CN115806595A - 非洲猪瘟病毒检测用重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒检测用重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用。所述重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。所述制备方法包括：将如SEQ ID No:2所示的编码基因克隆入原核表达载体后，转化感受态细胞，诱导表达转化后的所述感受态细胞，获得所述重组抗原蛋白；其中，所述原核表达载体为pET28a(+)载体，所述感受态细胞为大肠杆菌。所述试剂盒包括ELISA反应液和抗体检测板，且所述抗体检测板上包被有上述所述的重组抗原蛋白。通过上述技术方案，达到了表达量高，特异性强，亲和力高，检测成本低，能够特异性地快速实现对非洲猪瘟病毒病毒的检测的效果。

Description

非洲猪瘟病毒检测用重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂 盒和应用

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体地，涉及非洲猪瘟病毒检测用重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种烈性、高度致死性的出血性传染病，以高热、皮肤充血及血液动力学改变(出血、水肿、腹水和休克)为特征，发病率和死亡率高。各品种的家猪、非洲和欧亚野猪均可感染ASFV。世界动物卫生组织(OIE)将非洲猪瘟列为法定报告动物疫病，中国也将其列为一类动物疫病。1921年全球首次报道了发生于1910年肯尼亚的非洲猪瘟疫情。1957年非洲猪瘟传播到葡萄牙最终于1960年到达西班牙，在那里该病一直流行，直到1996年被根除。非洲猪瘟在欧洲其他地方(1964年、1976年和1977年的法国、1967年和1980年的意大利、马耳他1978年至今、撒丁岛是1978年、比利时是1985年、还有1986年的荷兰)，加勒比海(1978年的多米尼加共和国、1979年的海地、1977年至1980年的古巴)，以及南美洲(1978年巴西)呈零星爆发态势。疾病爆发后是通过严密的检疫和扑杀来控制的，而代价往往非常高昂。中国在2018年8月3日首次报道非洲猪瘟感染后半年内，该病便蔓延至河南、江苏等31个省份，疫情几乎波及整个中国，造成直接经济损失达数百亿元，对我国生猪产业造成极大损失。对受感染的畜群进行快速而准确的检测能更有效的进行紧急疾病管理和减少整体经济损失。快速、精确的检测ASFV是一种有效的疫情防控手段，对控制该病至关重要。目前的诊断方法包括检测传染性病毒、病毒抗原、特异性抗体和用PCR检测基因组DNA等。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种表达量高，特异性强，亲和力高，检测成本低，能够特异性地快速实现对非洲猪瘟病毒病毒的检测的非洲猪瘟病毒检测用重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒检测用重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

优选地，所述重组抗原蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

本发明还提供了一种如上述所述的重组抗原蛋白的制备方法，所述制备方法包括：将如SEQ ID No:2所示的编码基因克隆入原核表达载体后，转化感受态细胞，诱导表达转化后的所述感受态细胞，获得所述重组抗原蛋白；其中，

所述原核表达载体为pET28a(+)载体，所述感受态细胞为大肠杆菌。

优选地，诱导表达过程的诱导物为浓度为0.8-1.2mmol/L的IPTG水溶液；

诱导表达过程的条件为：温度为36.5-37.5℃，时间为4-8h。

优选地，所述制备方法还包括对获得的所述重组抗原蛋白进行纯化；其中，

所述纯化为采用Ni亲和层析柱进行纯化。

本发明还提供了一种非洲猪瘟病毒检测用试剂盒，所述试剂盒包括ELISA反应液和抗体检测板，且所述抗体检测板上包被有根据上述所述的重组抗原蛋白。

优选地，包被的所述重组抗原蛋白由重组抗原蛋白包涵体提供；且，

所述重组抗原蛋白包涵体包括所述重组抗原蛋白和包涵体抗原稀释液；其中，

所述包涵体抗原稀释液包括二硫苏糖醇、Triton X-100和CBS缓冲液，且，相对于100mL的CBS缓冲液，二硫苏糖醇的含量为0.8-1.2g，Triton X-100的含量为0.3-0.6mL。

优选地，所述ELISA反应液至少包括PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液和终止液。

优选地，所述封闭液包括脱脂奶粉和PBS缓冲液，且相对于100mL份的PBS缓冲液，脱脂奶粉的含量为2-4g；

所述酶标二抗为HRP标记的羊抗猪IgG稀释液。

本发明还提供了一种根据上述所述的检测用试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

优选地，所述应用具体包括：

S100、采用包涵体抗原稀释液和缓冲液混合后稀释并冻存所述重组抗原蛋白，得到冻存重组抗原蛋白，采用包被液稀释所述冻存重组抗原蛋白后包被过夜；

S200、将包被后的所述冻存重组抗原蛋白经封闭后，将ELISA反应液和待测样品加入混合显色后，读取在450nm波长处的吸光度值；

S300、根据获取的吸光度值进行结果的判定。

优选地，当待测样品D450≥0.353时，则待测样品为非洲猪瘟病毒阳性。

本发明选取非洲猪瘟病毒蛋白中抗原性较高区域的氨基酸，通过基因原核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物——重组抗原蛋白的间接ELISA方法，并进行条件优化，以便制备成商品化间接ELISA试剂盒。从而大大提高特异性检测效率，降低检测成本。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是预测的重组抗原蛋白三维结构；

