CN115779006B - 一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法，包括以下步骤：将猫爪草经回流提取得提取液，提取液经离心、抽滤，得澄清提取液；将澄清提取液浓缩后，过阴离子交换树脂柱，获得流出液A，酸洗阴离子交换树脂柱，获得酸洗流出液，再经浓缩、干燥得到有机酸；将流出液A过大孔吸附树脂柱后，水洗大孔吸附树脂柱，收集流出液，获得流出液B，再用高浓度乙醇解析大孔吸附树脂，收集解析液，再浓缩、干燥后，得到皂苷；将流出液B中加入高浓度乙醇后，静置一定时间，过滤得滤液和滤渣，滤渣干燥得多糖。本发明可以同时分离猫爪草中的总多糖、皂苷和有机酸，且具有高收率、工艺简单、无毒无污染的优点。
Description
技术领域
本发明涉及从猫爪草中提取并分离多种天然活性成分的技术领域，具体涉及一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷、有机酸的方法。
背景技术
猫爪草(学名：Ranunculus ternatus Thunb.)为毛茛科植物小毛茛的干燥块根。具有化痰散结，解毒消肿等药理作用。研究表明猫爪草中含有黄酮类、有机酸、皂苷、多糖、挥发油等多种有效成分，其中有机酸、皂苷类、多糖类成分在抗结核，抗肿瘤等方面具有显著疗效。关于猫爪草的研究多集中在其化合物的药理作用和对猫爪草多糖的提取分离。但对猫爪草的皂苷、有机酸和多种化合物同时提取分离的研究较少。
目前关于猫爪草中有效成分的分离纯化多采用有机溶剂进行液液或固液萃取分离的方式，该方法分离纯化过程较为复杂，且有机溶剂残留较严重。大部分的研究仅针对单一类成分进行研究，造成物料的浪费。
总皂苷、多糖和有机酸是猫爪草中发挥主要药理作用的化学成分，但是目前关于同时提取分离该类成分的研究较少，虽然其它药材中关于猫爪草中的部分上述成分的研究有很多，但是其中仍然存在工艺复杂或纯化后含量偏低，从而造成收率偏低等问题。如：CN115870254A公开了一种连续法从青钱柳中分离黄酮、皂苷和多糖的方法，该方法是利用聚酰胺吸附柱吸附青钱柳中总黄酮类化合物，得到的流出液为总皂苷类成分，此方法得到的总黄酮类成分纯度较高但总皂苷中杂质含量较多，造成总皂苷收率偏低，该方法在分离多糖时用到超滤和离子交换树脂进行除杂，但是多糖是通过水提取，提取出的为高极性的水溶性成分，离子交换树脂起到除去色素等非极性杂质的作用，因此此过程使工艺复杂化，在生产过程中使生产成本增加。CN111297936B公开了一种从罗汉果根中提取分离总黄酮、总三萜皂苷和总多糖的方法，该工艺采用水提罗汉果根，经脱色脱盐后过大孔吸附树脂柱从而分离多糖和皂苷类成分，该方法分离得到的多糖类成分为大孔吸附树脂柱上柱流出液，其中含有单糖等小分子水溶性成分，总多糖纯度较低，从而影响整体收率。CN105601679B公开了一种从生物质水热液化水解液中分离回收单糖、有机酸和酚类化合物的方法，在分离有机酸类成分是使用阴离子交换树脂柱进行分离，然后用碱洗，洗脱液再通过酸化析出，使工艺变得复杂，且氢氧化钠的使用会对环境造成污染破坏，在酸化析出有机酸的过程会造成有机酸的损失，使整体收率偏低。
因此，有必要开发一种高收率，工艺简单易，无毒无污染的高效提取分离猫爪草总多糖、皂苷和有机酸类成分的方法。
发明内容
鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷、有机酸的方法，本发明可以同时分离猫爪草中的总多糖、皂苷和有机酸，且具有高收率、工艺简单、无毒无污染的优点。
为了达到上述目的，本发明提供一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷、有机酸的方法，包括以下步骤：
步骤1：回流提取：
将猫爪草经干燥、粉碎后，向其中加入50％～80％乙醇，再在70～90℃回流提取2～4次，合并提取液后经离心、抽滤，得到澄清提取液；
步骤2：有机酸的分离：
将澄清提取液经浓缩除去乙醇后，过阴离子交换树脂柱，再水洗阴离子交换树脂柱至流出液无色透明并合并收集流出液，获得流出液A备用，再酸洗阴离子交换树脂柱至流出液无色透明时，放干阴离子交换树脂柱并合并收集流出液，获得酸洗流出液，将酸洗流出液经浓缩、干燥后，得到有机酸；
步骤3：皂苷的分离：
将流出液A过大孔吸附树脂柱后，水洗大孔吸附树脂柱至流出液无色透明，合并收集流出液，获得流出液B备用，再用70％～85％乙醇解析大孔吸附树脂柱至解析流出液无色透明时，放干大孔吸附树脂柱并合并收集解析液，解析液经浓缩、干燥后，得到皂苷；
步骤4：多糖的分离纯化：
向流出液B中加入80％～100％的乙醇，一边搅拌，一边缓慢加入乙醇水溶液，待沉淀不再增加时，停止搅拌，将产生沉淀的混合液放入冷库中静置24～48h后，过滤得滤液和滤渣；滤渣干燥，获得多糖；滤液重复步骤4，直至加80％～100％的乙醇不再产生沉淀；将多次析出的多糖合并后，即为总多糖。
依照本发明的一个方面，所述步骤1中，所述50％～80％乙醇的质量为粉碎后的猫爪草重量的5-7倍，所述离心转速为3000～4500r/min，离心时间为4～7min。
依照本发明的一个方面，所述步骤2中，浓缩的温度为60～70℃，浓缩的真空度为-0.08～-0.1Mpa。
依照本发明的一个方面，所述步骤2中，所述阴离子交换树脂柱的上柱流速为1～2bv/h；所述阴离子交换树脂柱包括110、D151、D941中的一种。
依照本发明的一个方面，所述步骤2中，所述酸洗阴离子交换树脂柱采用的酸具体为酸性水溶液，所述酸性水溶液包括草酸、柠檬酸、盐酸、醋酸中的一种或多种；所述酸洗阴离子交换树脂柱的流速为0.5～1bv/h，所述酸洗水溶液的体积为2.0～2.5bv。
依照本发明的一个方面，所述步骤3中，所述大孔吸附树脂柱包括D101、AB-8、D3520、NK-2中的一种；所述流出液A过大孔吸附树脂柱的上柱流速为1～1.5bv/h。
依照本发明的一个方面，所述步骤3中，所述70％～85％乙醇解析大孔吸附树脂柱的流速为0.5～1bv/h，所述70％～85％乙醇的体积为2～2.5bv。
依照本发明的一个方面，所述阴离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱在使用前均需要进行活化再生处理；所述阴离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱均为装柱，茎高比为1：5～7。
依照本发明的一个方面，所述阴离子交换树脂柱进行的活化再生处理具体为：先碱洗，再酸洗，最后再水洗至中性。
依照本发明的一个方面，所述大孔吸附树脂柱进行的活化再生处理具体为：先乙醇浸泡3～5天，再水洗至无乙醇。
本发明的原理：
本发明的阴离子交换树脂柱分离有机酸的原理为：酸碱类成分的阴离子与阴离子交换树脂上的氢氧根离子、氯离子互相交换；酸碱类成分的阳离子与阴离子交换树脂上的钠离子、氢离子互相交换。再通过酸洗，将交换到阴离子交换树脂上的有机酸交换下来；
本发明的大孔吸附树脂柱分离皂苷的原理为：皂苷是皂苷元与糖苷结合形成的物质，是一类亲水性的物质，与大孔吸附树脂上的极性基团通过范德华力的作用而吸附，从而将皂苷类物质吸附于树脂上，极性较小和小分子的物质不被吸附或通过树脂的孔径被率先分离出来。
本发明的多糖分离纯化的原理为：利用水提醇沉法原理进行分离纯化多糖类成分，由于多糖和蛋白质等大分子成分不溶于高浓度的乙醇(80％～100％)，故可通过将其以沉淀析出的方式分离多糖类成分。
本发明的有益效果：
本发明通过一次提取可同时分离三种有效成分，一方面可实现物料的高效综合利用，降低生产成本；其次本发明通过大孔吸附树脂柱分离纯化皂苷类成分，有效的除去非极性杂质，然后使用高浓度的乙醇(70％～85％)，将吸附在树脂上的皂苷类成分尽可能的洗脱下来，从而有效提高了皂苷类成分的收率。此外，在多糖的分离纯化时使用高浓度的乙醇(80％～100％)沉淀多糖类成分，边快速搅拌边加高浓度的乙醇(80％～100％)，快速搅拌可有效防止局部乙醇浓度过高形成沉淀膜将局部小分子类成分包裹而降低多糖纯度。此法有效的除去小分子水溶性成分和单糖成分，经过多次反复的沉淀使多糖全部析出，从而使多糖收率提高，分离有机酸类成分时直接使用酸洗脱简化工艺的同时避免有机酸类成分的损失，避免有毒有害化学试剂的使用；最后通过同时分离猫爪草中多糖、皂苷和有机酸三种成分，填补了猫爪草在同时分离这三种成分的空白，为猫爪草的化学成分更深层次的研究提供数据基础。
总体来说：本发明提供一种同时分离纯化猫爪草中多糖、皂苷和有机酸类成分的方法，使工艺流程更加简单可操作性强，大大提高了分离纯化目标产物的收率(有机酸的收率可达93.4％，皂苷的收率可达96.3％，多糖的收率可达96.8％)，生产成本低，具有极高的实用价值，可实现工业化生产。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文所用专业术语和本领域专业技术人员所理解的含义一致；除非特殊说明，本文所涉及的原料、试剂均可从市场购买，或通过公知的方法制得。
下面将结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。经蒽酮-硫酸法测定本申请所用的原料(猫爪草)中多糖含量为16.1％；香草醛-冰醋酸法测定本申请所用的原料(猫爪草)中总皂苷含量为4.36％；气相色谱法测得本申请所用的原料(猫爪草)中有机酸含量为5.75％。
本申请实施例的所述阴离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱在使用前均需要进行活化再生处理。其中，阴离子交换树脂柱进行的活化再生处理具体为：先碱洗，再酸洗，最后再水洗至中性；所述大孔吸附树脂柱进行的活化再生处理具体为：先乙醇浸泡3～5天，再水洗至无乙醇。
实施例1
一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷、有机酸的方法，包括以下步骤：
步骤1：回流提取：
将猫爪草干燥后，称取200g干燥后的猫爪草原料，粉碎成细颗粒，加入5倍重量的50％的乙醇回流提取2h，提取温度设置为70℃，提取2次，第一次过滤后用50％乙醇洗涤滤渣至洗涤液透明，拧干洗涤液，第二次加入相同量的50％乙醇，70℃提取2h，提取液过滤，滤渣重复洗涤步骤，合并2次提取液；将合并后的提取液4000r/min离心5min，然后再用滤纸抽滤，得到澄清提取液。
步骤2：有机酸的分离：
将澄清提取液在60℃浓缩(真空度为-0.08Mpa)去除乙醇至无乙醇味，将浓缩后的提取液过D151阴离子交换树脂柱，再用纯水洗阴离子交换树脂柱至流出液无色透明并合并收集流出液，获得流出液A备用，再用柠檬酸水溶液洗脱D151阴离子交换树脂柱至流出液无色透明时，放干D151阴离子交换树脂柱并合并收集流出液，获得酸洗流出液，将酸洗流出液经浓缩、干燥后，得到有机酸共16.4g，收率为93.4％。
其中，D151阴离子交换树脂柱的茎高比为1：5；D151阴离子交换树脂柱的上柱流速为1.5bv/h；所述酸洗阴离子交换树脂柱的流速为0.5bv/h，所述酸洗水溶液的体积为2.5bv。
步骤3：皂苷的分离：
将流出液A过D101大孔吸附树脂柱后，水洗D101大孔吸附树脂柱至流出液无色透明，合并收集流出液，获得流出液B备用，再用70％乙醇解析D151阴离子交换树脂柱至解析流出液无色透明时，放干D101大孔吸附树脂柱并合并收集解析液，解析液经60℃浓缩回收解析液，干燥得到皂苷11.35g，收率为95.3％。
其中，D101大孔吸附树脂柱的茎高比为1：6；D101大孔吸附树脂柱的上柱流速为1.5bv/h；70％乙醇解析D101大孔吸附树脂柱的流速为0.5bv/h。
步骤4：多糖的分离纯化：
向流出液B中加入80％的乙醇，一边搅拌，一边缓慢加入80％的乙醇水溶液，待沉淀不再增加时，停止搅拌，将产生沉淀的混合液放入冷库中静置24h后，过滤得滤液和滤渣；滤渣干燥，获得多糖；滤液重复步骤4，直至加80％的乙醇不再产生沉淀；将多次析出的多糖合并后，即得总多糖88.8g，经计算收率为96.8％。
实施例2
一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷、有机酸的方法，包括以下步骤：
步骤1：回流提取：
将猫爪草干燥后，称取200g干燥后的猫爪草原料，粉碎成细颗粒，加入5倍重量的60％的乙醇回流提取3h，提取温度设置为80℃，提取3次，第一次过滤后用60％乙醇洗涤滤渣至洗涤液透明，拧干洗涤液，第二次加入相同量的60％乙醇，80℃提取3h，提取液过滤，滤渣重复洗涤步骤，合并3次提取液；将合并后的提取液4000r/min离心5min，然后再用滤纸抽滤，得到澄清提取液。
步骤2：有机酸的分离：
将澄清提取液在60℃浓缩(真空度为-0.09Mpa)去除乙醇至无乙醇味，将浓缩后的提取液过D941阴离子交换树脂柱，再用纯水洗阴离子交换树脂柱至流出液无色透明并合并收集流出液，获得流出液A备用，再用草酸水溶液洗脱D151阴离子交换树脂柱至流出液无色透明时，放干D151阴离子交换树脂柱并合并收集流出液，获得酸洗流出液，将酸洗流出液经浓缩、干燥后，得到有机酸共13.9g，收率为92.7％。
其中，D151阴离子交换树脂柱的茎高比为1：6；D151阴离子交换树脂柱的上柱流速为2bv/h；所述酸洗阴离子交换树脂柱的流速为0.5bv/h，所述酸洗水溶液的体积为2.5bv。
步骤3：皂苷的分离：
将流出液A过AB-8大孔吸附树脂柱后，水洗AB-8大孔吸附树脂柱至流出液无色透明，合并收集流出液，获得流出液B备用，再用75％乙醇解析D151阴离子交换树脂柱至解析流出液无色透明时，放干AB-8大孔吸附树脂柱并合并收集解析液，解析液经60℃浓缩回收解析液，干燥得到皂苷13.3g，收率为96.5％。
其中，AB-8大孔吸附树脂柱的茎高比为1：6；AB-8大孔吸附树脂柱的上柱流速为1.5bv/h；70％乙醇解析AB-8大孔吸附树脂柱的流速为0.5bv/h。
步骤4：多糖的分离纯化：
向流出液B中加入80％的乙醇，一边搅拌，一边缓慢加入80％的乙醇水溶液，待沉淀不再增加时，停止搅拌，将产生沉淀的混合液放入冷库中静置24h后，过滤得滤液和滤渣；滤渣干燥，获得多糖；滤液重复步骤4，直至加80％的乙醇不再产生沉淀；将多次析出的多糖合并后，即得总多糖87.3g，经计算收率为95.4％。
对比例1
本对比例与实施例1的区别是，多糖的分离纯化过程中直接一次性加入无水乙醇并搅拌，其它操作同实施例1，最后将得到的滤渣合并干燥即得总多糖为102.2g，经计算收率为85.3％。
对比例2
本对比例与实施例1的区别是，有机酸的分离过程不采用酸水洗脱阴离子交换树脂柱，而是先用碱洗柱子，然后再用HCl调节pH至酸性，使有机酸类成分呈游离态析出，最后将得到的有机酸控干水分干燥即得皂苷类成分12.8g，经计算收率为83.5％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：回流提取：
将猫爪草经干燥、粉碎后，向其中加入50％～80％乙醇，再在70～90℃回流提取2～4次，合并提取液后经离心、抽滤，得到澄清提取液；
步骤2：有机酸的分离：
将澄清提取液经浓缩除去乙醇后，过阴离子交换树脂柱，再水洗阴离子交换树脂柱至流出液无色透明并合并收集流出液，获得流出液A备用，再酸洗阴离子交换树脂柱至流出液无色透明时，放干阴离子交换树脂柱并合并收集流出液，获得酸洗流出液，将酸洗流出液经浓缩、干燥后，得到有机酸；其中，所述步骤2中，浓缩的温度为60～70℃，浓缩的真空度为-0.08～-0.1Mpa；所述阴离子交换树脂柱的上柱流速为1～2bv/h；所述阴离子交换树脂柱包括110、D151、D941中的一种；所述酸洗阴离子交换树脂柱采用的酸具体为酸性水溶液，所述酸性水溶液包括草酸、柠檬酸、盐酸、醋酸中的一种或多种；所述酸洗阴离子交换树脂柱的流速为0.5～1bv/h，所述酸洗水溶液的体积为2.0～2.5bv；
步骤3：皂苷的分离：
将流出液A过大孔吸附树脂柱后，水洗大孔吸附树脂柱至流出液无色透明，合并收集流出液，获得流出液B备用，再用70％～85％乙醇解析大孔吸附树脂柱至解析流出液无色透明时，放干大孔吸附树脂柱并合并收集解析液，解析液经浓缩、干燥后，得到皂苷；
步骤4：多糖的分离纯化：
向流出液B中加入80％～100％的乙醇，一边搅拌，一边缓慢加入乙醇水溶液，待沉淀不再增加时，停止搅拌，将产生沉淀的混合液放入冷库中静置24～48h后，过滤得滤液和滤渣；滤渣干燥，获得多糖；滤液重复步骤4，直至加80％～100％的乙醇不再产生沉淀；将多次析出的多糖合并后，即为总多糖；
其中，所述阴离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱在使用前均需要进行活化再生处理；所述阴离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱均为装柱，径高比为1：5～7；所述阴离子交换树脂柱进行的活化再生处理具体为：先碱洗，再酸洗，最后再水洗至中性。
2.根据权利要求1所述的从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法，其特征在于，所述步骤1中，所述50％～80％乙醇的质量为粉碎后的猫爪草重量的5-7倍，所述离心转速为3000～4500r/min，离心时间为4～7min。
3.根据权利要求1所述的从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述大孔吸附树脂柱包括D101、AB-8、D3520、NK-2中的一种；所述流出液A过大孔吸附树脂柱的上柱流速为1～1.5bv/h。
4.根据权利要求1所述的从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述70％～85％乙醇解析大孔吸附树脂柱的流速为0.5～1bv/h，所述70％～85％乙醇的体积为2～2.5bv。
5.根据权利要求1所述的从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱进行的活化再生处理具体为：先乙醇浸泡3～5天，再水洗至无乙醇。
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| CN202211461076.5A CN115779006B (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 一种从猫爪草中提取并分离多糖、皂苷和有机酸的方法 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101361815A (zh) * | 2008-10-06 | 2009-02-11 | 浙江大学 | 利用大孔树脂制备猫爪草总苷提取物的方法及用途 |
-
2022
- 2022-11-16 CN CN202211461076.5A patent/CN115779006B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101361815A (zh) * | 2008-10-06 | 2009-02-11 | 浙江大学 | 利用大孔树脂制备猫爪草总苷提取物的方法及用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 中药猫爪草化学成分及质量控制研究进展;张红伟等;《中医学报》;第第26卷卷(第第159期期);961-964 * |
| 猫爪草综合提取工艺研究;陈琼等;《湖北农业科学》;第第54卷卷(第第15期期);3720-3722 * |
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