CN111601608A - 用于预防和/或治疗心理疾病的包含植物乳杆菌的组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了一种包含植物乳杆菌的组合物，用于预防和/或治疗哺乳动物的心理疾病、影响心理健康的症状和/或与慢性压力相关的病症。所述组合物可用于恢复、维持和/或促进心理(包括认知)健康，且特别是在膳食和食物补充剂和药物领域具有潜在应用。

Description

用于预防和/或治疗心理疾病的包含植物乳杆菌的组合物
技术领域
本发明涉及包含新颖植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株的组合物。特别地，本发明涉及新颖植物乳杆菌菌株的组合物，用于预防和/或治疗哺乳动物中特征在于例如抑郁、焦虑、知觉压力、认知功能缺陷和痴呆的心理症状的心理疾病、影响心理健康的症状和/或与慢性压力相关的病症。本发明还涉及包含新颖植物乳杆菌菌株的组合物(包括食物产品、膳食补充剂和药学上可接受的配制品/组合物)的方法和用途。
背景技术
心理健康与情绪、心理、身体和社会福祉有关。我们的心理健康状况决定了我们如何处理压力。心理疾病可以定义为如下健康状况，所述健康状况改变了一个人的思维、感情或行为(或所有这三者)，并导致其在社会、工作或家庭活动中的苦恼和功能性问题。心理疾病包括与焦虑、情绪、精神病、饮食行为、冲动控制和成瘾、个性、社交能力、分离、强迫和创伤后压力有关的大范围的障碍。每种疾病都以不同的方式改变一个人的思想、感情和/或行为。帕金森病、癫痫和多发性硬化症等障碍都是脑部障碍，但它们被认为是神经系统疾病而不是心理疾病。有趣的是，心理疾病和神经疾病(包括记忆障碍(如轻度认知损害、痴呆和阿尔茨海默病))之间的界限并没有明确界定，并且现在越来越多的证据表明心理疾病与脑结构、化学和功能的变化有关，而这些变化可能是神经障碍发展的基础。例如，神经认知缺陷和情绪障碍之间的联系已被充分确定，使得在严重抑郁中，认知损害可以模仿在痴呆中观察到的情况(Rabins等人Br J Psychiatry[英国精神病学杂志]1984；144:488-92)。
此外，未经治疗的慢性压力会导致严重的健康状况，如焦虑、肌肉疼痛、高血压和免疫系统减弱。研究表明，压力会导致心脏病、抑郁和肥胖等重大疾病的发展。急性和慢性压力症状可在胃肠道中表现出来，分别对胃肠道功能造成短期和长期影响。暴露于压力导致肠-脑轴中的改变，最终导致一系列胃肠障碍的发展，包括炎症性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)和其他功能性胃肠道疾病、食物抗原相关的不良反应、消化性溃疡和胃食管反流病(GERD)。压力对肠道生理的主要影响包括：1)胃肠动力改变；2)内脏感觉增加；3)胃肠道分泌的变化；4)肠通透性增加；5)对胃肠粘膜再生能力和粘膜血流量的负面影响；和6)肠道微生物组成的改变(Konturek等人J.Physiol Pharmacol.[生理与药理学]2011；62(6):591-9)。
关于心理疾病和相关的神经认知功能减退和神经障碍，现在明确强调实现积极的心理和认知健康的战略，以实现充实和健康的生活。对用以实现积极的心理健康而且没有副作用的营养疗法的需求增加。目前治疗影响心理健康的心理疾病症状的药物有许多负面的副作用，如恶心、食欲增加和体重增加、疲劳和胃肠道症状。膳食补充剂可能代表了一种有吸引力的手段，以实现积极的心理健康和防止心理疾病的症状和相关病症的发展。
肠-脑轴描述了存在于脑和肠之间的双向交流，而微生物-肠-脑轴支持肠微生物组在这种交流系统中的作用。如上文所述，影响心理健康的心理疾病和症状与胃肠障碍共病，由此情绪和日常生活压力可扰乱消化功能，反之亦然。越来越多的证据表明，肠道微生物群对脑生理、心理反应和最终行为产生深远影响(Dinan等人J.Psychiatr Res.[精神病学研究杂志]2015；63:1-9)。新出现的证据表明，益生菌可以影响中枢神经系统功能并且调节情绪、心理症状(如焦虑和抑郁)，以及生理、行为和脑功能方面与压力有关的变化。
发明目的
本发明的目的是提供用于预防和/或治疗心理疾病、影响心理健康的症状和/或治疗与慢性压力相关的病症的手段。因此，本发明的目的是提供一种手段，通过所述手段可以促进、维持和/或恢复个体的心理健康。
发明内容
本发明基于植物乳杆菌的新颖菌株，特别是基于本文所述的研究，这些研究令人惊讶地证明，这些菌株可以显著抵消压力对行为(焦虑、抑郁和认知功能)、生化和功能结局的影响。
因此，在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含于2018年1月9日以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151。
在另一方面，本发明提供了包含植物乳杆菌菌株LP12418的组合物，所述菌株于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ。
在另一方面，本发明提供了包含植物乳杆菌菌株LP12407的组合物，所述菌株于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ。