图2是重组抗原蛋白的抗原表位预测；

图3是实施例1中用于表达重组抗原蛋白的表达菌株和对照菌株的SDS-PAGE电泳图；其中，M为分子量标记，1号条带为重组抗原蛋白表达菌株表达上清，2号条带为对照菌株表达上清，3号条带为重组抗原蛋白表达菌株表达沉淀，4号条带为对照菌株表达沉淀；

图4是实施例1中纯化后的重组抗原蛋白SDS-PAGE电泳图；其中，M为分子量标记，1号条带为重组抗原蛋白；

图5是验证例1中Western Blot法检测重组蛋白与非洲猪瘟阳性血清及阴性血清的反应原性结果图；其中，M为分子量标记，1号条带为非洲猪瘟病毒阳性血清；2号条带为非洲猪瘟病毒阴性血清；

图6是验证例3中采用ELISA法检测重组抗原蛋白特异性的试验结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。

实施例1、目的基因的原核表达及纯化(即重组抗原蛋白的制备)

合成经过密码子优化后的目的基因片段(如SEQ ID No:2所示的目的基因)并连接到原核表达载体[原核表达载体选用pET28a(+)]中，这一过程由擎科生物(南京)股份有限公司合成构建，得到含有目的基因片段的重组表达质粒，记为pET28a-KP177R。

将得到的pET28a-KP177R转入BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落，重组表达菌按1:1000比例接种于含有Kanamycin(30mg/L)抗生素的5mL的LB液体培养基中，培养的条件是37℃下震荡过夜。按1:100的比例条件将过夜培养的菌液接种于含有Kanamycin(30mg/L)抗生素的200mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h左右，按1:1000比例加入工作浓度为100mmol/L的IPTG，37℃震荡培养10h后收集菌液，表达产物的SDS-PAGE电泳结果如图3所示。将表达蛋白的菌以上述方法大量诱导，将用无菌PBS溶液清洗后的沉淀收集到一个离心管中，然后向其中加入30mL的Binding Buffer，使菌体重悬。将全部菌体重悬后，把菌液放置在冰盒中进行超声破碎，破碎的频率为超声5s后停止5s，观察菌悬液，待菌液由浑浊的状态变为澄清时，超声即可停止。将进行超声后的澄清菌液离心，条件为4℃条件下10000g，10min。离心后收集菌液的沉淀。前述收集的菌液沉淀用1.5mol/L尿素反复洗后，溶解到8mol/L尿素中，利用Ni-NTA His·Bind Resin亲合层析纯化重组抗原蛋白，纯化产物的SDS-PAGE电泳结果如图4所示。重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1，具体为：ValCys Lys Val Asp Lys Asp Cys Gly Ser Gly Glu His Cys Val Arg Gly Ser Cys SerSer Leu SerCys Leu Asp Ala Val Lys Met Asp Lys Arg Asn Ile Lys Ile Asp SerLys Ile SerSer Cys Glu Phe Thr Pro Asn Phe Tyr Arg Phe Thr Asp Thr Ala AlaAsp Glu GlnGln Glu Phe Gly Lys Thr Arg His Pro Ile Lys Ile Thr Pro Ser ProSer Glu Ser HisSer Pro Gln Glu Val Cys Glu Lys Tyr Cys Ser Trp Gly Thr AspAsp Cys Thr GlyTrp Glu Tyr Val Gly Asp Glu Lys Glu Gly Thr Cys Tyr Val TyrAsn Asn Pro HisHis Pro Val Leu Lys Tyr Gly Lys Asp His Ile Ile Ala Leu ProArg Asn His Lys HisAla。

实施例2、重组抗原蛋白包涵体的制备

1、包涵体抗原稀释液的配置：包涵体抗原稀释液为含1％DTT(二硫苏糖醇)和0.5％Triton X-100的CBS缓冲液(CBS缓冲液按照本领域技术人员能够理解和采用的方式进行制备，例如，将1.59g的Na₂CO₃，2.94gNaHCO₃加蒸馏水定容至1000mL；0.05M，pH9.6，4℃保存)。

2、包涵体抗原冻存：使用4倍稀释实施例1中得到的纯化后的含有溶剂的重组抗原蛋白液体(即，包涵体抗原稀释液与纯化后的含有溶剂的重组抗原蛋白液体按照4:1的体积比进行混合)，即得到包涵体抗原，将得到的包涵体抗原分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。需要注意的是，这里必须由少到多逐渐加入包涵体抗原稀释液，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。

3、包涵体抗原稀释及包被：取出包涵体抗原，4℃融化。使用CBS缓冲液加入稀释至重组抗原蛋白至5μg/mL(即，将含有CBS缓冲液的重组抗原蛋白稀释液命名为重组抗原蛋白包涵体，在1mL的重组抗原蛋白包涵体中，重组抗原蛋白的含量为5μg)，在ELISA板每孔加入50μL。而后置于4℃过夜。弃去孔内溶液，用PBST洗涤3次(洗涤方法：在ELISA孔中加350μL的PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次)。

进一步通过上述方式，将重组抗原蛋白制备成重组抗原蛋白包涵体，解决了因制备过程中含有高浓度尿素溶液，而使得重组抗原蛋白不易包被到ELISA板上的问题。进一步地，通过采用独特的包涵体抗原稀释液，解决了包涵体抗原不易包被到ELISA板上的难题。

实施例3、非洲猪瘟病毒的检测方法

向实施例2中经过PBST洗涤后的ELISA板中的每孔再加入封闭液，而后于37℃封闭后，再用洗涤液洗涤晾干后，得到抗体检测板。将用封闭液稀释后的非洲猪瘟病毒阴性血清或阳性血清分别加入各孔中，于37℃孵育后用洗涤液洗涤；将HRP标记的羊抗猪IgG二抗加入到各孔中37℃孵育后用洗涤液洗涤；最后每孔加入TMB显色液，于37℃避光显色后，并向每孔加入反应终止液，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值。

验证例1、重组抗原蛋白的免疫学鉴定

将纯化的重组抗原蛋白以SDS-PAGE电泳后，转膜至PVDF膜，并以5％的脱脂奶粉封闭1h。以PBST洗涤后，加入稀释的非洲猪瘟阳性血清，室温孵育1h后，加入HRP标记的山羊抗猪IgG二抗，室温孵育1h，以同样方法洗涤后，加入DAB显色液。如图5所示，为重组抗原蛋白与非洲猪瘟阳性血清及阴性血清的反应原性结果图。其中，条带M为分子量标记，条带1为非洲猪瘟病毒阳性血清，条带2为非洲猪瘟病毒阴性血清。通过图5可以看出，Western blot鉴定重组抗原蛋白与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应。

验证例2、特异性试验

以实施例3建立的间接ELISA方法将实施例1中得到的纯化后的重组抗原蛋白包被酶标板，洗涤封闭后，分别将猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)的阳性血清作1∶100稀释，同时设置非洲猪瘟抗体阳性血清对照和阴性血清对照，100μL/孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤后，加入1∶5000稀释的相应的羊抗猪HRP标记的二抗，37℃湿盒内作用1h，洗涤后每孔加入底物显色15min，终止液终止反应，记录酶标仪上的OD450值，进行结果判定。结果如图6所示，只有非洲猪瘟阳性血清检测为阳性，而CSFV，PCV，PRRSV感染后的阳性血清检测为阴性，表明所建立的间接ELISA方法均具有良好的特异性。

验证例3、批内和批间可重复性试验

批内重复实验：使用同批诱导纯化制备的重组抗原蛋白，按最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的间接ELISA操作方法，选择3份非洲猪瘟阳性血清(编号为No.P1-No.P3)和3份阴性血清(编号为No.N1-No.N3)，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。计算各份血清S/P值，以及S/P值的平均值X，标准差SD，变异系数C.V.。阳性血清和阴性血清的板内变异系数(CV)为1.05％-3.15％，说明该方法具有较好的重复性。

批间重复实验：按最佳抗原包被浓度包被酶标板，用已建立的间接ELISA操作方法，使用不同批次包被的酶标板，同时检测3份非洲猪瘟阳性血清和3份阴性血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。计算各份血清S/P值，以及S/P值的平均值(X)，标准差(SD)，变异系数(CV)。结果见表1，阳性血清和阴性血清的板间重复系数为4.48％-6.08％，说明该方法具有较好的重复性。

表1

应用例1

以实施例3建立的间接ELISA方法对36份猪瘟阴性血清样品进行检测，重复3次。应用统计学方法计算样品的平均值(x)和标准差(s)。当被检样品的OD450值≥阴性样本OD450值的平均值(X)+3(标准差)、并且阳性对照/阴性对照>2判定为阳性。经过进一步的验证，样本OD450值≥阴性样本OD450值的平均值(X)+3(标准差)，可在99％的水平上判为阳性

进一步地，通过检测，其结果显示，以实施例1中得到的重组抗原蛋白为包被抗原，被检测样品D450≥0.353时判定为阳性，否则判定为阴性。

通过上述实施例、验证例和应用例可以进一步看出，对于本发明的重组抗原蛋白，其具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的非洲猪瘟阴性血清无血清学交叉反应，而与非洲猪瘟病毒抗体具有极高亲和力。在本发明的实施例中，通过将表达获得的重组抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，验证了本发明的重组抗原蛋白具有极高的反应原性，并获取了能高效表达非洲猪瘟病毒特异性重组抗原的基因工程菌株，同时结合采用了该重组抗原蛋白的非洲猪瘟病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白在用于检测非洲猪瘟病毒抗体时表现出的高灵敏度、高特异性的优势。

对于本发明的重组抗原蛋白制备方法，由于其选择了非洲猪瘟病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白预测其具有较高的抗原性。该方法中采用的原核表达载体和表达宿主菌，使重组抗原蛋白具备高效的表达效果。另外，在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，同时结合采用了该重组抗原蛋白的非洲猪瘟病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白的制备方法在高效表达可溶性重组抗原蛋白、以及保证本发明重组抗原蛋白的高灵敏度、高特异性方面表现出的优势。

综上，本发明构建了表达非洲猪瘟病毒目的蛋白的重组大肠杆菌，并将其用于建立ASFV抗体ELISA检测方法，初步应用结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性，所建立的ELISA试剂盒使用后准确性、特异性、重复性好。本发明进一步选择特定方式获得的包涵体抗原，与可溶蛋白部分相比较，包涵体蛋白部分抗体表达量大纯度高，能大大降低生产成本。本研究成果将为系统研究非洲猪瘟临床感染情况的监测和鉴别诊断方法的建立奠定基础。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒检测用重组抗原蛋白，其特征在于，所述重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.根据权利要求1所述的重组抗原蛋白，其特征在于，所述重组抗原蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

3.一种如权利要求1或2所述的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将如SEQ ID No:2所示的编码基因克隆入原核表达载体后，转化感受态细胞，诱导表达转化后的所述感受态细胞，获得所述重组抗原蛋白；其中，

所述原核表达载体为pET28a(+)载体，所述感受态细胞为大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，诱导表达过程的诱导物为浓度为0.8-1.2mmol/L的IPTG水溶液将如SEQ ID No:2所示的编码基因克隆入原核表达载体后，转化感受态细胞，诱导表达转化后的所述感受态细胞，获得所述重组抗原蛋白；其中，

所述原核表达载体为pET28a(+)载体，所述感受态细胞为大肠杆菌。；

诱导表达过程的条件为：温度为36.5-37.5℃，时间为4-8h。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对获得的所述重组抗原蛋白进行纯化；其中，

所述纯化为采用Ni亲和层析柱进行纯化。

6.一种非洲猪瘟病毒检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括ELISA反应液和抗体检测板，且所述抗体检测板上包被有根据权利要求1或2所述的重组抗原蛋白。

7.根据权利要求6所述的检测用试剂盒，其特征在于，包被的所述重组抗原蛋白由重组抗原蛋白包涵体提供；且，

所述重组抗原蛋白包涵体包括所述重组抗原蛋白和包涵体抗原稀释液；其中，

所述包涵体抗原稀释液包括二硫苏糖醇、Triton X-100和CBS缓冲液，且，相对于100mL的CBS缓冲液，二硫苏糖醇的含量为0.8-1.2g，Triton X-100的含量为0.3-0.6mL。

8.根据权利要求6所述的检测用试剂盒，其特征在于，所述ELISA反应液至少包括PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液和终止液；

优选地，所述封闭液包括脱脂奶粉和PBS缓冲液，且相对于100mL份的PBS缓冲液，脱脂奶粉的含量为2-4g；

所述酶标二抗为HRP标记的羊抗猪IgG稀释液。

9.一种根据权利要求6-8所述的检测用试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括：

S100、采用包涵体抗原稀释液和缓冲液混合后稀释并冻存所述重组抗原蛋白，得到冻存重组抗原蛋白，采用包被液稀释所述冻存重组抗原蛋白后包被过夜；

S200、将包被后的所述冻存重组抗原蛋白经封闭后，将ELISA反应液和待测样品加入混合显色后，读取在450nm波长处的吸光度值；

S300、根据获取的吸光度值进行结果的判定；

优选地，当待测样品D450≥0.353时，则待测样品为非洲猪瘟病毒阳性。

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