CN115747090A - 乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途 - Google Patents

乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115747090A
CN115747090A CN202111421350.1A CN202111421350A CN115747090A CN 115747090 A CN115747090 A CN 115747090A CN 202111421350 A CN202111421350 A CN 202111421350A CN 115747090 A CN115747090 A CN 115747090A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus
strain
composition
gmnl
antibiotics
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111421350.1A
Other languages
English (en)
Inventor
蔡宛桦
叶玟伶
吴嘉霖
赖志河
叶耀宗
黄晟协
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genmont Biotech Inc
Original Assignee
Genmont Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmont Biotech Inc filed Critical Genmont Biotech Inc
Publication of CN115747090A publication Critical patent/CN115747090A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/23—Lactobacillus acidophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途，其中所述乳杆菌组合物包含有植物乳杆菌GMNL‑141菌株、鼠李糖乳杆菌GM‑020菌株、嗜酸乳杆菌GMNL‑185菌株、或其组合，能够有效改善因抗生素导致的个体肠道菌相失衡，并协助稳定与提升肠道菌相的物种丰富度，以及增加肠道中有助于稳定情绪之黄酮与黄酮醇的合成、异喹啉生物碱的合成、烟酸盐与烟碱酰胺的合成、及短链脂肪酸的合成，因此能够有效改善抗生素造成的焦虑症。

Description

乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途
技术领域
本发明涉及乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途，尤其是关 于一种包含植物乳杆菌GMNL-141菌株、鼠李糖乳杆菌GM-020菌株、一嗜 酸乳杆菌GMNL-185菌株、或其组合的乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的 焦虑症的用途。
背景技术
焦虑症(Anxiety)是最常见的精神疾病，世界上大约八分之一的人口患有此 种疾病。焦虑症最主要的症状是过度的焦虑与担忧，并会引起自律神经亢进， 产生胸闷、心悸、盗汗、肠胃不适等症状，且可能合并有坐立不安、急躁易怒、 倦怠、肌肉紧绷、失眠、注意力欠集中、或脑筋一片空白等症状，而影响到患 者的正常生活。
抗生素(Antibiotics)是指可抑制细菌生长或杀死细菌的化学物质，是临床 中最常被用来治疗及预防细菌感染相关疾病的药物。然而，近期有许多研究指 出抗生素的使用，可能会扰乱患者肠道微生物群的组成，进而引发个体产生精 神分裂症、自闭症、焦虑、及抑郁症等神经精神相关疾病的副作用。
在过去的研究中，已发现个体的肠道微生物群及其代谢物与维持其宿主的 神经、内分泌、及免疫系统的平衡相关。而在压力源的刺激下，藉由下视丘- 垂体-肾上腺轴分泌糖皮质激素、肾上腺素及去甲肾上腺素，可能会增加免疫 细胞中促炎细胞因子的表达及分泌，进而扰乱个体肠道微生物群的组成，并可 能因此导致焦虑症或其他神经精神相关疾病的产生。
目前尚未能得知不同疾病与不同肠道菌群之间的确切关系，以及额外施用 何种具体菌群，能够对肠道及在全身水准下及对任何具体类型疾病具有确切作 用皆尚未充分表征，尤其是对中枢神经系统疾病而言。
综上所述，在益生菌相关技术领域中，需要找寻新的方法以有效地治疗特 定疾病，尤其是因应抗生素的高使用频率而产生的焦虑症等副作用。
发明内容
为解决前述问题，本发明之一目的在于提供一种改善抗生素造成的焦虑症(Anxiety)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)GMNL-141菌 株，其寄存编号为NITE BP-03510。
本发明又一目的在于提供一种改善抗生素造成的焦虑症的乳杆菌组合物， 包含如上所述的植物乳杆菌GMNL-141菌株。
在本发明又一实施例中，该乳杆菌组合物进一步包含一鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)GM-020菌株、一嗜酸乳杆菌 (Lactobacillusacidophilus,L.acidophilus)GMNL-185菌株、或其组合；其中， 该鼠李糖乳杆菌GM-020菌株的寄存编号为CCTCC M203098，且该嗜酸乳杆 菌GMNL-185菌株的寄存编号为CCTCCM2017764。
其中，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)GM-020 菌株公开在申请号为200410030169.8，授权公告号为CN100396770C的专利中。 所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,L.acidophilus)GMNL-185菌株公 开在申请号为201810666262.X，授权公告号为CN110628660B的专利中。
在本发明又一实施例中，该植物乳杆菌GMNL-141菌株、该鼠李糖乳杆 菌GM-020菌株、及该嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株以1:1:1比例混合。
在本发明又一实施例中，该植物乳杆菌GMNL-141菌株、该鼠李糖乳杆 菌GM-020菌株、及该嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株是为活菌或死菌。
在本发明又一实施例中，该抗生素是为安比西林(Ampicillin)。
本发明之又一目的在提供一种乳杆菌组合物用于制备改善抗生素造成的 焦虑症的医药组成物的用途，其中该乳杆菌组合物是为如前所述的乳杆菌组合 物。
在本发明又一实施例中，该抗生素是为安比西林(Ampicillin)。
在本发明又一实施例中，该乳杆菌组合物是改善抗生素造成的肠道菌相失 衡及/或肠道菌相物种丰富度下降。
在本发明又一实施例中，该乳杆菌组合物是提升肠道菌群中比菲德氏菌属 的丰度及/或降低葡萄球菌属的丰度。
在本发明又一实施例中，该乳杆菌组合物是增加肠道中黄酮(flavone)与 黄酮醇(flavonol)的合成、异喹啉生物碱(isoquinoline alkaloid)的合成、及/ 或烟酸盐(nicotinate)与烟碱酰胺(nicotinamide)的合成。
本发明又一实施例中，该乳杆菌组合物是增加肠道中短链脂肪酸 (short-chainfatty acids,SCFA)的合成。
本发明又一实施例中，该乳杆菌组合物的有效量为每日至少6.7x108 cfu/ 公斤。
本发明又一实施例中，该医药组成物是为一医药品、一营养补充品、一保 健食品、或其任意组合。
本发明又一实施例中，该医药组成物进一步包含一医药学上可接受的赋形 剂、载剂、辅剂、及/或食品添加剂。
本发明另一实施例中，该医药组成物的剂型是为一喷雾气体、一溶液、一 半固态制剂、一固态制剂、一明胶胶囊、一软胶囊、一锭剂、一丸剂、一糖浆、 一口含锭、一片剂、一口嚼胶、及/或一冷冻干燥粉末制剂。
本发明以动物实验，筛选出于改善抗生素造成焦虑症具有最佳功效的鼠李 糖乳杆菌GM-020菌株、植物乳杆菌GMNL-141菌株、以及嗜酸乳杆菌 GMNL-185菌株，并将该三益生菌株制备成复合配方的本发明益生菌组合物， 且经由动物实验证实，不论低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物，皆能有效 改善抗生素造成的个体焦虑行为，且其功效皆优于使用单一益生菌株。
再者，本发明益生菌组合物能够改善因抗生素导致的个体肠道菌相失衡， 并协助稳定与提升肠道菌相的物种丰富度，尤其是提高比菲德氏菌属的丰度及 降低葡萄球菌属的丰度，以使个体肠道菌相快速回复为接近健康个体的状态， 另外本发明益生菌组合物能够藉由调节个体肠道菌相，以增加肠道中有助于稳 定情绪的黄酮与黄酮醇的生合成、异喹啉生物碱的生合成、以及烟酸盐与烟碱 酰胺的代谢，且亦能够直接增加肠道中短链脂肪酸的合成，据此来改善个体因 服用抗生素所导致的焦虑症或焦虑行为。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用 以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本 发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后 附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1A为管喂本发明益生菌组合物后，改善小鼠筑巢量下降的测试结果。 其中，a表示与NC进行比较，P<0.05；b表示与Amp进行比较，P<0.05；c 表示与NC进行比较，P＝0.06。
图1B为管喂本发明益生菌组合物后，改善小鼠游泳求生能力下降的测试 结果。其中，a表示与NC进行比较，P<0.05；b表示与Amp进行比较，P<0.05； d表示与NC进行比较，P＝0.08。
图2A为管喂本发明益生菌组合物后，将包含负控制组、正控制组小鼠的 道菌群以菌门进行分类的操作单元表。
图2B为管喂本发明益生菌组合物后，将包含负控制组、正控制组小鼠的 肠道菌群以菌属进行分类的操作单元表。
图3为管喂本发明益生菌组合物后，改善小鼠肠道菌群的α多样性分析结 果。
图4为管喂本发明益生菌组合物后，与负控制组、正控制组小鼠肠道菌群 的比较的LEfSe分析结果。
图5A为图4的LEfSe分析结果中，小鼠肠道菌群中葡萄球菌属的丰度； 其中，命中表示仪器侦测到该细菌的次数。
图5B为图4的LEfSe分析结果中，小鼠肠道菌群中比菲德氏菌属的丰度； 其中，命中表示仪器侦测到该细菌的次数。
图6为各组以PICRUSt2分析后有统计差异的生理调控路径以Venn图进 行交集的示意图。
以上各图式中，NC表示未经抗生素造症、亦未管喂本发明益生菌组合物 的小鼠；Amp或Amp H2O则表示经抗生素造症、且未进一步管喂本发明益生 菌组合物的小鼠；AmpLABL或Amp-LABL则表示经抗生素造症后，进一步 管喂低剂量的本发明益生菌组合物的小鼠；Amp LABH或Amp-LABH则表示 经抗生素造症后，进一步管喂高剂量的本发明益生菌组合物的小鼠。
具体实施方式
本文中所使用的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为本发明 所属技术领域中具通常知识者可共同了解的意义。
本文所述的「有效量」是表示能有效改善哺乳动物或人类因服用抗生素造 成的焦虑症或焦虑行为所需益生菌组合物的数量；能有效改善哺乳动物或人类 因服用抗生素造成的肠道菌相失衡、及/或肠道菌相物种丰富度下降所需益生 菌组合物的数量；能有效提升哺乳动物或人类的肠道菌群中比菲德氏菌属的丰 度及/或降低葡萄球菌属的丰度所需益生菌组合物的数量；能有效提升哺乳动 物或人类的肠道菌群中比菲德氏菌属的丰度及/或降低葡萄球菌属的丰度所需 益生菌组合物的数量；能有效增加哺乳动物或人类的肠道中黄酮与黄酮醇的合 成、异喹啉生物碱的合成、及/或烟酸盐与烟碱酰胺的合成所需益生菌组合物 的数量；能有效增加哺乳动物或人类的肠道中短链脂肪酸的合成所需益生菌组合物的数量。有效量依所施用的生物种类或个体差异而可能不同，但可藉由例 如剂量递增试验(dose escalation)以实验决定其有效量。
本文所述的「益生菌组合物」是表示包含有植物乳杆菌GMNL-141的乳 杆菌组合物，或进一步包含有鼠李糖乳杆菌GM-020菌株及/或嗜酸乳杆菌 GMNL-185菌株的乳杆菌组合物。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳 为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
使用Excel软体进行统计分析。数据以平均值±标准误差(Standard Error ofMean,SEM)表示，并以Student's t-test分析二组之间的样本平均值，是否具 有统计学上的显著差异性(P<0.05)。
本文所述的「益生菌株(Probiotic或Probiotic bacteria)」为一微生物，其 菌体、混合菌株、萃取物或代谢产物对于宿主本身是具有正面影响，通常源自 于个体内、有益于个体健康的细菌，亦可指外来补充、对个体可能有益的某些 微生物。
依据本发明，有关细菌培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术 的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，有关管喂实验动物细菌组合物(或在本文中所称益生菌组合 物)的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行 技术范畴内。
依据本发明，有关实验动物肠道菌相的检测与分析的操作程序与参数条件 等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
本文所述的「丰富度」是指种类的多样性，例如物种丰富度表示物种的多 样性；而本文所述的「丰度」则是指单一种类的多寡，例如细菌丰度表示该细 菌的数量多寡。
本发明提供一种新颖的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)GMNL-141菌株，其是一种具有改善抗生素造成的焦虑症或焦虑行为功效的益 生菌株；本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株是分离自人类小肠的肠道检体； 利用习知的方法萃取本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株的总RNA(total RNA) 后，藉由如序列辨识编号SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的引子对(上游引 子为PAF primer，下游引子为536R primer)扩增其16SrRNA基因部分的序列， 其中所得的核酸片段如序列辨识编号SEQ ID NO：3所示；其中，关于萃取总 RNA的方法诚属本发明所属技术领域具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。 接着，将该核酸片段(SEQ ID NO：3)与美国国家生物技术资讯中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)基因库(GenBank)中，七种植物乳 杆菌16S rRNA基因序列(GenBank编号分别为：NR_117813.1、NR_104573.1、 NR_042394.1、NR_029133.1、NR_113338.1、NR_115605.1、以及NR_136785.1) 进行比对后，具有99％以上的序列一致性，因此确认本发明GMNL-141菌株 为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)。
SEQ ID NO：1的序列为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(PAF primer)。
SEQ ID NO：2的序列为5'-GTATTACCGCGGCTGCTG-3'(536R primer)。
SEQ ID NO：3的序列为 GGCGTGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTG GTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAAC ACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATG CTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGG GTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATC GGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCA GTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGT GAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACA TATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCAC GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGGGGTAATACAA。
本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株的生理特征如下：生长温度为35℃至 40℃、生长酸碱值为pH 4.0至7.0、氧气影响则为兼性厌氧(facultative anaerobic)；本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株的培养方法如下：将该 GMNL-141菌株接种于琼脂培养基(De Man,Rogosa and Sharpe,MRS)上于37℃ 环境进行培养；本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株的菌落的外观特征如下： 边缘完整、平均大小为3毫米x 3毫米、菌落呈微白色且较大、表面平滑隆起； 本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株的型态特征则如下：呈杆状(杆菌；bacilli)、 无孢子形成、且无移动性；而本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株的格兰氏染 色结果为阳性。
本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株已于2021年8月23日，寄存于日本 的国家技术与评估研究所(National Institute of Technology and Evaluation， NITE)的生物资源中心(Biological Resource Center)，且寄存编号为NITE BP-03510。
相较于习知的植物乳杆菌CCTCC M2017767菌株，将本发明植物乳杆菌 GMNL-141菌株喂食给经抗生素诱发焦虑症的小鼠时，可观察到其改善小鼠焦 虑行为的功效明显地较其所属物种的习知菌株为佳。
基于上述的有益生物活性，本发明植物乳杆菌GMNL-141菌株预期具有 可用于改善焦虑症相关病症的潜力。因此，本发明另提供一种包含本发明植物 乳杆菌GMNL-141菌株的乳杆菌组合物，其中又可以进一步包含有：鼠李糖 乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)GM-020菌株、嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus,L.acidophilus)GMNL-185菌株、或其组合；其中， 该鼠李糖乳杆菌GM-020菌株及该嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株已分别寄存于 中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(430072中国-武汉-武汉大学)，该鼠李糖 乳杆菌GM-020菌株的寄存编号为CCTCC M203098，寄存日期则为2003年 12月18日，而该嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株的寄存编号为CCTCC M2017764， 寄存日期则为2017年11月3日。其中，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)GM-020菌株公开在申请号为200410030169.8，授权 公告号为CN100396770C的专利中。所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus, L.acidophilus)GMNL-185菌株公开在申请号为201810666262.X，授权公告号 为CN110628660B的专利中。其中，该植物乳杆菌GMNL-141菌株、该鼠李 糖乳杆菌GM-020菌株、及该嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株亦包含其继代培养 的后代，或突变株，但仍具有与本发明所述的菌种特性、基因体(genome)、 或用途相同者。
本发明的乳杆菌组合物可以应用于制备一医药组成物的用途，该医药组成 物是用以改善抗生素造成的焦虑症；其中，该医药组成物可以为一医药品、一 营养补充品、一保健食品、或其任意组合，且可以进一步包含一医药学上可接 受的赋形剂、载剂、辅剂、及/或食品添加剂。
在本发明之一较佳实施例中，将本发明的乳杆菌组合物配制于一医药学上 可接受的载剂(pharmaceutically acceptable vehicle)中，并制成一适用于口服投 药(oraladministration)的剂型(dosage form)，且该医药组成物较佳为呈一选自 于下列群组中的剂型：溶液(solution)、悬浮液(suspension)、粉末(powder)、 锭剂(tablet)、丸剂(pill)、糖浆(syrup)、口含锭(lozenge)、片剂(troche)、 口嚼胶(chewing gum)、胶囊(capsule)、及其类似者。
依据本发明，该医药学上可接受的载剂可以包含一或多种选自于下列的试 剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、 螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂 (preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂 (absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的 选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组 中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)、 及其组合。
在本发明另之一较佳实施例中，可以将本发明的乳杆菌组合物制备成一食 品产品，并以可食用性材料配制成包含但不限于：饮料(beverages)、发酵食 品(fermentedfoods)、烘培产品(bakery products)、保健食品(health foods)、 营养补充品(nutritional supplement)、以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明，该可食性材料是选自于由水(water)、流体乳品(fluid milkproducts)、牛奶(milk)、浓缩牛奶(concentrated milk)；发酵乳品(fermented milk)，诸如优酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷冻优格(frozen yogurt)、乳 杆菌发酵饮料(lactic acid bacteria-fermented beverages)；奶粉(milk powder)； 冰淇淋(icecream)；乳酪(cream cheeses)；干酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；发酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable-fruit juices)；果 汁(juices)；运动饮料(sports drinks)；甜点(confectionery)；果冻(jellies)；糖 果(candies)；婴儿食品(infant formulas)；健康食品(health foods)；动物饲料 (animal feeds)；中草药材(Chinese herbals)；膳食补充品(dietary supplements) 所组成的群组。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方 法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料 配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
以下将详细说明：组成本发明益生菌组合物的益生菌株的筛选方法；以及 本发明益生菌组合物改善抗生素造成的个体焦虑行为的功效测试、及测试与分 析本发明益生菌组合物改善抗生素造成的个体焦虑行为的具体方法。以证实本 发明的益生菌组合物具有改善抗生素导致焦虑的功效，而能用于制备对应功效 的组合物。
实施例1
本发明益生菌组合物的组成益生菌株筛选
在本发明的一实施例中，为筛选有效改善抗生素所致个体焦虑行为的益生 菌株，使用经抗生素造症的小鼠作为实验动物进行测试，并以小鼠游泳求生能 力降低，做为抗生素造成小鼠焦虑行为的指标。详细测试方法如下：首先，购 入7周龄的C57BL/6品是雄性小鼠，并先将小鼠入室稳定生长一周后，再开 始进行试验分组，而为了避免各个试验分组间的小鼠差异，于试验开始前一日， 先进行小鼠游泳求生评估。
接着，将小鼠分成以下十二组：第(1)至(10)组为管喂益生菌实验组(Test)： 连续两日以口服方式给予小鼠抗生素(本发明实施例中使用安比西林， Ampicillin)以进行造症，抗生素的剂量为100mg/公斤小鼠/天，并于第三日开 始连续五日以管喂方式给予小鼠低剂量的单株益生菌，在本发明实施例中，益 生菌是以活菌冷冻干燥粉配置在100μL的无菌水中进行喂食，而低剂量的单 株益生菌为1.6x108 cfu/小鼠/天，其中第(1)至(10)组的益生菌株分别为：(1)鼠 李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)GM-020菌株、(2)罗伊氏 乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri,L.reuteri)CCTCC M207154菌株、(3)发酵乳 杆菌(Lactobacillus fermentum,L.fermentum)CCTCC M204055菌株、(4)植物 乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)GMNL-141菌株、(5)嗜酸乳杆 菌(Lactobacillus acidophilus,L.acidophilus)GMNL-185菌株、(6)干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,L.casei)CCTCC M2013197菌株、(7)发酵乳杆菌 (Lactobacillusfermentum,L.fermentum)、(8)副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei,L.paracasei)CCTCC M2016225菌株、(9)鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)CCTCCM2017766菌株、以及(10)植物 乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)CCTCCM2017767菌株；第(11) 组为负控制组(Sham)：连续两日口服给予小鼠磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，以下简称PBS溶液)，并于隔日开始连续五日给予无菌Milli-Q 超纯水(默克，以下简称MQ水)，共六只小鼠；以及第(12)组为正控制组(Control)：连续两日口服给予小鼠抗生素(本发明实施例中使用安比西林，Ampicillin)以进 行造症，抗生素的剂量为100mg/公斤小鼠/天，并于隔日开始连续五日给予无 菌MQ水，共六只小鼠。
接着，于分组结束后第四日(即整体测试的第十二日)进行小鼠游泳求生 能力评估，而为比较与评估不同批动物改善个体焦虑行为的功效，以下公式分 别量化给予第(1)至(10)组益生菌株后，回复小鼠游泳能力的功效(I)，以作为选 择具最佳功效益生菌株的参考：
Figure BDA0003377497290000111
给予经抗生素造症小鼠该十种不同益生菌株后，回复小鼠游泳求生能力的 功效测试结果如表1所示，其中可以看出具有最佳回复小鼠游泳求生能力的功 效的前三名，分别为测试组(1)的鼠李糖乳杆菌GM-020菌株、测试组(4)的植 物乳杆菌GMNL-141菌株、以及测试组(5)的嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株，且 此三菌株的功效皆分别明显地优于相同菌种的其他菌株，显示鼠李糖乳杆菌 GM-020菌株、植物乳杆菌GMNL-141菌株、以及嗜酸乳杆菌GMNL-185菌 株具有改善个体焦虑行为的功效；接着，更进一步地，将该前三名功效最佳的益生菌株以1:1:1的比例混合，以形成复合配方的本发明益生菌组合物，并以 上述方法测试该益生菌组合物改善抗生素所致个体焦虑行为的功效，详细测试 方法将于后续进行描述。
表1
Figure BDA0003377497290000112
实施例2
本发明益生菌组合物改善抗生素造成的个体焦虑行为
在本发明的一实施例中，为测试实施例1所述的本发明益生菌组合物于改 善抗生素所致个体焦虑行为的功效，以实施例1的方法，使用经抗生素造症的 小鼠作为实验动物进行测试，并以小鼠筑巢及游泳求生能力降低，做为抗生素 造成小鼠焦虑行为的指标。
详细测试方法如下：首先，同样于试验开始前一日，先进行小鼠筑巢测试 及游泳求生评估，接着将小鼠分成(13)低剂量测试组(Amp-LABL)、及(14)高 剂量测试组(Amp-LABH)，每组共五只小鼠，分别连续两日以口服方式给予 小鼠抗生素以进行造症，抗生素的剂量为100mg/公斤小鼠/天，并于第三日开 始连续五日以管喂方式给予小鼠低剂量或高剂量的益生菌组合物；其中，低剂 量的益生菌组合物为1.6x108cfu/小鼠/天，换算为60公斤成人的人体剂量为每 日4x1010cfu，而高剂量的益生菌组合物则为4.8x108cfu/小鼠/天，换算为60 公斤成人的人体剂量为每日1.2x1011cfu；另外，同样以实施例1的方式进行 负控制组(NC)与正控制组(Amp或Amp H2O)的测试；其中，复合配方的本 发明益生菌组合物是将鼠李糖乳杆菌GM-020菌株、植物乳杆菌GMNL-141 菌株、以及嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株以相等菌数混合成高菌数菌粉(1x1011 cfu/g)，再将该高菌数菌粉以无菌水稀释成特定浓度剂量后再喂食给小鼠。
接着，于整体测试的第八日(即分组结束后隔日)、及整体测试的第十二 日(即分组结束后第四日)分别进行小鼠筑巢测试及游泳求生能力评估，其结 果分别如图1A及图1B所示；其中，由图1A可以看出，相较于正控制组(Amp H2O)，于使用抗生素造症，并经管喂低剂量的本发明益生菌组合物 (Amp/LABL)后，于第十二日可以观察到小鼠于筑巢能力的行为变化有明显的 改善；而相较于正控制组(Amp H2O)，于使用抗生素造症，并经管喂高剂量的本发明益生菌组合物(Amp/LABH)后，于第八日与第十二日皆可以观察到 小鼠于筑巢能力的行为变化有明显的改善，显示高剂量的本发明益生菌组合物 可以在较短地时间内即较快速地达到功效。
由图1B则可以看出，相较于正控制组(Amp H2O)，于使用抗生素造症， 并经管喂低剂量的本发明益生菌组合物(Amp/LABL)后，于第八日即可观察到 小鼠于游泳求生能力的行为变化有明显的改善；而相较于正控制组(Amp H2O)，于使用抗生素造症，并经管喂高剂量的本发明益生菌组合物 (Amp/LABH)后，亦可以于第八日就观察到小鼠于游泳求生能力的行为变化有 明显的改善。
综合以上结果，在经抗生素造症后，不论给予小鼠低剂量或高剂量的本发 明益生菌组合物，皆可有效地改善其于筑巢能力及游泳求生能力的行为变化， 显示低剂量与高剂量的本发明益生菌组合物，都可以有效改善抗生素造成的个 体焦虑行为，而高剂量则可以在较短地时间内即较快速地达到功效。
在本实施例中，为进一步比较与评估复方的本发明益生菌组合物相较于单 株益生菌，于改善个体焦虑行为的功效，同样以实施例1的公式(I)量化低剂量 与高剂量的益生菌组合物，于回复小鼠游泳能力的功效，并以下列公式(II)量 化低剂量与高剂量的益生菌组合物，于回复小鼠筑巢能力的功效：
Figure BDA0003377497290000131
量化后结果如表2所示，其中可以看出，相较于单独使用实施例1中测试 组(1)的鼠李糖乳杆菌GM-020菌株、测试组(4)的植物乳杆菌GMNL-141菌株、 以及测试组(5)的嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株，使用第(13)组低剂量的本发明益 生菌组合物、或第(14)组高剂量的本发明益生菌组合物，于改善小鼠筑巢能力 与小鼠游泳能力的功效趋势，皆明显优于使用单一益生菌株。
表2
Figure BDA0003377497290000132
实施例3
本发明益生菌组合物改善肠道菌相以改善抗生素造成的个体焦虑
在本发明的一实施例中，为进一步了解本发明益生菌组合物以何种机制改 善抗生素造成的个体焦虑行为，利用高通量(high-throughput)次世代定序(next-generationsequencing,NGS)技术及生物资讯学，进一步分析经服用本发 明益生菌组合物后已改善焦虑行为的小鼠的菌相变化，以评估本发明益生菌组 合物是否藉由调节个体的菌相以达到改善焦虑的目的。
在实施例2中，给予实验动物低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物后， 包含负控制组与正控制组，分别取样各个测试组中每只老鼠的肠道组织，其中 是剪下靠近小鼠盲肠的远端回肠(distal ileum)，并将组织剪碎后再利用均质仪 震荡该些检体以使取样的肠道组织均质化，接着进行离心并取得在上清液中的 肠道菌群微生物，利用QIAmp快速DNA分离套组(购自Qiagen，德国)依 据标准操作手册进行肠道菌群微生物的DNA萃取。接着，利用微量检体分光 光度计(NanoDrop 2000)将所萃取的DNA进行浓度检测(O.D 260与O.D280 的比值必须介于1.7～2.2之间，且DNA浓度大于50ng/μL)，并利用该套组中 所附的洗脱缓冲溶液(elution buffer,EB)将各检体稀释至4到6ng/μL，以进 行后续的16S rRNA(16S ribosomal RNA)的次世代定序分析，来鉴定各组小鼠 肠道菌群的物种组成。
在进行16S rRNA的次世代定序分析时，利用KAPA HiFi DNA聚合酶(购 自Roche，美国)将16S rRNA的变异区3与变异区4进行放大(V3-V4)，并 将放大后的DNA利用KAPA纯化磁珠(购自Roche，美国)进行纯化。接着， 将经纯化的DNA利用毛细管电泳(FragmentAnalyzer，购自Advanced analytical，美国)以及萤光分光光度计(Qubit 3.0，购自ThermoFisher，美国 USA)进行纯化后DNA的品质确认后，将经纯化的DNA进行第二次PCR建立文库(Nextera XT Index Kit A，购自Illumina，美国)，并将所获得的PCR产 物再次使用KAPA纯化磁珠进行纯化，并使用毛细管电泳以及萤光分光光度 计进行品质确认，同时确认浓度，而待已建库标示好的DNA混合后浓度达到 4nM时，将其与20％的病毒DNA(PhiXControl，购自Illumina，美国)混合， 再使用MiSeq v3 600cycle分析套组进行各测试组小鼠肠道菌相的16S rRNA 的次世代定序。
接着，将获得的16S rRNA的次世代定序结果，进行生物资讯学的分析。 首先，将进行次世代定序后所获得的Fastq利用Qiime2分析软体，使小于400 的DNA片段以DaDa2进行去除，并比对Greengene v13.8资料库中相似度达97％的序列片段，以建立操作单元表(Operational Taxonomic Unit,OTU table)， 其中将各组小鼠肠道中的细菌，分别以菌门OUTs及菌属OUTs进行分类，并 将分析结果制作成柱状图，分别如图2A及2B所示，而其中各柱状为多只小 鼠的肠道菌相变化消长的平均情形。
由图2A及2B中可以看出，相较于未喂食抗生素的负控制组，喂食抗生 素进行造症后，确实会造成小鼠肠道的菌相产生明显地改变；而于喂食抗生素 进行造症后，再以管喂低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物，则能够使小鼠 肠道的菌相消长成较为相似负控制组的健康小鼠肠道菌相。更具体地来说，在 被喂食抗生素的正控制组(Amp)的小鼠肠道菌相中，厚壁菌门(Firmicutes)以 及葡萄球菌属的丰度皆会明显地增加，而拟杆菌门(Bacteroidetes)、乳酸杆菌 属(Lactobacillus)、以及拟杆菌属(Bacteroidales,f_S24-7)的丰度则皆会明显地 降低；在负控制组、喂食低剂量本发明益生菌组合物、以及为高剂量本发明益 生菌组合物的小鼠肠道菌相中，则呈现完全相反的分布趋势。此结果显示，本发明益生菌组合物能够使因服用抗生素而造成的肠道菌相改变与失衡，回复为 接近健康个体的肠道菌相。
实施例4
本发明益生菌组合物增加因抗生素造成焦虑的个体中肠道物种丰富度
再者，亦有研究指出服用抗生素可能会造成肠道菌相的α多样性降低，因 此在本发明的实施例中，为进一步评估本发明益生菌组合物是否能够改善抗生 素导致的α多样性(α-diversity)降低，而进一步分析经服用本发明益生菌组 合物后已改善焦虑行为的小鼠的肠道菌相的α多样性；其中，α多样性是指样 本内或栖地内的单一群集的生物多样性。具体分析方法为将前述以Qiime2分 析软体获得的操作单元表，直接进行物种多样性分析(alpha Diversity,Shannon Diversity)，结果如图3所示。
由图3中可以看出，相较于未喂食抗生素的负控制组，喂食抗生素进行造 症后，确实会造成小鼠肠道菌的多样性降低；而于喂食抗生素进行造症后，再 以管喂低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物，则可以较快地回复肠道菌相的 物种多样性，此结果显示本发明益生菌组合物可以帮助稳定个体的菌相，而较 快地回复肠道的健康。
另外，在探讨个体的菌相多样性时，经常使用进化分支图的方式，来呈现 16SrRNA的次世代定序的分析结果，而其中又常以LEfSe分析(Linear discriminant analysis(LDA)Effect Size)进行其进化分支图的演算；LEfSe分析 是一种用于找寻高维生物标记与筛选基因组特征的分析演算法，能够在组与组 的间寻找统计上具显著差异的生物标记(Biomarker)，而应用于菌相多样性分 析时，LEfSe分析可以找出各组间在丰度上具有显著差异的微生物种类，而此 演算法强调的是统计意义及生物相关性。因此，在本发明的实施例中，又进一 步利用Galaxy-The Huttenhower Lab提供的LEfSe analysis线上分析软体，进行 各组小鼠肠道菌相之间的主要微生物分析，其中设定成当LDAScore大于2 即判定为具有意义的核心菌群，分析结果如图4所示。
在图4的进化分支图中，由内至外辐射的圆圈代表由菌门至菌属(或菌种) 的分类层级，在不同分类层级中的每一个小圆圈代表该层级的一个分类群，该 些小圆圈的直径大小则代表其相对丰度的大小，接着将在组间具有显著差异的 微生物种类，依据其原始分组(即负控制组、正控制组、低剂量本发明益生菌 组合物组、及低剂量本发明益生菌组合物组)的代表色进行着色后，再将各组 小鼠肠道菌群中，具有显著变化的菌科、菌属、菌种整理于表3，并将其中变 化最显著的葡萄球菌属(Staphylococcus)与比菲德氏菌属(Bifidobacterium)于 各组的丰度分别整理绘制成图5A及图5B；其中，在进行菌相分析时，仪器 侦测到细菌的次数以％命中表示，命中数目越高或者是命中占比越高的话，代 表侦测到该菌种的总数越多。
表3
Figure BDA0003377497290000161
Figure BDA0003377497290000171
由图5A及图5B中可以看出，仅喂食抗生素具有焦虑行为的正控制组小 鼠的肠道菌群中，葡萄球菌属(Staphylococcus)的丰度相较于其他三组的肠道 菌群皆明显地增加，显示葡萄球菌属与个体焦虑行为的出现有关；此外，于喂 食抗生素进行造症后，再以管喂低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物的小鼠 肠道菌群中，比菲德氏菌属(Bifidobacterium)的丰度则相对明显地增加，显示 比菲德氏菌属与本发明益生菌组合物改善抗生素造成的个体焦虑行为有关，又 已知比菲德氏菌属为对人体健康有益的细菌，且对于情绪的稳定有正向帮助。
综合以上分析结果可以得知，本发明益生菌组合物得以藉由改善抗生素造 成的个体的肠道菌相失衡，并协助回复与稳定肠道菌相的物种多样性，且增加 其中比菲德氏菌属的丰度，以改善因抗生素而造成的个体焦虑。
实施例5
本发明益生菌组合物增加因抗生素造成焦虑的个体中稳定情绪物质的合成
在本发明的一实施例中，为了解本发明益生菌组合物所调控的肠道微生物， 又进一步利用PICRUSt2(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstructionof Unobserved States 2)分析前述各组小鼠肠道微生物所参与的 调控路径，以了解本发明益生菌组合物透过影响个体的何种生理调控路径，来 改善抗生素造成的个体焦虑行为；其中，PICRUSt2是一套根据所标记基因的 序列，来预测微生物功能丰度的工具，且可应用于预测16S rRNA序列的功能。
首先，将实施例3中所得的各组小鼠肠道菌相的16S rRNA定序结果，包 含负控制组、正控制组、低剂量本发明益生菌组合物、及高剂量本发明益生菌 组合物，分别以PICRUSt2进行肠道微生物参与的生理调控路径的预测分析， 接着将各组预测分析所得到的生理调控路径，以下列分组：(1)负控制组(NC) 比对正控制组(Amp)、(2)正控制组(Amp)比对低剂量本发明益生菌组合物 组(Amp-LABL)、以及(3)正控制组(Amp)比对高剂量本发明益生菌组合物组 (Amp-LABH)，两两进行比对以找出具有统计差异的生理调控路径，其中所有 的分析结果在p值小于0.05即被认为具统计意义。
接着，将前述三个比对中找出的具有统计差异的生理调控路径，利用Venn 图进行交集，以进一步找出在这三个比对共同具有统计差异的生理调控路径， 结果如图6所示，其中可以看出：负控制组(NC)比对正控制组(Amp)，小 鼠肠道菌相改变后约影响102条生理调控路径；正控制组(Amp)比对低剂量 本发明益生菌组合物组(Amp-LABL)，后约影响100条生理调控路径；以及正 控制组(Amp)比对高剂量本发明益生菌组合物组(Amp-LABH)，后约影响81 条生理调控路径；其中，有49条生理调控路径是这三个比对中，共同具有统 计差异变化的生理调控路径。
为了解与本发明益生菌组合物改善个体焦虑行为相关的生理调控路径，将 此49条详细的生理调控路径分别在这三个比对中，呈现为上升(Increase,I) 或下降(Decrease,D)的趋势汇整于表4，其中可以看出，黄酮(flavone)与黄酮 醇(flavonol)的生合成、异喹啉生物碱(isoquinoline alkaloid)的生合成、以及烟 酸盐(nicotinate)与烟碱酰胺(nicotinamide)的代谢(即维生素B3的酰胺形式 代谢)皆为在服用抗生素进行造症的组别中呈现下降趋势，而于造症后再管喂 低剂量或高剂量本发明益生菌组合物的别中，又会呈现上升趋势的生理调控路 径，且在过去的研究中，显示此3条生理调控路径所合成出的物质，皆为可以 增加情绪稳定性而具有改善个体焦虑功效的物质；此结果表示，本发明益生菌 组合物能够回复因抗生素导致下降的该些生理调控路径，以增加稳定情绪物质的合成，而具有改善个体因抗生素造成的焦虑行为的有益功效。
表4
Figure BDA0003377497290000181
Figure BDA0003377497290000191
Figure BDA0003377497290000201
此外，由表4亦可以看出，在服用抗生素进行造症的组别中，发生金黄葡 萄球菌感染的情形会呈现上升趋势，而于造症后再管喂本发明益生菌组合物的 组别中，发生金黄葡萄球菌感染的情形则会呈现下降趋势，而在过去的研究中， 亦发现金黄葡萄球菌感染会造成个体菌相紊乱，且会影响短链脂肪酸 (short-chain fatty acids,SCFA)的生合成；此结果显示，本发明益生菌组合物能 够减缓因抗生素导致上升的金黄葡萄球菌感染，以产生改善个体因抗生素造成 的焦虑行为的有益功效。
实施例6
本发明益生菌组合物增加因抗生素造成焦虑之个体中短链脂肪酸的合成
由于过去研究显示个体肠道微生物所分泌的短链脂肪酸，有助于稳定该个 体的情绪、认知、及行为，以有效减少个体焦虑的发生，因此在本发明的一实 施例中，进一步测试本发明益生菌组合物是否能够增加个体肠道中短链脂肪酸 的合成，以产生改善因抗生素造成个体焦虑的功效。
在完成实施例2中，给予实验动物低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物 后，包含负控制组与正控制组，分别取样每个测试组中每只老鼠的粪便，并将 取自同组不同只的小鼠粪便以等量混合成单一管分析样品，再使用气相层析质 谱仪(Gas ChromatographyMass Spectrometry,GC/MS)分析各管分析样品的 粪便中短链脂肪酸的组成，并将其结果以单位μmol/g表示；其中，短链脂肪 酸主要包含乙酸、丙酸、以及丁酸。
详细的样品处理与检测方法简述如下：首先，取个测试组小鼠的粪便样品 共0.5g，并放置于15mL的离心管中，再加入5mL的纯水溶解后，振荡2 分钟，接着将离心(7000rpm，5分钟)完的上清液进行过滤(0.45μm)后， 将溶液装入新的15mL离心管内，即为各测试组的分析样品。接着，取2mL 制备后的分析样品于新的15mL的离心管中，加入0.2mL的50％硫酸溶液， 再加入2mL的乙醚，并振荡30次后离心(>10,000rpm，5分钟)，接着放置于冰箱(4℃)内30分钟后，取上层的乙醚溶液层以气相层析质谱仪(GC/MS) 进行分析，气相质谱的条件如下：使用FFAP弹性石英毛细管柱(30m×0.25 mm×0.25μm)；色谱柱温度程序：100℃(1分钟)，5℃/分钟升至150℃(5分 钟)；载气：高纯氮气，纯度≧99.999％；载气流速2mL/分钟；进样口温度： 270℃；进样方式：无分流进样，进样量2.0μL；检测器温度(FID)：280℃。 最后，以标准品作为比对基准，换算每公克粪便分析样品中六种短链脂肪酸的 含量，并以单位μmole/g表示。
各组小鼠粪便中短链脂肪酸脂含量的测量结果如表5所示；由表5中可以 看出，相较于未喂食抗生素的负控制组，喂食抗生素进行造症后，小鼠粪便中 乙酸的含量会些微地降低，而丙酸与丁酸的含量则会明显地降低，若于喂食抗 生素进行造症后，再以管喂低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物后，小鼠粪 便中乙酸、丙酸、与丁酸的含量皆会明显地回升，此些结果显示个体肠道中短 链脂肪酸的减少，确实会导致个体焦虑行为的产生，且本发明益生菌组合物能 够藉由增加个体肠道中短链脂肪酸的合成，来改善抗生素造成的个体焦虑。
表5
Figure BDA0003377497290000211
综上所述，本发明以动物实验，筛选出于改善抗生素造成焦虑症具有最佳 功效的鼠李糖乳杆菌GM-020菌株、植物乳杆菌GMNL-141菌株、以及嗜酸 乳杆菌GMNL-185菌株，并将该三益生菌株制备成复合配方的本发明益生菌 组合物，且经由动物实验证实，不论低剂量或高剂量的本发明益生菌组合物， 皆能有效改善抗生素造成的个体焦虑行为，且其功效皆优于使用单一益生菌株。
再者，本发明益生菌组合物能够改善因抗生素导致的个体肠道菌相失衡， 并协助稳定与提升肠道菌相的物种丰富度，尤其是提高比菲德氏菌属的丰度及 降低葡萄球菌属的丰度，以使个体肠道菌相快速回复为接近健康个体的状态， 另外本发明益生菌组合物能够藉由调节个体肠道菌相，以增加肠道中有助于稳 定情绪的黄酮与黄酮醇的生合成、异喹啉生物碱的生合成、以及烟酸盐与烟碱 酰胺的代谢，且亦能够直接增加肠道中短链脂肪酸的合成，据此来改善个体因 服用抗生素所导致的焦虑症或焦虑行为。
【符号说明】
无。
【生物材料寄存】
1.植物乳杆菌GMNL-141菌株寄存于日本的國家技術與評估研究所的生 物資源中心；2021年8月23日；寄存编号为NITE BP-03510。
2.鼠李糖乳杆菌GM-020菌株寄存于中国典型培养物保藏中心；2003年 12月18日；寄存编号为CCTCC M203098。
3.嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株寄存于中国典型培养物保藏中心；2017年 11月3日；寄存编号为CCTCC M2017764。
Figure IDA0003377497410000011
Figure IDA0003377497410000021

Claims (16)

1.一种改善抗生素造成的焦虑症的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)GMNL-141菌株，其特征在于，所述GMNL-141菌株的寄存编号为NITE BP-03510。
2.一种改善抗生素造成的焦虑症的乳杆菌组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的植物乳杆菌GMNL-141菌株。
3.根据权利要求2所述的乳杆菌组合物，其特征在于，其中所述乳杆菌组合物进一步包含一鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,L.rhamnosus)GM-020菌株、一嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,L.acidophilus)GMNL-185菌株、或其组合；其中，所述鼠李糖乳杆菌GM-020菌株的寄存编号为CCTCC M203098，所述嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株的寄存编号为CCTCC M2017764。
4.根据权利要求3所述的乳杆菌组合物，其特征在于，其中所述植物乳杆菌GMNL-141菌株、所述鼠李糖乳杆菌GM-020菌株、及所述嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株以1:1:1比例混合。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的乳杆菌组合物，其特征在于，其中所述植物乳杆菌GMNL-141菌株、所述鼠李糖乳杆菌GM-020菌株、及所述嗜酸乳杆菌GMNL-185菌株为活菌或死菌。
6.根据权利要求2～4中任一项所述的乳杆菌组合物，其特征在于，其中所述抗生素为安比西林(Ampicillin)。
7.一种乳杆菌组合物用于制备改善抗生素造成的焦虑症的医药组成物的用途，其特征在于，其中所述乳杆菌组合物为如权利要求2～4中任一项所述的乳杆菌组合物。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述抗生素系为安比西林(Ampicillin)。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述乳杆菌组合物是改善抗生素造成的肠道菌相失衡及/或肠道菌相物种丰富度下降。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述乳杆菌组合物是提升肠道菌群中比菲德氏菌属的丰度及/或降低葡萄球菌属的丰度。
11.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述乳杆菌组合物是增加肠道中黄酮(flavone)与黄酮醇(flavonol)的合成、异喹啉生物碱(isoquinoline alkaloid)的合成、及/或烟酸盐(nicotinate)与烟碱酰胺(nicotinamide)的合成。
12.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述乳杆菌组合物是增加肠道中短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)的合成。
13.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述乳杆菌组合物的有效量为每日至少6.7x108 cfu/公斤。
14.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述医药组成物为一医药品、一营养补充品、一保健食品、或其任意组合。
15.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述医药组成物进一步包含一医药学上可接受的赋形剂、载剂、辅剂、及/或食品添加剂。
16.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述医药组成物的剂型为一溶液、一悬浮液、一半固态制剂、一固态制剂、一明胶胶囊、一软胶囊、一锭剂、一丸剂、一糖浆、一口含锭、一片剂、一口嚼胶、及/或一冷冻干燥粉末制剂。
CN202111421350.1A 2021-09-06 2021-11-26 乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途 Pending CN115747090A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW110133093A TWI810645B (zh) 2021-09-06 2021-09-06 乳桿菌組合物及其改善抗生素造成之焦慮症的用途
TW110133093 2021-09-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115747090A true CN115747090A (zh) 2023-03-07

Family

ID=85332773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111421350.1A Pending CN115747090A (zh) 2021-09-06 2021-11-26 乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途

Country Status (3)

Country Link
US (1) US12012589B2 (zh)
CN (1) CN115747090A (zh)
TW (1) TWI810645B (zh)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1670183A (zh) * 2004-03-19 2005-09-21 景岳生物科技股份有限公司 新的微生物鼠李糖乳杆菌gm－020及其治疗肥胖的用途
CN105002109A (zh) * 2014-04-23 2015-10-28 法玛科技顾问股份有限公司 乳酸菌、包含该乳酸菌的组合物以及其用途
WO2016065419A1 (en) * 2014-10-28 2016-05-06 Medlab Ip Pty Ltd Treatment for depression and depressive disorders
CN108671135A (zh) * 2018-08-01 2018-10-19 泰安大凡神农生物有限公司 一种调理失眠和抑郁的中药益生菌复合物
CN110066753A (zh) * 2019-05-13 2019-07-30 吉林省农业科学院 植物乳杆菌dp189及其应用
CN110628660A (zh) * 2018-06-22 2019-12-31 景岳生物科技(中国)有限公司 一种乳酸菌组合物用于抑制胃幽门螺旋杆菌引发的胃炎及其用途
CN110791451A (zh) * 2019-11-25 2020-02-14 山东中科嘉亿生物工程有限公司 一株植物乳杆菌jylp-326及其对睡眠的改善应用和产品
CN111110705A (zh) * 2019-12-27 2020-05-08 河北一然生物科技有限公司 植物乳杆菌lp45在制备改善记忆力、缓解焦虑和缓解抑郁的产品中的应用
CN111329884A (zh) * 2020-02-18 2020-06-26 天津科技大学 植物乳杆菌bc299在炎症性肠病、精神性问题的药物、食品中的应用
CN111511899A (zh) * 2017-12-19 2020-08-07 杜邦营养生物科学有限公司 用于认知和心理健康的益生菌
CN112204129A (zh) * 2018-02-02 2021-01-08 Ko生物技术有限公司 植物乳杆菌kbl396菌株及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110140968A (zh) * 2019-06-18 2019-08-20 广州康泽医疗科技有限公司 一种缓解焦虑、抑郁，调节情绪偏差、减压助眠的益生菌组合物及其制备方法和应用
CN111728111B (zh) * 2020-06-28 2023-01-17 武汉康复得生物科技股份有限公司 一种缓解焦虑或抑郁的益生菌组合物及其应用

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1670183A (zh) * 2004-03-19 2005-09-21 景岳生物科技股份有限公司 新的微生物鼠李糖乳杆菌gm－020及其治疗肥胖的用途
CN105002109A (zh) * 2014-04-23 2015-10-28 法玛科技顾问股份有限公司 乳酸菌、包含该乳酸菌的组合物以及其用途
WO2016065419A1 (en) * 2014-10-28 2016-05-06 Medlab Ip Pty Ltd Treatment for depression and depressive disorders
US20170312232A1 (en) * 2014-10-28 2017-11-02 Medlab Ip Pty Ltd Treatment for depression and depressive disorders
CN111511899A (zh) * 2017-12-19 2020-08-07 杜邦营养生物科学有限公司 用于认知和心理健康的益生菌
CN111601608A (zh) * 2017-12-19 2020-08-28 杜邦营养生物科学有限公司 用于预防和/或治疗心理疾病的包含植物乳杆菌的组合物
CN112204129A (zh) * 2018-02-02 2021-01-08 Ko生物技术有限公司 植物乳杆菌kbl396菌株及其用途
CN110628660A (zh) * 2018-06-22 2019-12-31 景岳生物科技(中国)有限公司 一种乳酸菌组合物用于抑制胃幽门螺旋杆菌引发的胃炎及其用途
CN108671135A (zh) * 2018-08-01 2018-10-19 泰安大凡神农生物有限公司 一种调理失眠和抑郁的中药益生菌复合物
CN110066753A (zh) * 2019-05-13 2019-07-30 吉林省农业科学院 植物乳杆菌dp189及其应用
CN110791451A (zh) * 2019-11-25 2020-02-14 山东中科嘉亿生物工程有限公司 一株植物乳杆菌jylp-326及其对睡眠的改善应用和产品
CN111110705A (zh) * 2019-12-27 2020-05-08 河北一然生物科技有限公司 植物乳杆菌lp45在制备改善记忆力、缓解焦虑和缓解抑郁的产品中的应用
CN111329884A (zh) * 2020-02-18 2020-06-26 天津科技大学 植物乳杆菌bc299在炎症性肠病、精神性问题的药物、食品中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WAN-HUA TSAI等: "Suppressive Effects of Lactobacillus on Depression through Regulating the Gut Microbiota and Metabolites in C57BL/6J Mice Induced by Ampicillin", 《BIOMEDICINES》, vol. 11, no. 4, pages 1068 *
YONG SJ等: "Antidepressive Mechanisms of Probiotics and Their Therapeutic Potential", 《FRONTIERS IN NEUROSCIENCE》, vol. 13, 14 January 2020 (2020-01-14), pages 1361, XP093077807, DOI: 10.3389/fnins.2019.01361 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20230081322A1 (en) 2023-03-16
TWI810645B (zh) 2023-08-01
TW202310860A (zh) 2023-03-16
US12012589B2 (en) 2024-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20180018354A (ko) 바실러스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
CN113180109A (zh) 罗伊氏乳杆菌在制备预防或治疗发育障碍类疾病产品中的应用
CN102399718B (zh) 副干酪乳酸杆菌株gmnl‑133、用于改善异位性皮肤炎或其它过敏疾病的组合物及其用途
EA034795B1 (ru) Способ определения изменений фекальной микробиоты индивида после приема композиции, содержащей микроорганизмы
JP2018536427A (ja) 肥満および関連する代謝障害を処置するためのビフィドバクテリウム・ロングム
WO2013107913A1 (en) Gaba-producing culturable bacteria derived from the human gastrointestinal tract
JP2021519763A (ja) 炎症性腸疾患を治療するための組成物及び方法
CN116981468A (zh) 益生菌组合物以及使用其促进儿童生长和社交功能的方法
US10307445B2 (en) Bacterial strains having an outstanding ability to produce menaquinone
CN112616932A (zh) 保护口腔健康的羊奶片及其制备方法
CN114642676A (zh) 人参皂苷在改善肠道菌群结构和/或肠屏障功能的应用
CN115068508B (zh) 一种动物双歧杆菌在制备预防或治疗抑郁症的药物中的应用
CN115747090A (zh) 乳杆菌组合物及其改善抗生素造成的焦虑症的用途
CN115429821A (zh) 一种用于预防龋齿、调节肠道菌群和免疫力的复合益生菌后生元组合物及制备方法和应用
WO2019113023A9 (en) Probiotics and methods of use
WO2022151669A1 (en) Lactobacillus amylovorus lam1345 isolate, composition including the same and use thereof
WO2022192854A1 (en) Methods to induce biopterin and related metabolites
EP4133944A1 (en) Composition for improving intestinal bacterial flora
KR20190094109A (ko) 비피도박테리움 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
JP7195714B2 (ja) 炎症性腸疾患用組成物
EP4275682A1 (en) Carbon monoxide-releasing molecule (corm) or composition thereof for use in the treatment or the prevention of an intestinal dysbiosis in a subject
EP2580343B1 (en) Use of abo type in a method for tailoring a bacterial composition
RU2799556C2 (ru) Композиции и способы лечения воспалительных заболеваний кишечника
US20210315808A1 (en) Bacillus subtilis containing composition for teatement of gastrointestinal irregulairty
JP7008435B2 (ja) 小腸の腸内環境改善剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination