CN115785043A - 愈创木烷型倍半萜激活潜伏hiv的应用及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物技术领域，具体涉及愈创木烷型倍半萜激活潜伏HIV的应用及其制备方法。本发明从河朔荛花根中分离得到两个愈创木烷型倍半萜类化合物daphneH和oleodaphnone，该类化合物具有较好的激活潜伏HIV病毒的活性，该化合物激活潜伏HIV病毒活性至今尚未见到相关报道，且化合物daphneH为新化合物。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及愈创木烷型倍半萜激活潜伏HIV的应用及其制备方法。
背景技术
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)引起的感染性疾病，迄今全球仍有近3700万HIV感染者，占全球人口的0.52％，是现代历史上最严重的传染性疾病之一。目前针对艾滋病的治疗手段主要是高效抗逆转录病毒疗法(highlyactive antiretroviral therapy，HAART)，即采用2种或3种逆转录酶抑制剂和至少1种蛋白酶抑制剂进行联合作用。该疗法可以最大限度地抑制HIV复制，有效降低血浆病毒载量，延长感染者的无症状期，从而延长感染者寿命。然而，HAART疗法不能彻底根除机体内的HIV-1病毒，更不能使感染者的免疫功能恢复正常，临床中也逐渐出现了许多药物毒副作用和耐药毒株。重要的是，停止HAART治疗后，病毒载量将会迅速反弹。这主要是由于有一部分HIV-1感染人体后会稳定持续地存在于一些静息型的CD4+T细胞内，形成潜伏病毒储存库。在这些静息型CD4+T细胞中，病毒基因组处于低水平转录状态，几乎没有病毒的产生或仅有极少量病毒产生。而这样的潜伏细胞由于缺乏病毒蛋白，与正常细胞并无区别，所以不会被宿主免疫系统觉察，从而避免了免疫系统以及药物对它的攻击。一旦HAART停止后，这些静息细胞就会被一些抗原或细胞因子活化，重新参与到病毒的复制周期中。因此，HIV潜伏感染是艾滋病无法治愈的根本原因。
随着人们对HIV-1潜伏感染的建立及维持机制的深入研究，研究人员提出了“shock and kill”的治疗策略，即通过潜伏感染激活剂(latency reactivation agent，LRA)激活潜伏的HIV使之发生转录，然后与HAART联合使用，并结合细胞的自身免疫监视系统，从而实现清除HIV-1病毒潜伏库的目的。因此，基于“shock and kill”这种治疗策略，筛选安全高效的LRA、发现新的激活机制和作用靶点，是目前艾滋病新药研发的基础和关键问题。目前已发现报道的LRA主要有二萜类、黄酮类、生物碱类等。
本发明从河朔荛花根中分离得到两个愈创木烷型倍半萜类化合物daphne H和oleodaphnone，该类化合物具有较好的激活潜伏HIV病毒的活性，该化合物激活潜伏HIV病毒活性至今尚未见到相关报道，且化合物daphne H为新化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供两种愈创木烷型倍半萜类化合物daphne H和oleodaphnone及其药学上可接受的盐(有机酸、或无机酸)，该类化合物为激活潜伏HIV病毒药物活性成分组成的药物组合物，其制备方法与其在制备激活潜伏HIV病毒中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
愈创木烷型倍半萜类化合物daphne H和oleodaphnone，其结构式如下：
式(1)和式(2)所示的化合物daphne H和oleodaphnone的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，取河朔荛花根，干燥；用十倍量体积分数为95％乙醇回流提取2次，每次3h，离心，滤过，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
步骤2，反相硅胶色谱梯度洗脱，得到6个组分A1-A6，组分A3经ODS柱层析梯度洗脱，得到7个组分A31-A37；
步骤3，组分A35经正向硅胶柱层析梯度洗脱得到3个组分A351-A353；
步骤4，组分A351经两次Sephadex LH-20柱色谱分离，再经半制备高效液相色谱纯化得到化合物(1)，组分A36经两次Sephadex LH-20柱色谱分离，再经半制备高效液相色谱纯化得到化合物(2)。
进一步，所述步骤2中反相硅胶色谱梯度洗脱为：体积百分数为10-100％的乙醇水溶液梯度洗脱，所述ODS柱层析梯度洗脱为：体积百分数为40％-90％的乙醇水溶液梯度洗脱；
所述步骤3中正向硅胶柱层析梯度洗脱为：氯仿:甲醇的体积比＝40:1-0:1梯度洗脱；
所述步骤4中半制备高效液相色谱纯化得到化合物(1)为：40％甲醇-60％水，所述半制备高效液相色谱纯化得到化合物(2)为：45％甲醇-55％水，％是指体积百分数。
式(1)和式(2)所述的愈创木烷型倍半萜类化合物在制备激活潜伏HIV病毒药物中的应用。
进一步，所述激活潜伏HIV病毒药物为含有式(1)和式(2)所述两种愈创木烷型倍半萜类化合物或其药学上可接受的盐，及可药用载体或赋形剂。
一种药物组合物的活性成分为式(1)和式(2)所述愈创木烷型倍半萜类化合物的至少一种。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或以药学上可接受的盐以及药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。苔黑酚-1-氧-β-D-葡萄糖吡喃苷、苔黑酚及其衍生物的组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行激活潜伏HIV病毒的治疗。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明从河朔荛花根中分离得到两个愈创木烷型倍半萜类化合物daphne H和oleodaphnone，该类化合物具有较好的激活潜伏HIV病毒的活性，该化合物激活潜伏HIV病毒活性至今尚未见到相关报道，且化合物daphne H为新化合物。
附图说明
图1为两个愈创木烷型倍半萜化合物对HeLa-NH2细胞增值的影响结果图；
图2为两个愈创木烷型倍半萜体化合物外激活潜伏HIV活性测定结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面将用实施例进一步详细说明本发明，但不以此实施例来限定本发明。
实施例1
两个愈创木烷型倍半萜类化合物的结构式如下：
两个愈创木烷型倍半萜体化合物daphne H和oleodaphnone的制备及表征：取河朔荛花根，干燥；用十倍量95％乙醇回流提取2次，每次3h，离心，滤过，合并提取液，减压浓缩得到浸膏(420.0g)。反相硅胶色谱乙醇:水(10-100％)梯度洗脱，得到6个组分(A1-A6)。A3经ODS柱层析乙醇:水(40％-90％)梯度洗脱，得到7个组分(A31-A37)。A35经正向硅胶柱层析氯仿:甲醇(40:1-0:1)梯度洗脱得到3个组分(A351-A353)。A351经两次Sephadex LH-20柱色谱分离，再经半制备高效液相色谱(40％甲醇-60％水)纯化得到化合物daphne H(1.2mg)。A36经两次Sephadex LH-20柱色谱分离，再经半制备高效液相色谱(45％甲醇-55％水)纯化得到化合物oleodaphnone(8.6mg)。(上述百分数为体积百分数，比也为体积比)
化合物daphne H：无色油状，HR-ESI-MS m/z 257.1514[M+Na]+(计算值为257.1512)；1H和13C NMR数据，见下表1。
化合物oleodaphnone：淡黄色油状，HR-ESI-MS m/z 231.1388[M+H]+(计算值为231.3150)，1H和13C NMR数据，见下表1。
表1daphne H和oleodaphnone的1H-NMR(600MHz),13C-NMR(150MHz)数据
实施例2
细胞的药物毒性实验
(1)化合物daphne H和oleodaphnone的细胞毒性测定：
Hela-NH2细胞经消化制备成1×105/mL的细胞悬液，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后加入倍比稀释的不同浓度样品液，继续培养
CCK-8法检测步骤：细胞经实验培养后，在每孔培养孔中加入10μL CCK-8试剂，摇匀，置37℃培养箱避光孵育2h，在酶标仪上检测450nm处的吸光度。结果见图1。
(2)化合物daphne H和oleodaphnone的激活潜伏HIV活性的测定：
Hela-NH2细胞经消化制备成1×105/mL的细胞悬液，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后加入系列浓度的样品液(细胞活性≥90％时的样品浓度)，同时设不加样品的空白对照，继续培养12h，采用碧云天的萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，按说明书进行操作，检测Hela-NH2细胞中的潜伏HIV病毒的激活水平，计算样品对潜伏HIV病毒激活倍数。结果见图2。
可知，化合物oleodaphnone能有效激活HelaNH2细胞中潜伏HIV病毒，激活倍数在39.6，阳性对照药prostratin的激活效果为88.0。
实施例3
按实施例2的方法先制得化合物daphne H和oleodaphnone，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例4
按实施例2的方法先制得化合物daphne H和oleodaphnone，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例5
将实施例2所分离得到的化合物daphne H和oleodaphnone，分别按其与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例6
按实施例2的方法先制得化合物daphne H和oleodaphnone，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例7
按实施例2的方法先制得化合物daphne H和oleodaphnone，分别按常规口服液制法制成口服液。
实施例8
按实施例2的方法先制得化合物daphne H和oleodaphnone，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例9
按实施例2的方法先制得化合物daphne H和oleodaphnone，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例10
按实施例2的方法先制得化合物daphne H和oleodaphnone，分别按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
Claims (6)
1.愈创木烷型倍半萜类化合物，其特征在于，结构式如下：
2.权利要求1所述愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取河朔荛花根，干燥；用十倍量体积分数为95％乙醇回流提取2次，每次3h，离心，滤过，合并提取液，减压浓缩得到浸膏；
步骤2，反相硅胶色谱梯度洗脱，得到6个组分A1-A6，组分A3经ODS柱层析梯度洗脱，得到7个组分A31-A37；
步骤3，组分A35经正向硅胶柱层析梯度洗脱得到3个组分A351-A353；
步骤4，组分A351经两次Sephadex LH-20柱色谱分离，再经半制备高效液相色谱纯化得到化合物(1)，组分A36经两次Sephadex LH-20柱色谱分离，再经半制备高效液相色谱纯化得到化合物(2)。
3.根据权利要求2所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2中反相硅胶色谱梯度洗脱为：体积百分数为10-100％的乙醇水溶液梯度洗脱，所述ODS柱层析梯度洗脱为：体积百分数为40％-90％的乙醇水溶液梯度洗脱；
所述步骤3中正向硅胶柱层析梯度洗脱为：氯仿:甲醇的体积比＝40:1-0:1梯度洗脱；
所述步骤4中半制备高效液相色谱纯化得到化合物(1)为：40％甲醇-60％水，所述半制备高效液相色谱纯化得到化合物(2)为：45％甲醇-55％水，％是指体积百分数。
4.权利要求1所述愈创木烷型倍半萜类化合物的应用，其特征在于，在制备激活潜伏HIV病毒药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的应用，其特征在于，所述激活潜伏HIV病毒药物为含有权利要求1所述两种愈创木烷型倍半萜类化合物或其药学上可接受的盐，及可药用载体或赋形剂。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分为权利要求1所述愈创木烷型倍半萜类化合物的至少一种。
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