CN113186155A - 一种高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物细胞培养技术领域，尤其涉及一种绵羊胚胎骨骼肌细胞的原代培养方法。本发明的方法包括取材、消化、过滤和培养四个步骤，采用40目细胞筛过滤研磨后静置沉降，收集下层组织颗粒沉淀置于培养皿中培养，此方法中的组织颗粒直径介于组织块和单细胞悬液之间，不但降低了真菌、细菌污染的概率，同时大大提高了肌肉细胞的纯度和数量。此方法综合了组织块法和单细胞悬液的优势，能够获得高纯度、高活率、高活性且污染风险极低的骨骼肌细胞。

Description

一种高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法
技术领域
本发明属于动物细胞培养技术领域，尤其涉及一种高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法。
背景技术
我国是肉羊生产和消费大国，近年来随着居民生活水平的提升，羊肉市场需求旺盛。我国肉羊生产效率较低，产能与消费极不匹配。研究绵羊骨骼肌生长发育机制可提升肉羊产能效率，可以培养和建立绵羊骨骼肌原代细胞体外生长模型，为绵羊产肉相关研究奠定基础。
原代细胞培养是指从动物机体中取得组织后在体外进行的首次培养。原代细胞仍保留原组织的生物学和遗传特性，同时也最接近和反映体内生长特性。胚胎干细胞因具有自我更新和分化潜能的特性成为体外原代培养理想的实验材料。
现有的两种主要原代细胞培养方法为组织块法和单细胞悬液培养方法。两种方法各有优势和缺点：组织块法前期操作简单，在实验培养过程中对组织体积的损耗最少，但培养进程相对缓慢且极易感染真菌。单细胞悬液可最大化增加组织与培养皿接触面积，增加贴壁效率，但整个过程相较于组织颗粒法依然较为缓慢且对组织的损耗很大，不利于样本的充分使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：
（1）将采集的绵羊胎儿的四肢肌肉组织消毒，浸于含双抗的PBS缓冲液中，去除肌膜、纤维组织，然后将肌肉组织剪碎并漂洗；
（2）加入浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶，液面没过组织即可，进行消化，消化完成后将含有肌肉组织的Ⅰ型胶原酶混合液离心弃掉上清液，加入DMEM/F12全培养基重悬；
（3）将重悬后的混合液用40目细胞筛研磨过滤，静置后弃去上层单细胞悬液，保留下层组织颗粒沉淀，重复加入全培养基重悬，静置以最大程度除去单细胞悬液和杂质，将最终获得的组织颗粒沉淀用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，轻轻吹打均匀；
（4）将混匀后的组织颗粒沉淀悬液接种至细胞培养皿后置于培养箱中培养5~7d。
根据本发明的具体实施例的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法包括以下步骤：
（1）将采集的绵羊子宫用75%的酒精反复喷洒消杀，剪开子宫取出胚胎置于超净台中，剪下胎儿的四肢并浸泡于75%酒精中约10min，用镊子分离四肢肌肉并浸于含双抗的PBS缓冲液中，去除肌膜、纤维等组织，然后将肌肉组织剪碎并漂洗4~5次；
（2）加入浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶，液面没过组织即可，置于细胞培养箱中1h，期间每隔15min晃动混匀一次，消化完成后将含有肌肉组织的胶原酶混合液，800rpm离心10min，弃掉上清液，离心完成后加入DMEM/F12全培养基重悬；
（3）将重悬后的混合液用40目细胞筛研磨过滤，静置3~5min后弃去上层单细胞悬液，保留下层组织颗粒沉淀，重复加入全培养基重悬，静置以最大程度除去单细胞悬液和杂质。将最终获得的组织颗粒沉淀用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，轻轻吹打均匀；
（4）将混匀后的组织颗粒沉淀悬液接种至细胞培养皿后置于培养箱中培养5~7d。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（1）中将肌肉组织剪碎成约为1mm3的不规则小块。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（2）中将培养箱条件设定为温度37℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（2）中胶原酶粉末使用PBS缓冲液稀释。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（3）中研磨过程使用的研磨工具是灭菌处理后的1.5mL离心管，将离心管盖盖紧，使用倒置的离心管盖面研磨。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（3）研磨过程中弃去细胞筛上无法研磨的胶冻状组织。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（3）中过滤液最适静置时间为3~5min。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（3）中用移液器吸取组织颗粒时，将1mL吸头尖部用剪刀剪去2mm后使用。
根据本发明的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其中，步骤（3）结束后培养5~7d，且贴壁细胞比例达80%左右即可进行消化传代，在传代过程中使用差速贴壁法进行纯化去除成纤维细胞。
本申请的组织颗粒法与现有的组织块法和酶消化法的本质区别在于不同的培养方法具有不同的颗粒粒径，其中，组织块法一般约为2×2×2mm的组织块（人工剪切，不太准确），酶消化法为单细胞即单个细胞的大小（约为75×75×75μm，按通常酶消化法使用细胞筛孔径200目计算）。而组织颗粒法利用40目细胞筛获得的是约为400×400×400μm大小的组织颗粒。
现有细胞培养的思路一方面是尽量获得单细胞（也就是颗粒粒径最小）从而达到最大接触面积增加实验成功率，另一方面是尽量获得完整的组织块进行培养（也就是颗粒粒径最大，大到肉眼可见人工剪切即可），这二者都走向原代细胞培养颗粒粒径的两个极端，对于成肌细胞这类贴壁细胞而言，本领域技术人员大都遵循以上方法，现有的技术改良也只是对细胞孔径稍加改良，并没有对颗粒粒径的问题进行深入研究，尽管实际上得到了少部分细胞颗粒并优化了实验，但从本质上思路依然没有改变，且远没有体现出组织颗粒的最大优势。
本申请的技术方案相对于现有技术的实质性改进在于细胞筛的孔径选择，如上所述，细胞筛的孔径决定了组织颗粒的大小，而组织颗粒过大或过小都会影响培养效果，如何在兼顾现有两种方法的优势前提下又能准确找到粒径的最佳值是本申请的难点。本发明的技术方案采用的40目细胞筛过滤产生的组织颗粒与单细胞和组织块是量变产生质变的根本性区别。
根据本申请的技术方案，组织颗粒的粒径超过40目或小于40目均影响技术效果。例如，如组织颗粒的粒径大于40目（即组织块法），则会导致贴壁时间长，细胞量低和易产生细菌真菌污染等问题。如果组织颗粒的粒径小于40目（即酶消化法）会导致贴壁慢、细胞量低等问题。
根据本申请的技术方案，除对组织颗粒的粒径的优化外，还优化了过滤后过滤液的处理方式。组织块法通常无需过滤，酶消化法在过滤后会将过滤液中悬浮的单细胞通过离心的方式聚集在离心管底部，弃去上清以获得单细胞进行培养。而根据本发明的技术方案，过滤后将过滤液静置，组织颗粒会自动沉降至离心管底部，而单细胞悬浮于过滤液中，不能通过静置沉降至离心管底部，必须离心才能到达底部，这样就可以获得相对纯的细胞颗粒。悬浮细胞在培养液中悬浮不能贴壁或长时间贴壁会损耗养分，而申请的技术方案可以减少这种情况，使组织颗粒获得更多的养分以促进细胞更快的贴壁增殖。
现有技术中公开了制备牛胎儿骨骼肌组织来源成肌细胞的方法，该方法使用的细胞筛孔径为100μm（约为140目）与之后同时使用的40μm（约为325目）要远小于本发明所用细胞筛，其获得的是单细胞悬液，并且是十分纯净的细胞悬液，与本申请的组织颗粒截然不同。
本发明的有益效果在于：本申请的组织颗粒法是对现有两种方法的综合和改良，本申请的方法中使用的组织颗的颗粒直径介于组织块和单细胞悬液之间，使其兼具两种方法的优点并可以最大化加快细胞培养进程。组织颗粒法还可联合差速贴壁法提高细胞纯度，在整个培养过程中真菌、细菌等微生物感染的可能性也大大降低。
附图说明
图1显示原代培养第4天贴壁细胞镜下观察结果，其中，“Z”为组织块法，“M”为酶消化法，“K” 为本申请的组织颗粒法；
图2显示原代培养第10天肌管结构镜下观察结果，其中，“Z”为组织块法，“M”为酶消化法，“K” 为本申请的组织颗粒法；
图3显示成肌细胞原代培养3种培养方法细胞计数结果，其中，“Z”为组织块法，“M”为酶消化法，“K” 为本申请的组织颗粒法；
图4显示对成肌细胞进行免疫荧光鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
实施例1
（1）选取湖羊子宫及宫内72胎龄胚胎，将采集的绵羊子宫用75%的酒精反复喷洒消杀，剪开子宫取出胚胎置于超净台中，剪下胎儿的四肢并浸泡于75%酒精中约10min，将肌肉组织剪碎成约为1mm3的不规则小块，用镊子分离四肢肌肉，浸于含双抗的PBS缓冲液中，去除肌膜、纤维等组织，然后用眼科剪将肌肉组织剪碎并漂洗4~5次。
（2）胶原酶粉末使用PBS缓冲液稀释，加入浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶，液面没过组织即可，置于细胞培养箱中1h，将培养箱条件设定为温度37℃、体积分数为5% CO2及饱和湿度，期间每隔15min晃动混匀一次。消化完成后将含有肌肉组织的胶原酶混合液，800rpm离心10min，弃掉上清液。离心完成后加入DMEM/F12全培养基重悬。
（3）将重悬后的混合液用40目细胞筛研磨过滤，研磨过程中弃去细胞筛上无法研磨的胶冻状组织，滤液静置3~5min后弃去上层单细胞悬液，保留下层组织颗粒沉淀，重复加入全培养基重悬，静置以最大程度除去单细胞悬液和杂质。将最终获得的组织颗粒沉淀用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，轻轻吹打均匀。
（4）将混匀后的组织颗粒沉淀悬液接种至细胞培养皿后置于培养箱中培养5~7d，且贴壁细胞比例达80%左右即可进行消化传代，在传代过程中使用差速贴壁法进行纯化去除成纤维细胞。
整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。
图1所示普通倒置相差显微镜（20×10）原代培养第4天贴壁细胞镜下观察结果，其中，“Z”为组织块法，“M”为酶消化法，“K”为本申请的组织颗粒法。如图1所示，刚分离的原代湖羊胚胎骨骼肌成肌细胞形态呈圆形且折光性强。随着培养时间增加，成肌细胞开始贴壁生长并逐渐向梭形或多边形延伸。培养至第4天，三种培养方法均可观察到梭形贴壁细胞，细胞形态无显著差异，但“组织颗粒法”观察到的贴壁细胞数量最多、生长速度最快。
如图2所示，培养至第7天成肌细胞发生分化可观察到明显的肌管结构，8~9天肌管逐渐增粗和成熟，10天后肌管排列成束，肌管数达到峰值。三种培养方法在肌管形态上无显著差异，但“组织颗粒法”观察到的肌管数量最多，管径最粗。肌管为成肌分化的重要标志性结构，说明所培养细胞为成肌细胞且增殖、分化能力较强。
如图3所示，细胞计数结果显示三种方法培养的成肌细胞均可正常生长，前1~3天为适应期，增殖缓慢。4天后开始快速增殖，第7天到达平台期。其中“组织颗粒法”在4天后增殖速率显著高于酶消化法及组织颗粒法。10天后“组织颗粒法”增殖速率开始下降，酶消化法及组织块法增殖速率仍处于较低水平，无显著变化。根据本申请的技术方案，如组织颗粒的粒径大于40目（即组织块法），则会导致贴壁时间长，细胞量低和易产生细菌真菌污染等问题。如果组织颗粒的粒径小于40目（即酶消化法）会导致贴壁时间长，细胞量低等问题。
如图4所示，通过免疫荧光染色检测绵羊骨骼肌成肌细胞的特异性表面抗原标记物α-sarcomeric actinin，镜下观察结果显示成肌细胞对α-sarcomeric actinin抗体反应呈阳性，阳性产物分布于细胞质中，呈明显的亮绿色。而DAPI染核可以使细胞核核仁呈蓝紫色。当免疫荧光染色和DAPI染核同时进行时，细胞表现为细胞质呈亮绿色，细胞核呈蓝紫色。结合形态学观察确定所培养细胞为成肌细胞且纯度较高，培养48h细胞标记蛋白表达水平和细胞核数量较24h显著升高。
实施例2
（1）选取湖羊子宫及宫内39胎龄胚胎，将采集的绵羊子宫用75%的酒精反复喷洒消杀，剪开子宫取出胚胎置于超净台中，剪下胎儿的四肢，将肌肉组织剪碎成约为1mm3的不规则小块并浸泡于75%酒精中约10min，用镊子分离四肢肌肉，浸于含双抗的PBS缓冲液中，去除肌膜、纤维等组织，然后用眼科剪将肌肉组织剪碎并漂洗4~5次。
（2）胶原酶粉末使用PBS缓冲液稀释，加入浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶，液面没过组织即可，置于细胞培养箱中1h，将培养箱条件设定为温度37℃、体积分数为5% CO2及饱和湿度，期间每隔15min晃动混匀一次。消化完成后将含有肌肉组织的胶原酶混合液，800rpm离心10min，弃掉上清液。离心完成后加入DMEM/F12全培养基重悬。
（3）将重悬后的混合液用40目细胞筛研磨过滤，研磨过程中弃去细胞筛上无法研磨的胶冻状组织，过滤静置3~5min后弃去上层单细胞悬液，保留下层组织颗粒沉淀，重复加入全培养基重悬，静置以最大程度除去单细胞悬液和杂质。将最终获得的组织颗粒沉淀用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，轻轻吹打均匀。
（4）将混匀后的组织颗粒沉淀悬液接种至细胞培养皿后置于培养箱中培养5~7d，贴壁细胞比例达80%左右即可进行消化传代，在传代过程中使用差速贴壁法进行纯化去除成纤维细胞。结果表明，通过本发明的方法，选取39胎龄胚胎，可以成功培养胚胎骨骼肌原代细胞。
整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。
最后应当说明的是，以上实施案例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管本发明作了实例的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将采集的绵羊胎儿的四肢肌肉组织消毒，并浸于缓冲液中，去除肌膜、纤维组织，然后将肌肉组织剪碎并漂洗；
（2）加入浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶，进行消化，消化完成后将含有肌肉组织的Ⅰ型胶原酶混合液离心弃掉上清液，加入DMEM/F12全培养基重悬；
（3）将重悬后的混合液用40目细胞筛研磨过滤，静置后弃去上层单细胞悬液，保留下层组织颗粒沉淀，重复加入全培养基重悬，静置以最大程度除去单细胞悬液和杂质，将最终获得的组织颗粒沉淀用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，吹打均匀；
（4）将混匀后的组织颗粒沉淀悬液接种至细胞培养皿后置于培养箱中培养5~7d。
2.根据权利要求1所述的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，将含有肌肉组织的Ⅰ型胶原酶混合液在温度37℃下放置1h，期间每隔15min晃动混匀一次。
3.根据权利要求1所述的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，将所采集的绵羊胎儿的四肢肌肉组织剪碎成1mm3的不规则小块。
4.根据权利要求1所述的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其特征在于，步骤（3）中研磨过程使用的研磨工具是灭菌处理后的1.5mL离心管，将离心管盖盖紧，使用倒置的离心管盖面研磨。
5.根据权利要求1所述的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其特征在于，步骤（3）研磨过程中弃去细胞筛上无法研磨的胶冻状组织。
6.根据权利要求1所述的高效率的绵羊胚胎骨骼肌原代细胞培养方法，其特征在于，在步骤（3）中，将细胞筛研磨过滤所得的滤液静置3~5min。
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GR01 Patent grant
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