CN115778989B

CN115778989B - 一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物

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Publication number: CN115778989B
Application number: CN202211621339.4A
Authority: CN
Inventors: 周岩飞; 钟春莲; 练殊; 黎武林; 吴长辉; 姚渭溪; 李晔; 贾力; 林真; 陈言枧
Original assignee: Ganoherb Bio Technology Fujian Co ltd; Fujian Xianzhilou Biological Science & Technology Co ltd
Current assignee: Ganoherb Bio Technology Fujian Co ltd; Fujian Xianzhilou Biological Science & Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2023-12-15
Anticipated expiration: 2042-12-16
Also published as: CN115778989A

Abstract

一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物，它是由灵芝子实体经微压处理‑低温提取‑冷却‑离心联用技术得到的，灵芝提取物的β‑葡聚糖含量≥15%，酸性三萜含量≥10%，中性三萜含量≥5%，得率7～8%，灵芝提取物可明显促进肿瘤细胞焦亡、细胞胀大、细胞内空泡的形成，从而抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭。微压处理设备在一定的温度和压力下对灵芝子实体进行预处理，子实体经过低温提取得到提取液，提取液后经过冷却和离心机分离得到离心液，离心液经浓缩干燥得到提取物。本发明的提取物可促进肿瘤细胞的焦亡，引起细胞内空泡的形成，从而抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭。

Description

一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物

技术领域

本发明属于天然产物提取和中药制剂领域，涉及灵芝子实体的加工利用技术领域，具体涉及一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物。

背景技术

灵芝Ganoderma lucidum(Leyss.exFr.)Karst.为多孔菌科真菌灵芝的干燥子实体(中国药典2020版一部)，味甘性平，扶正固本。归心、肝、肺、肾经，能安心神、健脾胃、益气血，主治失眠、神疲乏力、心悸、冠心病、肿瘤等。灵芝含有多种化学成分，其中的活性成分以多糖、三萜、核苷、甾醇类为主，具有一定的抗肿瘤、抗炎、保肝、降糖、抗衰老等活性。

灵芝三萜类化合物是灵芝的重要活性成分，包含酸性三萜和中性三萜，具有一定的抗肿瘤活性。相较于灵芝多糖间接作用于肿瘤细胞，灵芝三萜对肿瘤细胞有直接的细胞毒性作用。不同种的灵芝三萜类化合物的抗肿瘤活性不同，实验得出酸性三萜具有抗炎和调节免疫等诸多作用，但中性三萜的抗肿瘤活性明显强于酸性三萜。

灵芝多糖类中的灵芝β-葡聚糖是一种活性多糖，它通过激活T、B淋巴细胞，巨噬细胞，自然杀伤细胞(NK)，细胞毒淋巴细胞(CTL)和树突状细胞(DC)，促进细胞因子生成，激活补体系统，促进抗体生成来间接抑制肿瘤生长。

以往对于灵芝中三萜和多糖的提取方法有常规提取、超声辅助提取、酸碱辅助提取、微波辅助提取、酶法辅助提取、亚临界提取、高温高压提取和超高压提取。常规提取得到的灵芝提取物由于引湿性杂质较多，得率较高，易成浸膏状，需添加糊精等辅料干燥成粉，多糖和三萜含量较低，并且糊精等辅料易干扰多糖检测结果；而超声辅助提取、微波辅助提取、亚临界提取、高温高压提取和超高压提取需要专门的处理设备，投入巨大，并且同样存在引湿性杂质导致浸膏，需辅料维持粉状等问题；酸碱辅助提取、酶法辅助提取加入外源酸、碱或酶，改变传统提取方式和物料本身性质，带来安全性问题。

在灵芝的提取中普遍使用高新技术去追求有效成分的高提取率，殊不知有效成分的高提取率的背后，带来的是提取物的高得率，导致提取物中却夹杂着众多的没有药理活性的物质，因为灵芝子实体中的三萜和多糖是存在上限的，高得率导致灵芝子实体中存在的大量没有药理活性的物质也被提取出来，降低提取物中有效成分的浓度。若直接使用高得率低有效成分含量的提取物进行抗肿瘤活性检测，其甚至达不到常规工艺制备的提取物的药理活性，若进一步纯化高得率低有效成分含量的提取物：醇提物需要水沉或调酸碱、有机溶剂萃取、过大孔树脂柱等复杂的工艺进行纯化；水提物需要调酸碱、絮凝或醇沉、有机溶剂除蛋白、过凝胶柱等复杂的工艺进行纯化；这些纯化工艺引入有效成分损失或变性，有机溶剂残留或酸碱残留等一系列缺点；同时得到纯化后的高有效成分含量的提取物，其中从子实体提取到的有效成分也会有所损失，有效成分的保留率甚至低于常规工艺的有效成分的提取率。

据统计2040年全球癌症幸存者人数预计将达到2840万。而导致癌症患者死亡的主要因素是手术后的再转移，虽然肿瘤治疗已取得突破性进展，但肿瘤转移的问题还尚未解决，转移患者的5年平均存活率不足30％。由于肿瘤转移本身固有的复杂性及临床治疗的滞后性，化疗药物效果甚微，靶向治疗和免疫治疗仅对少数患者有效。然而，面对如此庞大的癌症群体，如何安全有效地预防和控制肿瘤转移，是现阶段肿瘤治疗亟需攻克的难题。

细胞焦亡(Pyroptosis)是一种细胞程序性死亡方式，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，进而引起细胞内容物的释放，促发强烈的炎症反应。经典的细胞焦亡途径为，激活caspase-1和caspase-11/4/5通路，剪切消皮素D(Gasdermin-D，GSDMD)蛋白从而诱发细胞焦亡，GSDMD在被caspase-1或caspase-11/4/5切割后，暴露出其N端结构域，该结构域具有结合膜脂并在细胞膜上打孔的活性，这样就导致细胞渗透压的变化，引起细胞胀大直至最终细胞膜的破裂。大量研究表明也可通过激活caspase 3，切割GSDME蛋白从而诱发细胞焦亡，从而抑制肿瘤转移。

发明内容

本发明的目的在于克服以往制备灵芝提取物存在的缺陷，提供一种酸性三萜、中性三萜和β-葡聚糖含量高的能抑制肿瘤转移灵芝提取物及其制备方法。

本发明采用的技术方案为一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物，其要点是它是由灵芝子实体经微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术得到的，灵芝提取物的β-葡聚糖含量≥15％，酸性三萜含量≥10％，中性三萜含量≥5％，得率7～8％，灵芝提取物可明显促进肿瘤细胞焦亡、细胞胀大、细胞内空泡的形成，从而抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭。

本发明创造性地不追求过高的提取物得率，而通过控制得率，将得率控制在7～8％，防止对抑制肿瘤转移无用的杂质混入灵芝提取物，防止出现高提取率而提取物中能抑制肿瘤转移有效成份低的现象。提取技术上创造性地在灵芝提取中使用了微压处理-低温提取，通过微压处理破坏细胞壁，达到让酸性三萜、中性三萜和β-葡聚糖快速溶出的目的。由于酸性三萜和中性三萜易溶于乙醇提取液(系指溶质1g(mL)能在溶剂1～不到10mL中溶解)，β-葡聚糖易溶于水提取液，这样酸性三萜、中性三萜和β-葡聚糖即便在低温环境下也不存在溶出慢和饱和问题。而没有药理活性的物质多为脂类或变性蛋白，在提取溶剂中的溶解度低，在低温环境下不易溶出和容易析出。这样可以限制提取物中没有药理活性的物质的含量。

低温低压提取是指利用低压环境下，提取溶剂沸点降低，在较低温度即可达到沸腾，分子热运动速度达到最大值，可在低温环境下进行提取易溶于提取溶剂的小分子物质。同时其他沸点高于提取温度的杂质不易溶解或溶解较慢于提取溶剂，从而达到一定的分离和纯化作用。

所述的微压处理-提取-离心联用技术是指：微压处理设备在一定的温度和压力下对灵芝子实体预处理，子实体经过低温提取得到提取液，提取液后经过冷却和离心分离得到离心液，离心液经浓缩干燥得到提取物。

所述的微压处理是将灵芝子实体送入微压处理设备中，进行处理，以破坏灵芝子实体细胞壁。

所述的微压处理是指在121～135℃，0.1～0.2Mpa环境下处理3h。

微压(Micro pressure)是指在纬度45°的海平面上，当温度为0℃时，高于一个标准大气压(1.013×105Pa≈0.1Mpa)低于两个标准大气压(2.026×105Pa≈0.2Mpa)。在上述微压环境下，灵芝子实体的纤维素和木质素开始降解，细胞壁开始破裂，酸性三萜、中性三萜和β-葡聚糖开始渗出，虽然细胞壁破裂速度较超高压提取低，耗时较超高压长；但超高压提取设备需要特种钢材和工艺，投入巨大，同时超高压提取设备体积小，只能处理公斤级别的物料，不适于大规模工业化生产。微压环境可由灭菌柜等常规压力设备提供，提取环境可由常规提取罐和真空泵等常规设备提供，工业化的灭菌和提取设备技术成熟，一次可处理吨级物料。若需提取同样重量的几吨物料，微压处理后进行提取的整套工艺与超高压提取相比可达到几十甚至几百倍的速率。

所述的提取是将微压处理后的灵芝子实体装入提取罐，3份重量的灵芝子实体加入6～8份食品级95％乙醇，50～60℃，-0.06～-0.08Mpa环境下提取0.5h；提取后用200目筛网过滤，放出醇提取液；再加入8份纯化水，80～85℃，-0.06～-0.08Mpa环境下提取0.5h；提取后用200目筛网过滤，放出水提取液。

所述的冷却和离心是将醇提取液经过热交换器将提取液温度降至0～4℃，使用蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；将水提取液经过热交换器将提取液温度降至4～10℃，经过使用蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下。

本发明充分考虑到温度对溶解度的影响，利用提取液中不属于酸性三萜、中性三萜和β-葡聚糖的杂质在低温环境下，溶解度下降的特性，保持离心之前醇提取液提取液不超过4℃，水提取液不超过10℃，低温提取将提取液中不属于酸性三萜、中性三萜和β-葡聚糖的杂质在提取液的温度较低时较慢溶出或不溶出；在提取液冷却时，因溶解度下降，从而饱和而析出。

灵芝提取物促进肿瘤细胞焦亡通过激活caspase 3，剪切底物蛋白消皮素E(GSDME)诱导细胞膜孔形成，从而促进细胞焦亡。

灵芝提取物可明显抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭。

所述的灵芝子实体为中华人民共和国药典2020版一部所收录的多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst的干燥子实体。

所述的灵芝提取物可以明显抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，且具有浓度依赖性。经流式细胞仪检测，灵芝提取物药物浓度为100μg/mL时，MCF-7细胞死亡百分比为15.67％±0.81(p≤0.001)，当药物浓度达到200μg/mL时，MCF-7细胞死亡百分比达到49.6％±0.1(p≤0.001)。随着浓度的增加，MCF-7细胞形态发生明显的改变，细胞逐渐膨大，细胞内出现空泡，表现出明显的细胞焦亡形态。通过分子生物学实验技术Western blot检测发现，灵芝提取物明显促进GSDME蛋白的剪切，进一步证实灵芝提取物通过促进MCF-7乳腺癌细胞焦亡发挥抗癌作用。此外，灵芝提取物具有浓度依赖性抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移和侵袭，当其浓度为200μg/mL时，对肿瘤细胞的迁移和侵袭抑制百分比分别为50％±0.2(p≤0.001)、45％±1.5(p≤0.001)。

本发明采用的技术方案，采用精心的工艺设计，经反复多次的试验，采用特定的工艺参数，其有益效果为：

1，本发明使用微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术得到灵芝提取物，是通过控制提取物得率，来提高提取物中的β-葡聚糖、酸性三萜和中性三萜的含量。β-葡聚糖含量≥15％，酸性三萜含量≥10％，中性三萜含量≥5％，得率为7～8％。

2，本发明使用的微压处理的处理环境可用灭菌柜提供：利用水的饱和蒸汽压达到微压环境，技术成熟，安全可靠。灵芝子实体细胞壁被完全破坏，其后可用较短的提取时间，较少的提取溶剂和提取次数进行提取。

3，本发明使用的低温低压提取环境可用常规提取罐提供：通过冷凝回流管道与真空泵连接，即可在提取罐内达到低压环境，技术简便易行并且节省能耗。低温低压条件下，乙醇充分沸腾，灵芝三萜随分子热运动较快溶出到乙醇中，较常规提取2-3h缩短至0.5h即可达到提取平衡。同时其他沸点高于提取温度的醇溶性杂质不易溶解或溶解较慢于提取溶剂，在控制得率的同时进行分离和纯化：由于灵芝子实体内的酸性三萜和中性三萜是一定的，是有上限的。当已完全提取出酸性三萜和中性三萜时，再增加提取时间，提取溶剂和提取次数反而会将醇溶性杂质更多的提取出来，导致灵芝提取物的得率升高的同时酸性三萜和中性三萜含量的百分比反而下降，而酸性三萜和中性三萜提取率升高幅度趋近于零。同理，β-葡聚糖可先于水溶性杂质溶出到水中，在控制得率的同时进行分离和纯化。

4，本发明使用的冷却技术可用热交换器提供：提取液经过热交换器后，温度降低，杂质在提取溶剂中的溶解度下降，饱和析出，经过后续离心除去。在控制得率的同时保留β-葡聚糖、酸性三萜和中性三萜，进一步提高了提取物中β-葡聚糖、酸性三萜和中性三萜的含量。

5，本发明使用的微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术，设备为灭菌柜，提取罐，真空泵，热交换器和卧式离心机，为市场上已有的成熟设备，无需特殊材料和工艺，无需持特种作业资格证人员操作。联用技术成本投入低，适用于工业化生产。

6，本发明使用的微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术，全程使用物理手段对灵芝子实体进行预处理，提取和分离，未改变传统提取方式和物料本身性质，安全性良好，提取得到的灵芝提取物可获得有机认证，是一种安全的辅助抗癌制品。

7，本发明的灵芝提取物通过激活caspase 3，剪切底物蛋白消皮素E(GSDME)诱导细胞膜孔形成，从而促进细胞焦亡。从而抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭，在抑制肿瘤增殖的效果上与常规灵芝提取物相比提高约25倍(见实验例1)；在抑制肿瘤术后切除远端组织转移的效果上，本发明的灵芝提取物与常规灵芝提取物相比，抑制了45％的肺部肿瘤转移结节，与肿瘤组相比抑制了56％(见实验例5)。所以本发明的灵芝提取物是一种有效的辅助抗癌制品，可在切除肿瘤手术后长期服用以预防肿瘤转移。

8，本发明的体内动物实验显示低浓度的灵芝提取物(20mg/kg，见实验例5)可显著抑制原位乳腺瘤切除后远端转移情况。按60kg的成人平均体重计算，临床实验的起效浓度为20mg/kg/9.1×60kg＝131.86mg，已获批准，通过安全性测试的灵芝提取物的日常服用方法为0.4g/粒，每次5粒，每天2次，剂量为0.4g×5×2＝4000mg，灵芝提取物发挥抑制肿瘤转移的体内动物实验的药物浓度远低于安全的日常服用剂量的药物浓度；所以本发明的灵芝提取物是一种安全的辅助抗癌制品，可在切除肿瘤手术后长期服用以预防肿瘤转移。

附图说明

图1是微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术流程图

图2.本发明的灵芝提取物可引起乳腺癌细胞MCF-7膨大，细胞内出现空泡

图3.本发明的灵芝提取物促进乳腺癌细胞MCF-7GSDME蛋白剪切

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域技术人员所知晓的常规方法。

一种灵芝提取物，其要点是它是由灵芝子实体经微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术得到的。灵芝提取物的β-葡聚糖含量≥15％，酸性三萜含量≥10％，中性三萜含量≥5％，得率7～8％。灵芝提取物可明显促进肿瘤细胞焦亡、细胞胀大、细胞内空泡的形成，从而抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭。

所述的微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术是指：微压处理设备在一定的温度和压力下对灵芝子实体预处理，子实体经过提取得到提取液，提取液后经过冷却和离心机分离得到离心液，离心液经浓缩干燥得到提取物。

微压处理是将灵芝子实体送入微压处理设备中(如灭菌柜等常规压力设备)，进行处理，以破坏灵芝子实体细胞壁，本发明的微压处理是指在121～135℃，0.1～0.2Mpa环境下处理3h。

所述的冷却和离心是将醇提取液经过热交换器将提取液温度降至0～4℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成醇提取物浸膏；将水提取液经过热交换器将提取液温度降至4～10℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成水提取物浸膏；混合醇提取物浸膏和水提取物浸膏，真空或冷冻干燥至水分≤6％，粉碎，即得。

灵芝提取物的β-葡聚糖含量检测方法参见检测例1；

灵芝提取物的酸性三萜含量检测方法为美国草药药典-灵芝提取物-三萜酸含量测定Herbal Medicines Compendium-Ganoderma lucidum Fruiting Body Dry ExtractCONTENT OF TRITERPENE ACIDS；灵芝提取物的中性三萜含量检测方法为论文“亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜的工艺研究亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜的工艺研究”的中性三萜的测定方法(朱忠敏，食药用菌.2021,29(04))。灵芝提取物的提取率为浓缩干燥成粉的提取物(水分≤6％)的重量与提取时灵芝子实体的重量比；灵芝提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用的检测方法为MTT法，以半抑制浓度IC₅₀为标准，IC₅₀是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在MTT法中，就是以对照组吸光度OD值减少一半所需的药物浓度为IC₅₀。

对比例1

常规灵芝提取物的制备：采收成熟的灵芝子实体，捡去杂质，洗净，干燥至水分≤12％，粉碎成10～20目颗粒，记为原料Ⅰ；取将10kg原料Ⅰ以专利灵芝、灵芝孢子粉和女贞子的提取物胶囊及其制备方法(申请号为201811366939.4)中权利要求4.1的工艺制备灵芝提取物，重量为0.866kg，提取物得率为8.66％，记为灵芝提取物Ⅰ。

对比例2

取10kg原料Ⅰ投入常规提取罐，放入提取溶剂120kg食品级95％乙醇，浸泡1h后进行提取：打开冷凝回流和真空泵，在50℃，-0.08Mpa环境下提取0.5h；提取后放开阀门，提取液经过罐底200目滤网过滤，放出醇提取液；再加入120kg纯化水，打开冷凝回流和真空泵，80℃，-0.08Mpa环境下提取0.5h；提取后用200目筛网过滤，放出水提取液。

醇提取液经过热交换器将提取液温度降至0～4℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成醇提取物浸膏；将水提取液经过热交换器将提取液温度降至4～10℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成水提取物浸膏；混合醇提取物浸膏和水提取物浸膏，真空或冷冻干燥至水分≤6％，称重，重量为0.432kg，提取物得率为4.32％，粉碎即为灵芝提取物Ⅱ。

实施例1

取10kg原料Ⅰ装入布袋，送入灭菌柜，在121℃，0.1Mpa环境下处理3h；将预处理后的原料Ⅰ30kg投入常规提取罐，加入提取溶剂60kg食品级95％乙醇，打开冷凝回流和真空泵，在50℃，-0.08Mpa环境下提取0.5h；提取后放开阀门，提取液经过罐底200目滤网过滤，放出醇提取液；再加入80kg纯化水，打开冷凝回流和真空泵，80℃，-0.08Mpa环境下提取0.5h；提取后用200目筛网过滤，放出水提取液。

醇提取液经过热交换器将提取液温度降至0～4℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成醇提取物浸膏；将水提取液经过热交换器将提取液温度降至4～10℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成水提取物浸膏；混合醇提取物浸膏和水提取物浸膏，真空或冷冻干燥至水分≤6％，称重，重量为0.785kg，提取物得率为7.85％，粉碎即为灵芝提取物Ⅲ。

实施例2

取10kg原料Ⅰ装入布袋，送入灭菌柜，在135℃，0.2Mpa环境下处理3h；将预处理后的原料Ⅰ30kg投入常规提取罐，加入80kg食品级95％乙醇，打开冷凝回流和真空泵，在60℃，-0.06Mpa环境下提取0.5h；提取后放开阀门，提取液经过罐底200目滤网过滤，放出醇提取液；再加入80kg纯化水，打开冷凝回流和真空泵，85℃，-0.06Mpa环境下提取0.5h；提取后用200目筛网过滤，放出水提取液。

醇提取液经过热交换器将提取液温度降至0～4℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成醇提取物浸膏；将水提取液经过热交换器将提取液温度降至4～10℃，经过蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000g，分离出的液体浊度达到20nut以下；取上清液浓缩成水提取物浸膏；混合醇提取物浸膏和水提取物浸膏，真空或冷冻干燥至水分≤6％，称重，重量为0.747kg，提取物得率为7.47％，粉碎即为灵芝提取物Ⅳ。

对上述的得物进行活性成分β-葡聚糖，酸性三萜和中性三萜的检测检测例1

对比例1的灵芝提取物Ⅰ，对比例2的灵芝提取物Ⅱ，实施例1的灵芝提取物Ⅲ，实施例2的灵芝提取物Ⅳ取样使用下列方法检测β-葡聚糖含量。

分析步骤：

1，样品的提取

取样品约0.5g(M)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水100mL(V₁)，称定重量，置水浴中加热回流提取2小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心，4000r/min，10min，取上清液过滤，将25mL滤液转移至50mL离心管，加入30mg中温α温淀粉酶(4000U/g)，55℃水浴，酶解1h，用滴管滴入1滴(约0.02mL)0.1mol/L盐酸，加入30mg糖化酶(10000U/g)，55℃水浴，酶解1h，离心取5mL上清液转移至三角烧瓶，边搅拌边缓慢滴加无水乙醇75mL，摇匀，在4℃放置12h，离心，4000r/min，弃去上清液，沉淀物用25mL无水乙醇洗涤，4000r/min，沉淀物用热水溶解并转移至100mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，即得。

2，标准曲线

精密量取对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别置15mL的具塞试管中，各加水至2.0mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6mL，立即摇匀，放置15min后，立即置冰浴中冷却15min，取出，以相应的试剂为空白，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以葡萄糖质量为横坐标，绘制标准曲线。

3，测定

精密量取供试品溶液2mL(V₄)，置10mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入加入硫酸蒽酮溶液6mL”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的质量C，计算即得。

4，结果计算

式中：

X-β-葡聚糖的含量，g/100g；

W₁-从标准曲线上查得样品的无水葡萄糖质量，mg；

W₂-从标准曲线上查得空白的无水葡萄糖质量，mg；

M-样品质量，g；

V₁-样品提取的体积数值，V₁＝100，mL；

V₂-参与醇沉的体积数值，V₂＝5，mL；

V₃-醇沉后获得的沉淀物经热水溶解定容的体积数值，V₃＝100，mL；

V₄-参与反应的体积数值，V₄＝2，mL。

计算结果保留两位有效数字。

5，检测结果见表1

表1灵芝提取物的β-葡聚糖含量

样品	β-葡聚糖含量％
		Ⅰ	9.91
Ⅱ	5.21
		Ⅲ	15.58
Ⅳ	17.44

检测例2

对比例1的灵芝提取物Ⅰ，对比例2的灵芝提取物Ⅱ，实施例1的灵芝提取物Ⅲ，实施例2的灵芝提取物Ⅳ取样使用美国草药药典-灵芝提取物-三萜酸含量测定酸性三萜含量。

检测结果见表2

表2灵芝提取物的酸性三萜含量

样品	酸性三萜含量％
		Ⅰ	8.22
Ⅱ	7.89
		Ⅲ	12.77
Ⅳ	10.56

检测例3

对比例1的灵芝提取物Ⅰ，对比例2的灵芝提取物Ⅱ，实施例1的灵芝提取物Ⅲ，实施例2的灵芝提取物Ⅳ取样使用论文“亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜的工艺研究亚临界水提取灵芝酸性和中性三萜的工艺研究”的中性三萜的测定方法测定中性三萜含量。

检测结果见表3

表3灵芝提取物的中性三萜含量

样品	中性三萜含量％
		Ⅰ	4.64
Ⅱ	2.11
		Ⅲ	6.48
Ⅳ	5.46

选取常规提取得到的灵芝提取物Ⅰ和中性三萜含量最高的灵芝提取物Ⅲ，对其进行药理实验检测抗肿瘤活性。

实验例1

灵芝提取物对乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用

取对数生长期的MCF-7细胞，经胰蛋白酶消化处理后重悬于DMEM培养基中，以每孔3000个细胞均匀培养于96孔板中，培养24h后给予不同浓度的灵芝提取物Ⅰ和灵芝提取物Ⅲ(0、1、5、10、25、50、100、200、500和1000μg/mL)处理24h，经CCK8试剂共孵育1h于酶标仪450nm波长处检测细胞的活力。实验结果如下：

表4.灵芝提取物抑制肿瘤细胞的增殖率

μg/mL	灵芝提取物Ⅰ	灵芝提取物Ⅲ
			0	1±0.05	1±0.02
1	1.04±0.04	0.99±0.03
			5	0.98±0.01	0.99±0.02
10	1.09±0.02	0.99±0.03
			25	0.94±0.07	1.0±0.04
50	0.95±0.03	0.85±0.05
			100	0.91±0.08	0.77±0.04
200	0.81±0.04	0.59±0.01
			500	0.79±0.03	0.27±0.05
1000	0.51±0.07	0.08±0.01

从表4可以计算得灵芝提取物Ⅰ的IC₅₀为10.739mg/mL，灵芝提取物Ⅲ的IC₅₀为0.426mg/mL。又如表4所示，随着浓度的增加，不同方法处理的灵芝提取物都可引起乳腺癌细胞MCF-7的细胞活力明显降低，但经过灵芝提取物Ⅲ抑制细胞活力效果更显著，且相同浓度下灵芝提取物Ⅲ药物效果更显著，微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术得到的灵芝提取物Ⅲ的抑制能力比常规提取(未经过上述联用技术)的灵芝提取物Ⅰ提高约25倍(10.739/0.426)。

实验例2

灵芝提取物引起乳腺癌细胞MCF-7焦亡。

取对数生长期的MCF-7细胞，经胰蛋白酶消化处理后重悬于DMEM培养基中，以每孔30000个细胞均匀培养于24孔板中，待细胞生长至80％左右，给予不同浓度灵芝提取物Ⅲ(0、10、25、50、100和200μg/mL)和200μg常规处理灵芝提取物Ⅰ处理24h，于显微镜下观察细胞的形态变化。结果如图2所示，只有灵芝提取物Ⅲ可明显引起细胞胀大，细胞内出现空泡，呈现典型的细胞焦亡形态。

实验例3

灵芝提取物促进GSDME蛋白的剪切

取对数生长期的MCF-7细胞，经胰蛋白酶消化处理后重悬于DMEM培养基中，以每孔200000个细胞均匀培养于6孔板中，待细胞生长至80％左右，给予不同浓度的灵芝提取物Ⅲ(0、10、25、50、100和200μg/mL)处理24h后，收集细胞。加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解处理30min，12000rpm，4℃离心15min，收集蛋白裂解液。经100℃金属浴10min后进行Western blot实验，孵育GSDME一抗4℃过夜，经PBST洗涤后孵育二抗室温1h后进行显色。结果如图3所示，200μg/mL的灵芝提取物Ⅲ明显促进GSDME蛋白的剪切，在25KD处出现明显的GSDME N端片段。

实验例4

灵芝提取物抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移

取对数生长期的MCF-7细胞，经胰蛋白酶消化处理后重悬于无血清的DMEM培养基中，以每孔40000个细胞均匀培养于Transwell小室中，下室为含有不同浓度的灵芝提取物Ⅲ(0、10、25、50、100和200μg/mL)的10％FBS的DMEM的培养基。培养24h后取出小室，经4％多聚甲醛固定，0.2％结晶紫染色后于显微镜下统计穿过小室的肿瘤细胞数。结果如表2所示：100μg/mL和200μg/mL的灵芝提取物Ⅲ对MCF-7的迁移抑制率分别为33.62±3.2％(p≤0.01)，61.64±8.6％(p≤0.001)。

表5.灵芝提取物抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移

浓度(μg/mL)	迁移细胞数
		0	77.33±6.6
1	69.33±5.8
		10	60.67±3.5*
50	47±2.6**
		100	51.33±2.5**
200	29.67±6.6***

*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001。

实验例5

灵芝提取物抑制肿瘤术后切除远端组织转移

雌性Balb/C小鼠皮下乳房垫接种4T1肿瘤，待肿瘤生长到大约1cm³后手术切除，持续给予灵芝提取物Ⅲ(20mg/kg)(溶于大豆油)和灵芝提取物Ⅰ(200mg/kg)灌胃治疗30d，灌胃期间持续的观察小鼠的状态，后将小鼠处死，观察肿瘤远端转移情况。

表6.小鼠的基本特征

*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，***表示p≤0.001。

结果如表6所示，20mg/kg的灵芝提取物Ⅲ灌胃组其肺部肿瘤转移结节明显低于200mg/kg的灵芝提取物Ⅰ和肿瘤组：即微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术得到的灵芝提取物Ⅲ在剂量为常规提取(未经过上述联用技术)的灵芝提取物Ⅰ的10％(20/200×100％)的情况下，肺部肿瘤转移结节与灵芝提取物Ⅰ组相比减少45％((1-6.9/12.7)×100％)，与肿瘤组相比减少56％((1-6.9/15.6)×100％)。

Claims

1.一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物，其特征是,它是由灵芝子实体经微压处理-低温提取-冷却-离心联用技术得到的，灵芝提取物的β -葡聚糖含量≥15%，酸性三萜含量≥10%，中性三萜含量≥5%，得率7～8%，灵芝提取物可明显促进肿瘤细胞焦亡、细胞胀大、细胞内空泡的形成，从而抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭；所述的微压处理是指在121～135℃，0.1～0.2 Mpa环境下处理3 h；所述的低温提取是将微压处理后的灵芝子实体装入提取罐，3份重量的灵芝子实体加入6～8份食品级95%乙醇，50～60 ℃，-0.06～-0.08 Mpa环境下提取0.5 h；提取后用200目筛网过滤，放出醇提取液；再加入8份纯化水，80～85 ℃，-0.06～-0.08 Mpa环境下提取0.5 h；提取后用200目筛网过滤，放出水提取液。

2.根据权利要求1所述的一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物，其特征是,所述的微压处理-提取-离心联用技术是指：常规压力设备在微压环境下对灵芝子实体预处理，子实体经过-0.06～-0.08 Mpa环境下提取得到提取液，提取液后经过冷却和离心分离得到离心液，离心液经浓缩干燥得到提取物。

3.根据权利要求1或2任一所述的一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物，其特征是,所述的微压处理是将灵芝子实体送入灭菌柜中，进行处理，以破坏灵芝子实体细胞壁。

4.根据权利要求1或2任一所述的一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物，其特征是,所述的冷却和离心是将醇提取液经过热交换器将提取液温度降至0～4 ℃，使用蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200r/min，分离因子为12000 g，分离出的液体浊度达到20 nut以下；将水提取液经过热交换器将提取液温度降至4～10 ℃，经过使用蝶式离心机离心，蝶式离心机的转鼓转速为7200 r/min，分离因子为12000 g，分离出的液体浊度达到20 nut以下。

5.根据权利要求1所述的一种抑制肿瘤转移的灵芝提取物，其特征在于：灵芝提取物促进肿瘤细胞焦亡通过激活caspase 3，剪切底物蛋白消皮素E（GSDME）诱导细胞膜孔形成，从而促进细胞焦亡，抑制肿瘤细胞转移中的增殖、迁移和侵袭。