、Glycerol购自Sigma-Aldrich；Agar、Lactobacilli MRS broth、Tryptic soy broth购自Difco；厌氧产气包、API 50 CHL检验试剂盒购自启新生物科技公司。
在菌种分离的步骤，以拍击式均质器(铁胃机)，将原料均质后，秤取所需样品量，以生理食盐水进行序列稀释，并且取0.1mL稀释液，涂抹于Lactobacilli MRS agar(MRSA)培养基上，完成后于厌氧环境下37℃以上，培养至少72小时。
在菌种筛选的步骤，第一步骤，以菌体显微特征观察，将菌种制作成抹片，并且以光学显微镜，进行400至1000倍放大观察其菌体特征，形状、外部构造；第二步骤，以格兰氏染色(Gram stain)，进行菌种的鉴别，将菌体制成抹片后，依结晶紫、碘液、95％乙醇、番红的顺序进行格兰氏染色，并于光学显微镜下观察染色结果，即可完成菌种初步筛选的行为。
在实验菌株的纯化培养步骤，自菌种分离的培养皿中，依据菌落外观挑选数个单一菌落(colony)，于MRSA培养基上，进行画线分离，并置入37℃以上厌氧培养箱中，培养至少72小时，培养完成后，再自培养基上挑选单一菌落，进行画线分离，至新的MRSA培养基上，重复2次，得到纯菌株。
在菌株保存的步骤，第一步骤，是乳杆菌株的保存，将乳杆菌菌株接种于Lactobacilli MRS broth(MRSB)，并且于厌氧环境下37℃以上，培养至少24小时，将培养液离心(1200g、10分钟)分离出菌体，去除上清液后，以无菌生理食盐水悬浮并再次离心(1200g、10分钟)分离，以去除残留的培养基，重复2次后，将菌体悬浮于冻存液(无菌甘油与MRSB以1：1比例混合)后，吸取2ml于冷冻小管中，置于-80℃冷冻柜中保存；第二步骤，菌株的活化，将-80℃冷冻柜中的冷冻小管取出后置入37℃水域槽中回温，取100μL接种于50mLMRSB中，于厌氧环境下37℃以上，培养至少24小时，再进行二次活化，为实验用原始菌液。
在耐受性测试的步骤，第一步骤，测试菌液配置，将实验用原始菌液，离心(1200g、10分钟)分离出菌体，去除上清液后，以无菌生理食盐水悬浮并再次离心(1200g、10分钟)分离，以去除残留的培养基，重复2次后，以生理食盐水回溶至菌液浓度大约108CFU/mL，即为测试菌液。
第二步骤，进入耐酸性测试，以5N盐酸溶液及0.1N无菌氢氧化钠溶液，将生理食盐水调整至pH 2.0、pH 3.0，此即为耐酸性测试溶液。取试验菌液1mL，加入1.5mL无菌生理食盐水，再加入5mL耐酸性测试溶液，于37℃以上，培养至少30与60分钟后，采样并进行乳杆菌菌数分析，以log CFU/mL表示。
第三步骤，进入耐胆盐测试，以无菌生理食盐水中加入0.3％、0.5％(w/v)牛胆汁(Ox-bile dehydrated,purified)，并且以0.1N无菌氢氧化钠溶液调整至pH 8.0，制备成模拟胆盐溶液。取试验菌液1mL，加入1.5mL无菌生理食盐水，再加入5mL模拟胆盐溶液，于37℃以上，培养至少240分钟后，采样并进行乳杆菌菌数分析，以log CFU/mL表示。存活率以Log最终菌数/Log起始菌数×100％表示。
在菌种鉴定的方式，第一种方式，采用API试剂盒，使用的试剂盒为API 50 CHL，将实验用原始菌液离心(1200g,10分钟)分离出菌体，去除上清液后，以无菌生理食盐水悬浮并再次离心(1200g,10分钟)分离，以去除残留的培养基，重复2次后，以生理食盐水回溶至菌液浓度大约6X10^10CFU/mL。取此菌液0.1mL分别加入10mL API 50CHL Medium中，即为API测试菌液。再培养盒中加入10mL无菌水将API测试条放入盒中，并于测试条中的50个测试孔内注入API测试菌液，并以无菌矿物油密封各个测试孔。放入35℃以上培养箱培养，并于至少24、48小时观察结果并记录。由此实验结果与API web数据库进行比对，得知菌种鉴定结果。
第二种方式，采用16S rRNA鉴定，取测试菌液1mL至2mL至eppendorf中，离心并去除上清液，加入萃取液，并震荡混合后静置10分钟。吸取上清液至新的eppendorf中，另外配置100倍稀释液于另一eppendorf中，并加入引子及dNTP，以用于PCR反应。经多次循环后离心分离产物并纯化，跑胶后切取16S rRNA所在位置并进行定序。
在益生菌对细胞激素影响的测定中，测试乳杆菌S2-1、F3-4、B-1、D-1是否能刺激分化的RAW264.7细胞产生MIL-10、MIL-12 p40。将RAW264.7细胞从平板刮下，离心后以培养基回溶并计数细胞浓度，配置成6.25×105cell/孔；400μl/孔，依组别种入孔盘中(400μ1/孔)。第二天，配置不同乳杆菌样品或LPS，各取100及200pg/mL，依组别加入孔盘中(100μ1/孔)，并在阴性控制组(negative control)中加入100ul的培养基，作为空白对照组。培养至少24小时或48小时后，在倒立荧光显微镜下观察，并且将上清液以10000rpm离心10分钟，取上清液至-20℃冻存备用。取24小时及48小时收集的样品，以ELISA分析其细胞激素MIL-10、MIL-12 p40，绘制成图表后得出图9及图10所示的结果。
由实验结果得知，本发明嗜酸乳杆菌TW01，自8种原料样品中，筛选出28株发酵菌株，经初步筛选后，选出F2-2、F3-4、S2-1、B-1、D-1、K1-2等6株菌株进行试验，其外观皆属于白色圆顶菌落，菌体显微观察皆属于球菌至杆菌，格兰氏染色结果均为阳性，触媒反应为阴性，皆符合乳杆菌的基本特征。
由耐酸性实验结果得知，乳杆菌的存活率，非常容易受pH值影响，特别是在pH3以下，会对菌体产生最大伤害。在相关研究中，大多以pH3的体外试验进行乳杆菌的耐酸的研究，结果如图1所示，经初步筛选的6株菌株与对照菌株，在对pH 2耐酸性测试溶液的表现上，均不甚理想，在30分钟时，大多数菌株存活量皆下降了4～5个log值，在反应60分钟后，F2-2、S2-1、D-1等菌株已经完全死亡，其余3株则具有较佳的低pH值耐性。其中，表现最好的菌株为F3-4，其在30分钟时，存活量的表现不如B-1，然而在60分钟时，存活量仍能保持在103CFU/mL以上，耐酸能力明显高于其他菌株。
由耐胆盐实验结果得知，胆盐在消化系统中，具有界面活性剂的特性，对微生物而言，是一种抑制生长的因子。本发明的耐胆盐实验，是以0.3％胆盐进行体外胆盐耐受性试验，结果如图1所示，除了K1-2的耐受性较差，大多菌株对0.3％胆盐，具有一定程度的耐受性，经240分钟0.3％胆盐溶液反应后，菌株存活量都至少有105CFU/mL以上。
由菌种鉴定的结果得知，本发明使用API 50 CHL试剂盒进行菌种的鉴定，鉴定结果如图2所示，6株菌株皆属于Lactobacillus属，分别为Lactobacillus pentosus(F2-2)与L.plantarum(F3-4)、L.rhamnosus(S2-1)、L.rhamnosus(K1-2)、L.acidophilus(B-1)、L.rhamnosus(D-1)。
在使用API试剂盒初步鉴定后，再采用16S rRNA gene sequences鉴定，定序结果经NCBI Blest比对结果(图3至图8)，发现F2-2、F3-4、K1-2三株比对结果，与API试验不同，分别为Leuconostoc mesenteroides(F2-2)、L.citreum(K1-2)、L.paraplantarum(F3-4)。由于菌种的生化特性，会因分离来源不同而有所差异，而16S rRNA gene sequences鉴定，是利用微生物基因中的保守片段进行鉴定，较API具有可回溯性，因此将16S rRNA genesequences鉴定结果视为最终鉴定结果。
由细胞激素测定的结果得知，细胞激素诱导试验，是将巨噬细胞RAW 264.7培养至浓度6.25×105cell/孔后，分别加入100或200pg/mL的L.plantarum(F3-4)、L.rhamnosus(S2-1)、L.acidophilus(B-1)、L.rhamnosus(D-1)等菌株，共培养至少24或48小时，测定细胞激素IL-10及IL-12的浓度，并计算IL-10及IL-12的比值，藉此初步筛选具有免疫功效潜力的应用菌株。
由图9、图10可得而知，菌株B(L.acidophilus)不管是浓度100或200pg/mL所提升IL-10的浓度最高，该显著性高于其他菌株，也高于LPS所诱导的浓度，而共培养至少48小时后，会略低于24小时的诱导浓度。而在IL-12的诱导结果，与IL-10有类似的结果，菌株B(L.acidophilus)可诱导最高的IL-12浓度，在24小时与48小时的情况，都没有显著性差异，而菌株D(L.rhamnosus)虽然在IL-10与IL-12都低于菌株B(L.acidophilus)，但仍显著性高于菌株F(L.plantarum)与S(L.rhamnosus)。
综上所述，显示菌株B在耐酸与耐胆盐试验中，都显示良好的耐受性，且对细胞激素的诱导能力最佳，该菌株(L.acidophilus)具有开发为肠道健康与免疫调节功能的保健功效益生菌潜力；本发明的嗜酸乳杆菌株TW01及其组合物，其用途得与一医药品、或一保健食品，或一食品结合制成药锭、粉末、食品等产品。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者，所详知的技术，而被制造成一适合于经肠道投药的剂型，这包括，但不限于：锭剂、咀嚼锭、膜衣锭、口溶锭、舌下锭、胶囊、缓释口服剂型、肠溶口服剂型、粉末、溶液、注射品、外部制剂(external preparation)以及类似之物。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。食品产品的种类，这包括，但不限于：饮料、发酵乳、酸奶、发酵食品、烘培产品、健康食品以及膳食补充品、营养补充品。
【生物材料保藏】
保藏编号：DSM 33990
保藏日期：2021/08/02
保藏机构：德国DSMZ-德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
保藏机构地址：德国布伦瑞克因霍芬大街7B,38124(Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，GERMANY)。
Claims (10)
1.一种嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，保藏于德国DSMZ，全称为Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，其保藏编号为DSM 33990。
2.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，其中所述嗜酸乳杆菌的菌体属球菌至杆菌，外观属白色圆顶菌落。
3.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，能够经受耐酸性测试至少30分钟且具有存活量，所述的耐酸性测试，是将PH 2.0到PH 3.0之间的溶液与所述菌株结合，培养在37℃以上的环境。
4.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，能够经受耐胆盐测试至少240分钟且具有存活量，所述的耐胆盐测试，是将PH 8.0到PH 9.0之间的溶液与所述菌株结合，培养在37℃以上的环境。
5.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，是以一筛选方法获得，所述筛选方法包括：采集菌体并提供至一培养基中，培养在37℃以上的环境，至少72小时，重复数次，得到若干纯菌株；将所述若干纯菌株分别先后经受耐酸性测试及耐胆盐测试，观察筛选出具存活量的纯菌株，其中所述的耐酸性测试，是将PH 2.0到PH3.0之间的溶液与所述菌株结合，培养在37℃以上的环境至少30分钟，其中所述的耐胆盐测试，是将PH 8.0到PH 9.0之间的溶液与所述菌株结合，培养在37℃以上的环境至少240分钟。
6.如权利要求5所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，其中的菌体采集自咖啡发酵液。
7.一种益生菌组合物，包含如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillusacidophilus TW01)菌株。
8.如权利要求7所述的益生菌组合物，所述益生菌组合物为医药品、食品或食品添加物。
9.一种如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株的用途，用以制备益生菌组合物。
10.如权利要求9所述的嗜酸乳杆菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株的用途，所述益生菌组合物为医药品、食品或食品添加物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111085653.0A CN115806895B (zh) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 嗜酸乳杆菌tw01菌株及其益生菌组合物与用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111085653.0A CN115806895B (zh) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 嗜酸乳杆菌tw01菌株及其益生菌组合物与用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115806895A true CN115806895A (zh) | 2023-03-17 |
| CN115806895B CN115806895B (zh) | 2024-11-26 |
Family
ID=85482266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111085653.0A Active CN115806895B (zh) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 嗜酸乳杆菌tw01菌株及其益生菌组合物与用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115806895B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101139558A (zh) * | 2006-09-07 | 2008-03-12 | 内蒙古农业大学 | 一种嗜酸乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用 |
| CN101333506A (zh) * | 2007-06-29 | 2008-12-31 | 内蒙古农业大学 | 一种嗜酸乳杆菌及其抗氧化活性的应用 |
| CN102212495A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-10-12 | 北京龙科方舟生物工程技术中心 | 一株嗜酸乳杆菌及其应用 |
-
2021
- 2021-09-16 CN CN202111085653.0A patent/CN115806895B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101139558A (zh) * | 2006-09-07 | 2008-03-12 | 内蒙古农业大学 | 一种嗜酸乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用 |
| CN101333506A (zh) * | 2007-06-29 | 2008-12-31 | 内蒙古农业大学 | 一种嗜酸乳杆菌及其抗氧化活性的应用 |
| CN102212495A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-10-12 | 北京龙科方舟生物工程技术中心 | 一株嗜酸乳杆菌及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115806895B (zh) | 2024-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114317320B (zh) | 一种短双歧杆菌207-1及其应用 | |
| JP4022777B2 (ja) | コレステロールを低下および同化する能力を有する酸および胆汁酸塩耐性のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株 | |
| RU2661102C2 (ru) | Штамм lactobacillus crispatus для лечения или профилактики половых и урогенитальных инфекций, таких как вагиноз и кандидоз, и его применение | |
| US20130280789A1 (en) | Isolation, identification and characterisation of strains with probiotic activity, from faeces of infants fed exclusively with breast milk | |
| RU2758109C2 (ru) | Бактерия lactobacillus rhamnosus для лечения, например, бактериального вагиноза | |
| CN114480229A (zh) | 一种动物双歧杆菌乳亚种菌株wkb148及其产品与应用 | |
| AU2020103929A4 (en) | Bacillus coagulans strain BACO-17 with high germination rate in the intestines and its uses for promoting gastrointestinal health | |
| CN117448243B (zh) | 一株具有益生功能且能增强免疫的嗜粘蛋白阿克曼氏菌Akk007及其应用与保健品 | |
| CN117327608A (zh) | 鼠李糖乳杆菌菌株及其用途 | |
| KR20220164034A (ko) | 장내 세균총 개선용 조성물 | |
| CN117917475B (zh) | 一种调节肠道菌群的植物乳植杆菌p16及其应用、产品和方法 | |
| CN105420150A (zh) | 一种嗜酸乳杆菌及其应用 | |
| WO2025039454A1 (zh) | 可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌msjk0025及其应用 | |
| CN106544287A (zh) | 一株具有抗氧化能力及产细菌素的德式乳杆菌 | |
| EP2742125B1 (en) | New strain of l. bulgaricus capable of inhibiting the adhesion of h. pylori strains to epithelial cells | |
| TWI788840B (zh) | 嗜酸乳桿菌ｔｗ０１菌株及其益生菌組合物與用途 | |
| CN117683670A (zh) | 一种植物乳植杆菌fmbl l23036 cnn、酸奶发酵剂、酸奶及其应用 | |
| CN117327604A (zh) | 包含鼠李糖乳杆菌菌株的活菌制剂及其用途 | |
| Watanabe et al. | Cholesterol-lowering effects of Lactobacillus brevis isolated from turnip “tsuda kabu” | |
| CN115806895A (zh) | 嗜酸乳杆菌tw01菌株及其益生菌组合物与用途 | |
| CN117323349A (zh) | 包含鼠李糖乳杆菌菌株的组合物及其用途 | |
| TWI764295B (zh) | 加氏乳桿菌tci943或其代謝產物及其用於改善肌膚狀況的用途 | |
| Tezel et al. | Selection criteria for identifying putative probiont | |
| TW201809263A (zh) | 具免疫調節機能的植物乳桿菌及其用途 | |
| Majumder et al. | The Influence of Asparagus on the Growth of Probiotic Bacteria in Orange Juice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |