CN115772494A - 一种牙槽骨组织消化液及其在牙槽骨细胞分离中的用途和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种牙槽骨组织消化液及其在牙槽骨细胞分离中的用途和方法，所述牙槽骨组织消化液包括基础培养基、胶原酶、DNA酶、BSA、EDTA，以牙槽骨组织消化液的总体积为基准，所述胶原酶的终浓度为200～400U/ml，所述DNA酶的终浓度为50～150U/ml，所述BSA的终浓度为0.1～2mg/ml，所述EDTA的终浓度为0.5‑1.5mM。所述牙槽骨细胞的分离方法包括将牙槽骨组织置于所述牙槽骨组织消化液中分次消化，过程中研磨所述牙槽骨组织等步骤最终获得牙槽骨细胞。本发明的牙槽骨组织消化液及牙槽骨细胞的分离方法实现快速高效提取牙槽骨组织单细胞悬液，且符合单细胞测序所要求的高活性和高浓度。

Description

一种牙槽骨组织消化液及其在牙槽骨细胞分离中的用途和 方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种牙槽骨组织消化液及其在牙槽骨细胞分离中的用途和方法。

背景技术

牙槽骨组织是位于上颌下缘、下颌上缘环绕牙根部位的特殊骨组织，包括骨皮质、骨松质和固有牙槽骨三个部分，可见牙槽骨结构之复杂。牙槽骨组织中所含细胞类群极为多样化并且数量较少，包括具有多样分化潜能的干细胞、成骨细胞、破骨细胞、多种免疫细胞等等，这些细胞类群对于维持牙周组织稳态和调控牙周组织再生具有复杂而协调统一的作用。然而由于牙槽骨组织本身体量小、细胞含量少、硬组织含量高，使得牙槽骨组织内的细胞(即牙槽骨细胞)难以提取，进而限制了对牙槽骨的进一步的相关研究。

目前对于牙槽骨细胞的提取多为通过消化酶长时间持续消化的方法，存在细胞得率低、细胞活性低、纯度低、骨碎屑比例高等问题。并且这样获得的牙槽骨细胞悬液往往会丢失某些比较脆弱和敏感的细胞类群，例如干细胞群和某些免疫细胞类群。这些问题极大的限制了对牙槽骨组织的相关研究的开展。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种牙槽骨组织消化液及其在牙槽骨细胞分离中的用途和方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种牙槽骨组织消化液，所述牙槽骨组织消化液包括基础培养基、胶原酶、DNA酶、BSA、EDTA，以牙槽骨组织消化液的总体积为基准，所述胶原酶的终浓度为200～400U/ml，所述DNA酶的终浓度为50～150U/ml，所述BSA的终浓度为0.1～2mg/ml，所述EDTA的终浓度为0.5-1.5mM。

本发明还提供所述的牙槽骨组织消化液在牙槽骨细胞分离中的用途。

本发明提供一种牙槽骨细胞的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：

1)将牙槽骨组织置于所述牙槽骨组织消化液中消化；

2)消化过程中研磨所述牙槽骨组织；

3)将步骤2)的混合体系转移至摇床上继续消化，消化结束后细胞从牙槽骨组织中释放至消化液中；

4)将含细胞的消化液转移至另一容器中终止消化；向牙槽骨组织中加入新的牙槽骨组织消化液在摇床上继续消化；

5)重复步骤4)多次；

6)合并多次消化后含细胞的消化液以及牙槽骨组织；

7)将步骤6)的混合体系去除骨碎屑后得到牙槽骨细胞。

如上所述，本发明的牙槽骨组织消化液及其在牙槽骨细胞分离中的用途和方法，具有以下有益效果：实现快速提取牙槽骨组织单细胞悬液，且符合单细胞测序所要求的高活性和高浓度，将有利于在单细胞层面对牙槽骨代谢相关疾病的研究，具体如下：

1.可成功的从体积约为15-20mm³的牙槽骨组织中提取获得30000-50000个牙槽骨组织单细胞。

2.提取出的细胞活性高达90％。

3.所提取的牙槽骨的单细胞悬液可成功的用于单细胞测序实验，进而对牙槽骨组织的细胞类群进行详细分析。可以克服单细胞测序对来源于不同组织，如胰腺、心肌组织和骨骼的单细胞的高活性、高浓度的要求，为开展骨组织尤其是牙槽骨相关疾病的单细胞测序研究奠定基础。

4.所提取的牙槽骨组织单细胞悬液还可以通过相应的细胞表面标志物对相应细胞进行提取进而进行后续的研究，尤其适用于人牙槽骨干细胞的提取，能够解决牙槽骨细胞难以提取，细胞得率低，细胞活性低，很难进行后续实验的问题。

附图说明

图1显示为流式细胞术分选利用本发明的方法分离获得的细胞结果图。

图2显示为检测分选所得的细胞活性比例图。

图3显示为检测分选所得的细胞的种群多样性结果图。

图4显示为单细胞测序方法检测牙槽骨内的各免疫细胞亚群。

具体实施方式

本发明首先提供一种牙槽骨组织消化液，所述牙槽骨组织消化液包括基础培养基、胶原酶、DNA酶、BSA、EDTA，以牙槽骨组织消化液的总体积为基准，所述胶原酶的终浓度为200～400U/ml，所述DNA酶的终浓度为50～150U/ml，所述BSA的终浓度为0.1～2mg/ml，所述EDTA的终浓度为0.5-1mM。

在一种实施方式中，所述基础培养基选自α-MEM、BME、DMEM、HAM F12、RPMI1640或199培养基。在一较佳实施方式中，所述基础培养基为α-MEM。

所述胶原酶选自单一类型的胶原酶或混合型的胶原酶。所述单一类型的胶原酶选自Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型或Ⅴ型胶原酶。在一种优选的实施方式中，所述胶原酶选自I型胶原酶。所述混合型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的几种类型的组合。

所述胶原酶的终浓度选自以下任一范围：200～250U/ml、250～270U/ml、270～290U/ml、290～300U/ml、300～310U/ml、310～330U/ml、330～350U/ml或350～400U/ml。优选的，所述胶原酶的终浓度为295～305U/ml。更优选的，所述胶原酶的终浓度为300U/ml。

所述DNA酶为DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I。DNase I是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。

所述DNA酶的终浓度选自以下任一范围：50～70U/ml、70～90U/ml、90～100U/ml、100～110U/ml、110～130U/ml或130～150U/ml。优选的，所述DNA酶的终浓度为90～110U/ml。更优选的，所述DNA酶的终浓度为100U/ml。

所述BSA是指牛血清白蛋白。所述BSA的终浓度选自以下任一范围：0.1～0.5mg/ml、0.5～0.7mg/ml、0.7～0.9mg/ml、0.9～1.1mg/ml、1.1～1.3mg/ml、1.3～1.5mg/ml或1.5～2mg/ml。优选的，所述BSA的终浓度为0.9～1.1mg/ml。更优选的，所述BSA的终浓度为1mg/ml。

所述EDTA是乙二胺四乙酸。所述EDTA的终浓度选自以下任一范围：0.5～0.7mM、0.7～0.9mM、0.9～1.1mM、1.1～1.3mM、1.3～1.5mM。优选的，所述EDTA的终浓度为0.9～1.1mM。更优选的，所述EDTA的终浓度为1mM。

所述牙槽骨组织消化液还包括抗生素。在一种实施方式中，所述抗生素为青霉素-链霉素混合液。

在一种实施方式中，以牙槽骨组织消化液的总体积为基准，所述青霉素的终浓度为50U/ml～150U/ml，和/或，所述链霉素的终浓度为0.05～0.15mg/ml。

所述牙槽骨组织消化液置于4℃保存，使用前37℃预热10分钟。

本发明还提供所述的牙槽骨组织消化液在牙槽骨细胞分离中的用途。

本发明提供一种牙槽骨细胞的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：

1)将牙槽骨组织置于所述牙槽骨组织消化液中消化；

2)消化过程中研磨所述牙槽骨组织；

3)将步骤2)的混合体系转移至摇床上继续消化，消化结束后细胞从牙槽骨组织中释放至消化液中；

4)将含细胞的消化液转移至另一容器中终止消化；向牙槽骨组织中加入新的牙槽骨组织消化液在摇床上继续消化；

5)重复步骤4)多次；

6)合并多次消化后含细胞的消化液以及牙槽骨组织；

7)将步骤6)的混合体系去除骨碎屑后得到牙槽骨细胞的单细胞悬液。

在一种实施方式中，在临床上获得的牙槽骨组织在进行细胞分离实验前先置于完全培养基中低温保存。所述低温保存是指在0～4℃的环境中保存。

在一种实施方式中，牙槽骨组织在消化之前先洗涤去掉完全培养基。洗涤可以是用PBS或生理盐水。

在一种实施方式中，所述牙槽骨组织消化液使用之前进行预热。优选的，将所述牙槽骨组织消化液预热至37℃。

在一种实施方式中，步骤1)中所述牙槽骨组织与牙槽骨组织消化液的比例为15～20mm³牙槽骨组织使用4ml牙槽骨组织消化液。

在一种实施方式中，消化过程中研磨所述牙槽骨组织可以使碎骨组织细化，增大牙槽骨组织与消化液的接触面积，加快消化进程。

在一种实施方式中，步骤3)中在摇床上消化的条件满足以下任一：34～38℃、100～140rpm、水平摇动。置于摇床上消化也可以增大牙槽骨组织与消化液的接触面积，加快消化进程。

在一种实施方式中，使用含10％血清的α-MEM培养基(完全培养基)终止消化。

步骤4)与步骤5)中将牙槽骨组织消化多次是保证充分消化，将牙槽骨组织中的细胞充分提取出来。在一优选的实施方式中，步骤5)中重复消化两次。

在一种实施方式中，步骤7)中还包括去除混合体系中的红细胞。在一种实施方式中，可以采用红细胞裂解液将红细胞裂解去除。

在一种实施方式中，步骤7)的步骤如下：将步骤6)获得的混合体系滤过40μm滤器后，再将去除红细胞后的混合体系，低温静置5分钟，使骨碎屑沉底后，取出的上清即为牙槽骨细胞的单细胞悬液。分离出的牙槽骨细胞均为单细胞。

步骤7)中将混合体系用滤器过滤可以去除较大的骨碎屑，低温静置可以去除滤器未过滤掉的骨碎屑，经过滤和静置后最终得到的单细胞悬液中存在较少量骨碎屑。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1牙槽骨的细胞提取

1.取出临床上口腔种植手术中产生的牙槽骨碎骨，体积约15mm³。置于完全培养基中(10％FBS+1％P/S+89％α-MEM培养基)，并立即置于冰上。

2.使用含1％的P/S(青霉素-链霉素混合液)的PBS冲洗碎骨组织2-3次。

3.配置牙槽骨消化液：将α-MEM培养基中加入300U/ml的collagenase type I、100U/ml的Dnase I、1％的P/S,1mg/ml的BSA以及1mM的EDTA，制成消化液。配置后置于4℃保存。使用前37℃预热10分钟。

4.将牙槽骨碎骨置于4ml消化液中，在研钵内仔细研磨，使碎骨组织细化，增大骨组织与消化液的接触面积。

5.转移碎骨组织以及全部消化液于6cm培养皿中，37℃下水平摇动消化(120rpm)，消化后单细胞会悬在消化液中。

6.将步骤5中含单细胞的消化液转移于新的50ml离心管中，并将管中加入两倍体积的含10％FBS的αMEM培养基。终止消化，冰上保存。

7.重新加入新的5ml消化液于碎骨组织中，继续消化使单细胞逐渐从碎骨组织中分离出来。

8.然后重复步骤5-7两次。消化三个循环后，将含单细胞的消化液以及碎骨组织转移入上述50ml离心管中。并使用完全培养基终止消化过程。

9.将步骤8)得到的混合液通过40μm滤器过滤。

10.通过离心获取细胞沉淀，转速为1000rpm，时间为5分钟。

11.将细胞沉淀中加入1ml ACK lysis buffer，混匀，冰上静置5分钟。接着加入15ml PBS中止裂解过程。

12. 300g离心7min获取细胞沉淀。

13.使用2ml完全培养基重悬细胞沉淀。

14.冰上静置5分钟，使骨碎屑沉入管底。取上清1.8ml细胞溶液于5ml的流式管中。

15.离心获得细胞沉淀，使用200μl PBS重悬，加入2μl浓度为2mM的Calcine溶液，避光37℃孵育30分钟。

16.孵育过后，使用完全培养基清洗单细胞悬液两遍，离心后重悬，上机分选FITC阳性(Calcine阳性)的细胞，结果如图1所示，可见清晰的分出一群呈Calcein阳性的活牙槽骨细胞，因此可确定分离获得的细胞为实验所需的骨细胞。分选获得的细胞即可获得牙槽骨单细胞悬液用于后续实验。

实施例2检测分选所得的细胞活性比例

将分选获取的牙槽骨细胞样品按照下述步骤做活死细胞染色。

1.将所获得牙槽骨细胞用按照5×10^5个细胞/ML的浓度重悬在PBS中。

2.每一毫升的细胞悬液中加入5μl的Draq7以及10μl的钙黄绿素，37度避光孵育20分钟。

3.孵育后将细胞悬液通过BD scanner(BD,USA)分析活性。

结果如图2所示，经过钙黄绿素染色(活细胞染色)可见镜下大量细胞呈现钙黄绿素阳性染色(图A，白色所示)，提示细胞为活细胞。Draq7染色(死细胞染色)结果显示镜下几乎不可见Draq7阳性染色(图B，白色为阳性染色)。通过计算钙黄绿素阳性细胞占总细胞数目比例显示该方法获取的牙槽骨单个细胞的活性比例可达90％以上(N＝5)(图C)。

实施例3检测分选所得的细胞的种群多样性

对获取的牙槽骨细胞进行流式分析。将细胞悬液与Thy1，PDPN,CD45流式抗体在4摄氏度下避光孵育半小时后，行流式上机检测。实验步骤除使用的抗体不同外，其余与实施例1中的流式步骤相同。

结果如图3所示，牙槽骨细胞中有15.7％的细胞呈Thy1(人骨骼前体细胞的标志物之一)阳性、31.2％的细胞呈PDPN(人骨骼干细胞的标志物之一)阳性，0.45％的细胞呈CD45(免疫细胞标志物之一)阳性。该结果提示通过该方法提取的人牙槽骨细胞能够较好的保持其细胞种群多样性。能符合单细胞测序要求。

实施例4对分选所得的细胞的单细胞测序

单细胞测序为送样委托第三方公司进行实验，大体步骤如下：将收集的牙槽骨单细胞悬液，经过细胞活性检测后，确定细胞活性大于80％以上。通过BD分选平台对每个细胞进行捕获。将细胞内的RNA片段结合磁珠。对结合磁珠标签的RNA进行逆转录引入CB和UMI。将逆转录得到的cDNA进行随机引物PCR扩增。随后通过Illumina Hiseq测序平台对产物进行上机测序，数据量为100G/样本。

结果如图4所示，通过单细胞测序方法检测显示牙槽骨内存在丰富的各免疫细胞亚群(T细胞、B细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、中性粒细胞)以及成骨系细胞，间充质细胞，内皮细胞，血管周细胞等。

结论：通过本发明的方法获得的牙槽骨单细胞悬液能够较好的保证牙槽骨的细胞活性以及细胞多样性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种牙槽骨组织消化液，其特征在于，所述牙槽骨组织消化液包括基础培养基、胶原酶、DNA酶、BSA、EDTA，以牙槽骨组织消化液的总体积为基准，所述胶原酶的终浓度为200～400U/ml，所述DNA酶的终浓度为50～150U/ml，所述BSA的终浓度为0.1～2mg/ml，所述EDTA的终浓度为0.5-1.5mM。

2.根据权利要求1所述的牙槽骨组织消化液，其特征在于，所述基础培养基选自α-MEM、BME、DMEM、HAM F12、RPMI1640或199培养基，和/或，所述胶原酶选自单一类型的胶原酶或混合型的胶原酶。

3.根据权利要求2所述的牙槽骨组织消化液，其特征在于，所述单一类型的胶原酶选自Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型或Ⅴ型胶原酶，和/或，所述混合型的胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的几种类型的组合。

4.根据权利要求1所述的牙槽骨组织消化液，其特征在于，所述牙槽骨组织消化液中还包括抗生素；优选的，所述抗生素为青霉素-链霉素混合液，以牙槽骨组织消化液的总体积为基准，所述青霉素的终浓度为50U/ml～150U/ml，和/或，所述链霉素的终浓度为0.05～0.15mg/ml。

5.权利要求1-4任一所述的牙槽骨组织消化液在牙槽骨细胞分离中的用途。

6.一种牙槽骨细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：

1)将牙槽骨组织置于权利要求1-4任一所述的牙槽骨组织消化液中消化；

2)消化过程中研磨所述牙槽骨组织；

3)将步骤2)的混合体系转移至摇床上继续消化，消化结束后细胞从牙槽骨组织中释放至消化液中；

4)将含细胞的消化液转移至另一容器中终止消化；向牙槽骨组织中加入新的牙槽骨组织消化液在摇床上继续消化；

5)重复步骤4)多次；

6)合并多次消化后含细胞的消化液以及牙槽骨组织；

7)将步骤6)的混合体系去除骨碎屑后得到牙槽骨细胞。

7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，步骤1)中15～20mm³牙槽骨组织使用4ml牙槽骨组织消化液。

8.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中在摇床上继续消化的条件满足以下任一：34～38℃、100～140rpm、水平摇动。

9.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，步骤7)中还包括去除混合体系中的红细胞。

10.根据权利要求9所述的分离方法，其特征在于，步骤7)的步骤如下：将步骤6)获得的混合体系经过40μm滤器过滤，再将去除红细胞后的混合体系放置于0～4℃下，使骨碎屑沉底，取出的上清即为牙槽骨细胞。

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