在又一方面，本发明提供一种组合物，其包含以下各项的组合：(a)至少两种选自由以下组成的组的植物乳杆菌菌株：植物乳杆菌菌株LP12418、植物乳杆菌菌株LP12407和植物乳杆菌菌株LP12151，和(b)于2017年10月5日以保藏号DSM 32661保藏在DSMZ的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株Lpc-37。
在另一方面，本发明提供包含植物乳杆菌菌株LP12418、植物乳杆菌菌株LP12151和/或植物乳杆菌菌株LP12407的组合物，用于预防和/或治疗哺乳动物中的心理疾病、影响心理健康的症状和/或与慢性压力相关的病症。
另一方面，本发明提供一种治疗和/或预防心理疾病、影响心理疾病的症状和/或与慢性压力相关的病症的方法，其中所述方法包括向有需要的哺乳动物施用组合物，所述组合物包含：
a.于2018年1月9日以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151
b.于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418；和/或
c.于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407。
在又另一方面，本发明提供包含植物乳杆菌菌株LP12151、植物乳杆菌菌株LP12418和/或植物乳杆菌菌株LP12407的组合物在制备用于预防和/或治疗哺乳动物中的心理疾病、影响心理健康的症状和/或与慢性压力相关的病症的药物中的用途。
在又一方面，本发明提供了植物乳杆菌菌株LP12418、和/或植物乳杆菌菌株LP12407和/或植物乳杆菌菌株LP12151的组合，用于分开地、顺序地或同时地用于预防和/或治疗哺乳动物中的心理疾病、影响心理健康的症状和/或与慢性压力相关的病症。
附图说明
图1.细菌对肠粘液粘附的测定。从结直肠癌患者中收集肠结肠粘液样品，并在体外细菌粘附测定中鉴定十种不同益生细菌对人肠粘液的粘附。如下测定粘附％(A)：(粘附后荧光-空白)/(最大荧光-空白)*100。HEPES-汉克缓冲液(HEPES-Hank’s buffer)作为空白。如下测定粘附比(B)：与粘液的粘附/与BSA的粘附。值大于1(虚线)表示与粘液的亲和力高于BSA，这表明粘液特异性结合能力。数据显示为来自五个单独粘液样品的数据的平均值+/-SD。
图2.在单独使用媒剂或使用选择的细菌菌株处理的组中，3周慢性压力对小鼠体重的影响。所有组N＝12，但压力/媒剂组(其中N＝11)和压力/LP12418组(其中N＝11)除外。统计分析：双因素ANOVA；体重(时间)：F(12,636)＝30.38，p<0.0001；体重(治疗)：F(4,636)＝6.54，p<0.0001
图3.在高架十字迷宫程序中，用选择的细菌菌株治疗对小鼠慢性压力诱导性焦虑的影响。测量了三个参数；开放臂中的时间(A)、自主活动(B)和开放臂进入(C)。所有组N＝12，但压力/媒剂组(其中N＝11)和压力/LP12418组(其中N＝11)除外。统计分析：单因素ANOVA；开放臂中的时间：F(4,57)＝10.68，p<0.0001；自主活动：F(4,57)＝1.057，p>0.05；开放臂进入：F(4,57)＝1.074，p>0.05；成对比较:*p<0.05，***p<0.001相比于无压力/媒剂组，#p<0.05，#p<0.01相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图4.在旷场程序中，用选择的细菌菌株治疗对小鼠慢性压力诱导性焦虑的影响。测量了三个参数；自主活动(A)，在区域中心的运动探索(B)和后腿直立/理毛行为(刻板行为C)。对于刻板行为，数据被表示为任意单位(A.U.)，相应于在10分钟的旷场程序中后腿直立行为的数量加上理毛行为的数量。所有组N＝12，但压力/媒剂组(其中N＝11)和压力/LP12418组(其中N＝11)除外。统计分析：单因素ANOVA；自主活动：F(4,57)＝0.4278，p>0.05；在中心的运动探索：F(4,57)＝58.20，p<0.0001；刻板行为：F(4,57)＝0.3330，p>0.05；成对比较:***p<0.001相比于无压力/媒剂组，###p<0.001相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图5.选择的细菌菌株治疗对慢性压力诱导的小鼠识别记忆缺陷的影响。测量的参数包括对象交互频率(A，C)和对象交互时间(B，D)，针对同一对象识别(A，B)和新对象识别(C，D)。所有组N＝12，但压力/媒剂组(其中N＝11)和压力/LP12418组(其中N＝11)除外。统计分析：单因素ANOVA；第2天同一对象频率：F(4,57)＝0.1884，p>0.05；第2天同一对象时间：F(4,57)＝1.627，p>0.05；第3天新对象频率：F(4,56)＝4.715，p＝0.0025；第3天新对象时间：F(4,56)＝6.839，p＝0.0002；成对比较:*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001相比于无压力/媒剂组(邓尼特检验)
图6.用选定的细菌菌株治疗对小鼠慢性压力诱导的行为绝望的影响，如在强迫游泳试验中测量。测量了三个参数；游泳时间(A)，挣扎时间(B)和静止时间(C)。所有组N＝12，但压力/媒剂组(其中N＝11)和压力/LP12418组(其中N＝11)除外。统计分析：单因素ANOVA；游泳时间：F(4,57)＝7.596，p<0.0001；挣扎时间：F(4,57)＝0.8225，p>0.05；静止时间：F(4,57)＝28.10，p<0.0001；成对比较:**p<0.01，***p<0.001相比于无压力/媒剂组，##p<0.01，###p<0.001相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图7.慢性压力和用选择的细菌菌株治疗对血浆皮质酮浓度的影响。所有组N＝12，但压力/媒剂组(其中N＝11)和压力/LP12418组(其中N＝11)除外。统计分析：单因素ANOVA；皮质酮浓度：F(4,57)＝6.618，p＝0.0002。成对比较**p<0.01相比于无压力/媒剂组，###p<0.001相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图8.在单独使用媒剂或选择的细菌菌株处理的组中，3周慢性压力对小鼠体重的影响。对于所有组N＝10-18。统计分析：双因素ANOVA；体重(时间)：F(9,643)＝17.46，p<0.0001；体重(治疗)：F(4,643)＝74.39，p<0.0001
图9.用选择的菌株治疗对小鼠慢性压力诱导的焦虑的影响。对于所有组N＝10-18。统计分析：单因素ANOVA；开放臂中的时间(A)：F(4,67)＝78.92，p<0.0001；自主活动(B)：F(4,67)＝0.3718，p>0.05；开放臂进入(C)：F(4,67)＝1.19，p>0.05；封闭臂中的时间(D)：F(4,67)＝10.85，p<0.0001；封闭臂进入(E)：F(4,67)＝1.19，p>0.05；成对比较:*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001相比于无压力/媒剂组，#p<0.05，###p<0.0001相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图10.在旷场程序中，用选择的细菌菌株治疗对小鼠慢性压力诱导性焦虑的影响。测量了五个参数；自主活动(A)，在活动场所中心的运动探索(B)，后腿直立/理毛行为(刻板行为C)，在内区花费的时间(s)(D)和在外区花费的时间(s)(E)。对于刻板行为，数据被表示为任意单位(A.U.)，相应于在10分钟的旷场程序中后腿直立行为的数量加上理毛行为的数量。对于所有组N＝10-18。统计分析：单因素ANOVA；自主活动：F(4,67)＝0.4977，p>0.05；在中心的运动探索：F(4,67)＝21.5，p<0.0001；刻板行为：F(4.67)＝0.2328，p>0.05；在内区花费的时间：F(4.67)＝16.42，p<0.0001；在外区花费的时间：F(4.67)＝16.42，p<0.0001；成对比较:***p<0.001相比于无压力/媒剂组，###p<0.001相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图11.选择的细菌菌株治疗对慢性压力诱导的小鼠识别记忆缺陷的影响。测量的参数包括对象交互频率(A，B)和对象交互时间(D，E)，针对同一对象识别(A，D)和新对象识别(B，E)。对新对象的辨别指数(DI)为小鼠在新对象和熟悉对象之间所花费的交互频率(C)和交互时间(F)的差除以探索这两个对象的总频率和总时间。“辨别指数，DI＝(新对象探索频率/时间-熟悉对象探索频率/时间)/(新对象探索频率/时间+熟悉对象探索频率/时间)”。对于所有组N＝10-18。统计分析：单因素ANOVA；第2天同一对象频率：F(4,59)＝1.54，p>0.05；第2天同一对象时间：F(4,59)＝0.5006，p>0.05；第3天新对象频率：F(4,59)＝14.18，p<0.001；第3天新对象时间：F(4,59)＝15.02，p<0.001；辨别指数频率：F(4,59)＝14.18，p<0.0001，辨别指数时间：F(4,59)＝15.02，p<0.0001；成对比较:***p<0.001相比于无压力/媒剂组，###p<0.001相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图12.用选定的细菌菌株治疗对小鼠慢性压力诱导的行为绝望的影响，如在强迫游泳试验中测量。测量了三个参数；静止时间(A)，游泳时间(B)和挣扎时间(C)。对于所有组N＝10-18。统计分析：单因素ANOVA；静止时间：F(4,59)＝26.82，p<0.0001；游泳时间：F(4,59)＝15.97，p<0.0001；挣扎时间：F(4,59)＝0.7128，p>0.05；成对比较:***p<0.0001相比于无压力/媒剂组，###p<0.0001相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图13.慢性压力和用选择的菌株治疗对血浆皮质酮(A)和促肾上腺皮质激素(ACTH)浓度(B)和海马脑源性神经营养因子(BDNF)浓度(C)的影响。对于所有组N＝8-18。统计分析：单因素ANOVA；皮质酮浓度：F(4,67)＝7.592，p<0.001；ACTH浓度：F(4,67)＝5.75，p<0.001；BDNF浓度：F(4,67)＝1.23，p>0.05；成对比较:*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001相比于无压力/媒剂组，##p<0.01相比于慢性压力/媒剂组(邓尼特检验)
图14：用选择的细菌菌株治疗对慢性压力诱导的皮层GABAAα2(A)和GABAB1β(B)受体基因表达倍数变化的影响。对于所有组N＝6。采用2-DDCT法进行差异表达分析。因样品数少而选择非参数检验，经夏皮罗-威尔克(Shapiro wilk)正态性检验显示p值<0.05。*p<0.05相比于无压力/媒剂组，#p<0.05相比于慢性压力/媒剂组(克鲁斯卡尔-沃利斯(KruskalWallis)检验和奈米易(Nemenyi)事后检验)
具体实施方式
细菌与沉积物
用于本发明各方面的细菌是物种植物乳杆菌的细菌。本发明的新颖植物乳杆菌菌株是：
a.植物乳杆菌菌株LP12151，于2018年1月9日保藏于DSMZ(莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物收保藏中心，因霍芬大街7B，D-38124不伦瑞克-德国(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig-Germany))，保藏号DSM 32721；
b.植物乳杆菌菌株LP12418，于2017年9月27日保藏于DSMZ(莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物收保藏中心，因霍芬大街7B，D-38124不伦瑞克-德国(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig-Germany))，保藏号DSM 32655；和
c.植物乳杆菌菌株LP12407，于2017年9月27日保藏于DSMZ(莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物收保藏中心，因霍芬大街7B，D-38124不伦瑞克-德国(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig-Germany))，保藏号DSM 32654。
给出关于菌株特征的相关信息的LP12151、LP12418和LP12407的DSMZ保藏表的副本并入本文(LP12151称为DGCC 12151，LP12418称为DGCC12418并且LP12407称为DGCC12407)。
本发明的组合物可以包括上述菌株中的一种或多种，并且还可以另外包括副干酪乳杆菌菌株Lpc-37，也称为DGCC4981或Lbc81。菌株Lpc-37在ATCC以保藏号PTA 4798(2002年11月15日保藏)注册和在DSMZ(莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物收保藏中心，因霍芬大街7B，D-38124不伦瑞克-德国(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstrasse 7B,D-38124Braunschweig-Germany))于2017年10月5日以保藏号DSM32661注册。给出关于菌株特征的相关信息的Lpc-37的DSMZ保藏表的副本并入本文。
因此，本发明的组合物可包含LP12151、LP12418或LP12407，或其任意组合。此外，此类组合物可包含Lpc-37。
本发明的新颖植物乳杆菌菌株也可与一种或多种其他细菌菌株组合使用，所述其他细菌菌株具有对其施用的宿主施加积极健康益处的能力。优选地，当用于本发明的方面时，所述其他细菌菌株适合于人类和/或动物消费。技术人员将容易了解用于食品和/或农业工业并且通常被认为适合人类和/或动物消费的特定细菌菌株。
本发明的植物乳杆菌菌株可以任何形式(例如活的、休眠的、灭活的或死的细菌)使用，只要细菌保持能够发挥本文所述的效果。优选地，用于本发明各方面的植物乳杆菌菌株是活的。
LP12151、LP12418、LP12407和Lpc-37为益生细菌。术语“益生细菌”被定义为包括任何非致病细菌，其当以活菌向宿主施用足够数量时，赋予所述宿主健康益处。若要分类为“益生菌”，细菌必须存活地通过宿主消化道的上部。它们是非致病性的、无毒的，并且一方面经由与消化道中的驻留菌群的生态相互作用以及另一方面通过它们以积极的方式影响宿主生理和免疫系统的能力发挥其对健康的有益作用。当施用给宿主足够数量的益生细菌时，益生细菌具有前进通过肠道的能力，保持生存力，在宿主胃肠道的管腔和/或壁中发挥其主要作用。然后，它们短暂地形成驻留菌群的一部分，并且这种定殖(或短暂定殖)允许益生细菌发挥有益的作用，例如抑制存在于菌群中的潜在致病性微生物以及与包括免疫系统的肠内宿主的相互作用。
任选地，本发明的新颖植物乳杆菌菌株与其他益生细菌组合使用。
组合物
“组合物”一词在广义上是指某物的组成方式，即其一般组成。
在本发明的一个方面，组合物可基本上由植物乳杆菌细菌的单一菌株(例如LP12151、LP12418或LP12407)组成。
可替代地，组合物可包含LP12151、LP12418和LP12407中的一种或多种的组合。
本发明的组合物可另外包含其他组分，例如其他细菌菌株(例如Lpc-37)、生物和化学组分、活性成分、代谢物、营养素、纤维、益生元等。
虽然不要求本发明的组合物包含任何支持物、稀释剂或赋形剂，但可以以本领域技术人员熟悉的方式添加和使用这种支持物、稀释剂或赋形剂。合适的赋形剂的实例包括但不限于微晶纤维素、水稻麦芽糊精、二氧化硅和硬脂酸镁。本发明的组合物还可包含冷冻保护剂组分(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、抗坏血酸钠和/或其他合适的冷冻保护剂)。
术语“组合物”和“配制品”可互换使用。
用于本发明各方面的组合物可以采取固体、溶液或悬浮液制剂的形式。固体制剂的实例包括但不限于：可湿性的、喷雾干燥的或冷冻干燥/冻干的片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂和粉剂。组合物可以含有调味剂或着色剂。组合物可配制用于立即释放、延迟释放、修饰释放、持续释放、脉冲释放或控制释放应用。
例如，如果本发明的组合物以片剂形式使用，片剂也可包含以下一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；造粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖，明胶和阿拉伯胶；可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
用于制备组合物的其他可接受载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
对于水性悬浮液和/或酏剂，可将本发明的组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油及其组合))进行组合。
为了说明的目的，下文列出了可用于本发明各方面的组合物的具体非限制性实例。这些包括但不限于食物产品、功能性食物、膳食补充剂、药物组合物和药物。
膳食补充剂
本发明的组合物可以采取膳食补充剂的形式，或者本身可以与膳食补充剂组合使用，本文中也称为食物补充剂。
本文所用的术语“膳食补充剂”是指用于摄入的产品，其含有旨在增加营养价值或健康益处给(以补充)膳食的“膳食成分”。“膳食成分”可包括(但不限于)下列物质中的一种或任何组合：细菌、益生菌(例如益生细菌)、维生素、矿物质、草药或其他植物、氨基酸、供人们用来通过增加总膳食摄入量来补充膳食的膳食物质、浓缩物、代谢物、成分或提取物。
膳食补充剂可以以许多形式存在，例如片剂、胶囊、软凝胶、软胶囊(gel cap)、液体或粉末。一些膳食补充剂可以帮助确保必需营养素足够膳食摄入；另一些可能有助于降低疾病风险。
食物产品
本发明的组合物可以采取食物产品的形式。在这里，“食物”一词是广义的，包括人类的食物和饮物，也包括动物的食物和饮物(即饲料)。优选地，所述食物产品适合于以及设计用于人类消费。
根据用途和/或应用方式和/或施用方式，食物可以是液体、固体或悬浮液的形式。
当以食物产品形式存在时，组合物可包含下列中的一种或多种或与下列中的一种或多种组合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
例如，本发明的组合物可以采取下列之一的形式：
果汁；含有乳清蛋白的饮料：保健茶或草药茶、可可饮料、乳饮料、乳酸菌饮料、酸奶和/或饮料酸奶、奶酪、冰淇淋、水冰、甜点、糖果、饼干、蛋糕、蛋糕混合物或蛋糕馅料、休闲食品、水果馅料、蛋糕或甜甜圈糖霜、即食烘焙馅料奶油、饼干馅料、即用烘焙馅料、卡路里降低的馅料、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料、营养或保健棒、饮料粉末、钙强化豆奶或钙强化咖啡饮料。
任选地，如果所述产品是食物产品，植物乳杆菌应该通过正常的“最迟销售”日期或“截止”日期(在该日期期间食物产品由零售商出售)自始至终保持有效。优选地，有效时间应当超过这样的日期，直到当食物腐败变得明显时的正常新鲜期结束。期望的时间长度和正常保质期将随食物而变化，并且本领域普通技术人员将认识到，保质期时间取决于食物的种类、食物的大小、储存温度、加工条件、包装材料和包装设备而变化。
食物成分
本发明的组合物可以采取食物成分和/或饲料成分的形式。
如本文所用，术语“食物成分”或“饲料成分”包括作为人和动物的营养和/或健康补充剂的功能性食物或食品的组合物或可以作为人和动物的营养和/或健康补充剂添加到功能性食物或食品中的组合物。
根据用途和/或应用方式和/或施用方式，食物成分可以是液体、悬浮液或固体的形式。
功能性食物
本发明的组合物可以采取功能性食物的形式。
如本文中所使用的术语“功能性食物”意指不仅能够提供营养效果，还能够向消费者递送另外的有益效果的食物。
因此，功能性食物是具有掺入其中的组分或成分(例如本文所述的那些)的普通食物，其赋予食物特定的功能性效果-例如医学或生理学益处-而不是纯粹的营养效果。
虽然对于功能性食物没有法律定义，大多数关注此领域的各方都同意它们是作为具有超过基本营养效果的特定健康作用而面市的食物。
一些功能性食物是保健营养品。此处，术语“保健营养品”意指不仅能够提供营养效果和/或味道满足，还能够向消费者递送治疗(或其他有益)效果的食物。保健营养品跨越了在食物和药物之间的传统分界线。
医疗食物
本发明的组合物可以采取医疗食物的形式。
“医疗食物”意指如下食物，该食物被配制成在有或没有医生监督的情况下食用或施用，并且旨在用于特定的饮食管理或状况，针对该饮食管理或状况，基于公认的科学原理，通过医学评估建立独特的营养需求。
药物组合物
本发明的组合物可用作药物或用于制备药物。此处，术语“药物”以广义使用-并且涵盖用于人类的药物以及用于动物的药物(即兽医应用)。在优选的方面，药物是用于人。
药物可以用于治疗目的-其本质上可以是治疗的或姑息的或预防的。
药物可以是压缩片剂、片剂、胶囊、软膏、栓剂或可饮用溶液的形式。
当用作药物或用于制备药物时，本发明的组合物可与下列中的一种或多种结合使用：药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的辅剂、药物活性成分。
药物可以是处于液体的形式或作为固体-取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
用于本发明的植物乳杆菌菌株可以构成一种或多种药物活性成分。在某些实施例中，所使用的植物乳杆菌菌株可以构成唯一的一种或多种活性成分。可替代地，LP12151、LP12407和/或LP12418可以与一种或多种其他药物活性成分一起存在。
药物
本发明的组合物可以采取药物的形式。
如本文中所使用的术语“药物”涵盖在人类和兽医学中供人类和动物两者使用的药物。此外，如本文中所使用的术语“药物”意指提供治疗、预防和/或有益效果的任何物质。如本文中所使用的术语“药物”不一定限于需要上市许可证(Marketing Approval)的物质，而是可以包括可以用于化妆品、保健营养品、食物(包括例如饲料和饮料)、益生菌培养物和天然补救剂的物质。此外，如本文中所使用的术语“药物”涵盖设计用于掺入动物饲料(例如牲畜饲料和/或宠物食物)中的产品。
剂量
本发明的组合物可包含每剂量或每克组合物106至1012个LP12151、LP12418和/或LP12407菌落形成单位(CFU)，并且更具体地，每剂量或每克组合物108至1012CFU。任选地，组合物包含每剂量或每克组合物约1010CFU LP12151、LP12418和/或LP12407。
本发明的植物乳杆菌菌株(LP12151、LP12418和/或LP12407)可以每剂量约106至约1012CFU细菌，优选每剂量约108至约1012CFU细菌的剂量施用。术语“每剂量”意指每天或每次摄入(优选每天)向受试者提供这种量的细菌。例如，如果将细菌施用在食物产品中，例如在酸奶中，则酸奶可含有约106至1012CFU的LP12151、LP12418和/或LP12407。然而，可替代地，这种量的细菌可以分成多次施用，每次施用由较小量的微生物负荷组成-只要受试者在任何特定时间(例如每24小时期间)接受的植物乳杆菌的总量是从约106至约1012CFU的细菌，任选地108至约1012CFU的细菌。
根据本发明，LP12151、LP12418和/或LP12407的有效量可以是至少106CFU细菌/剂量，任选地约108至约1012CFU细菌/剂量，例如约1010CFU细菌/剂量。
在一个实施例中，LP12151、LP12418和/或LP12407可以约106至约1012CFU细菌/天，任选地约108至约1012CFU细菌/天的剂量施用。因此，该实施例中的有效量可以是约106至约1012CFU细菌/天，任选地约108至约1012CFU细菌/天。
作用/受试者/医学适应症
本发明的组合物可用于施用给哺乳动物，包括例如家畜(包括牛、马、猪和绵羊)和人。在本发明的一些实施例中，该哺乳动物是陪伴动物(包括宠物)，例如像狗或猫。在优选实施例中，组合物用于人。
本发明的组合物可用于预防和/或治疗心理疾病、影响心理健康的症状和/或与慢性压力相关的病症，例如神经和胃肠障碍。
术语“心理疾病”可以定义为健康病症，所述健康病症改变了一个人的思维、感情或行为(或所有这三者)，并导致其在社会、工作或家庭活动中的苦恼和功能性问题。心理疾病包括与焦虑、情绪、精神病、饮食行为，冲动控制和成瘾、个性、社交能力、分离、强迫和创伤后压力有关的一系列障碍。每种疾病都以不同的方式改变一个人的思想、感情和/或行为。如本文所使用的，心理疾病还包括神经障碍和与心理疾病相关的病症，其可以是心理疾病的原因或症状，或者可以是增加心理疾病发展机会的病症。
与焦虑有关的障碍被归类为“心理疾病”。术语“焦虑障碍”是指一种涉及极度恐惧或担忧的特定心理疾病，并且包括广泛性焦虑障碍(GAD)、惊恐障碍和惊恐发作、旷场恐惧症、社交焦虑障碍、选择性缄默症、分离焦虑症、以及特定恐惧症。强迫障碍(OCD)和创伤后应激障碍(PTSD)与焦虑障碍密切相关，有些人可能与抑郁同时经历焦虑。GAD所代表程度超出了个体每天经历的正常水平的焦虑，其特征在于慢性忧虑和紧张。本发明的组合物可用于治疗和/或预防公认的焦虑障碍以及更一般地用于治疗和/或预防焦虑症状。
如本文所用，心理疾病还包括相关的神经障碍，包括记忆障碍、轻度认知损害、痴呆和阿尔茨海默病。认知是指较高水平地加工特定信息，包括思维、记忆、知觉、动机、熟练动作和语言等。认知障碍被定义为“认知或记忆的显著损害，表现为先前功能水平的显著恶化”(Guerrero,Anthony(2008).Problem-Based Behavioral Science of Medicine(基于问题的医学行为科学).纽约:斯普林格(Springer).第367-79页)。它们可分为三个主要领域：(1)谵妄，一种影响情境意识和处理新信息的障碍；(2)痴呆，一种能完全或部分消除个体记忆的障碍；(3)健忘症，一种患病个体难以保持长期记忆的障碍。
本发明的组合物可用于促进、恢复和/或保持个体的心理健康，例如预防影响个体心理健康的心理疾病或任何相关的障碍和/或症状。
影响心理健康的症状包括；感到悲伤或沮丧、思维混乱或注意力下降、过度恐惧或忧虑、或极端的内疚感、情绪起伏不定的极端变化、远离朋友和活动、脱离现实、偏执或幻觉、不能应付日常问题或压力、难以理解情境和人以及难以与情境和人建立联系、酗酒或吸毒、饮食习惯的重大改变、性欲的改变、过度愤怒、敌意或暴力、以及自杀的想法。
就本发明的目的而言，影响心理健康的心理疾病和症状还包括影响个体认知功能的病症。这类病症可以包括各种认知障碍或与之重叠。实例包括但不限于失认症、健忘症、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病和慢性压力，其已被证明对脑功能有负面影响。
剧烈的急性和慢性压力会对身体和心理健康产生负面影响，增加发展心理疾病的风险。例如，慢性压力与情绪障碍、焦虑障碍和抑郁症的发展有关。本发明的组合物可用于预防和/或治疗由慢性或急性压力导致的心理疾病或影响心理健康的症状。
本发明的组合物还可用于治疗和/或预防与慢性或急性压力相关的其他(包括身体)病症。例如，在一个实施例中，本发明的组合物用于治疗和/或预防与慢性或急性压力相关的胃肠障碍，例如IBS。通过处理与胃肠障碍相关的心理疾病的症状，这样的治疗可能对胃肠障碍本身具有有益的效果。
更一般地，本发明的组合物可用于预防和/或治疗以下中的一种或多种：心理疾病、影响心理健康的症状和/或与上述慢性或强烈急性压力相关的病症。
在特定实施例中，本发明的组合物可用于预防和/或治疗焦虑、抑郁和/或认知功能减退。
当本发明的组合物用于预防心理疾病或影响心理健康的症状时，它们可用于在已经健康的个体中维持正常水平的心理健康。或者，当本发明的组合物用于治疗心理疾病或影响心理健康的症状时，它们可用于恢复或部分恢复患有所述心理疾病或症状的个体的正常心理健康水平。
本文所述的组合物还可用于使响应于压力时脑中的γ-氨基丁酸(GABA)A和B受体表达正常化。在一个实施例中，包含LP12418的组合物用于使响应于压力时脑中的GABA A和B受体表达正常化。当在本文中使用时，术语“正常化”包括增加暴露于压力的哺乳动物中GABA A和B受体的表达，所述增加是相对于在没有使用本发明组合物的治疗或预防的情况下在哺乳动物中观察到的表达水平。此外，术语“正常化”还包括将暴露于压力的哺乳动物中GABA A和B受体的表达恢复到在不暴露于压力的情况下在所述哺乳动物中观察到的水平。
本发明的方法和其他实施例
为避免疑问，本文所述和以上所述的任何组合物都可用于本发明的方法中。进一步的实施例包括但不限于以下所述的实施例：
实施例1：一种用于预防和/或治疗哺乳动物的心理疾病、影响心理健康的症状或与慢性压力相关的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用包含植物乳杆菌菌株LP12151的组合物，所述菌株于2018年1月9日以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ
实施例2：一种用于预防和/或治疗哺乳动物的心理疾病、影响心理健康的症状或与慢性压力相关的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用包含植物乳杆菌菌株LP12418的组合物，所述菌株于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ
实施例3：一种用于预防和/或治疗哺乳动物的心理疾病、影响心理健康的症状或与慢性压力相关的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用包含植物乳杆菌菌株LP12407的组合物，所述菌株于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ
实施例4：如实施例1或3中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含另一种细菌菌株
实施例5：如实施例4所述的方法，其中所述另一种细菌菌株是副干酪乳杆菌的物种，例如菌株Lpc-37，于2017年10月5日以保藏号DSM 32661保藏于DSMZ
实施例6：一种用于预防和/或治疗哺乳动物的心理疾病、影响心理健康的症状或与慢性压力相关的病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用组合物，所述组合物包含(a)至少两种选自由以下组成的组的植物乳杆菌菌株：于2018年1月9日以保藏号DSM32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151，于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418，和于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407，和(b)于2017年10月5日以保藏号DSM 32661保藏在DSMZ的副干酪乳杆菌菌株Lpc-37
实施例7：如实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述组合物呈食物产品、饮料、膳食补充剂或药学上可接受的组合物的形式
实施例8：如实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述组合物是喷雾干燥或冷冻干燥的组合物
实施例9：如实施例8所述的方法，其中所述组合物包括冷冻保护剂
实施例10：如实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述组合物是以单位剂型，并且其中所述植物乳杆菌菌株以106和1012CFU之间，例如108和1012CFU之间，任选地1010CFU的量存在于所述组合物中
实施例11：如实施例1至10中任一项所述的方法，其用于使响应于压力时γ-氨基丁酸(GABA)A和B受体表达正常化
实施例12：如实施例1至11中任一项所述的方法，其用于预防或治疗焦虑
实施例13：如实施例1至11中任一项所述的方法，其用于预防或治疗抑郁
实施例14：如实施例1至11中任一项所述的方法，其用于预防或治疗情绪波动
实施例15：如实施例1至11中任一项所述的方法，其用于预防或治疗记忆丧失或认知功能减退
实施例16：如实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述与慢性压力相关的病症是胃肠障碍，例如肠易激综合征
实施例17：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418，用于预防或治疗焦虑
实施例18：一种组合物，其包含于2018年1月8日以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151，用于预防或治疗抑郁
实施例19：一种组合物，其包含于2018年1月8日以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151，用于预防或治疗情绪波动
实施例20：一种组合物，其包含于2018年1月8日以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151，用于预防或治疗记忆丧失或认知功能减退
实施例21：一种组合物，其包含于2018年1月8日以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151，用于预防或治疗与慢性压力相关的病症，例如肠易激综合征
实施例22：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418，用于预防或治疗抑郁
实施例23：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418，用于预防或治疗情绪波动
实施例24：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418，用于预防或治疗记忆丧失或认知功能减退
实施例25：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418，用于预防或治疗与慢性压力相关的病症，例如肠易激综合征
实施例26：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407，用于预防或治疗焦虑
实施例27：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407，用于预防或治疗抑郁
实施例28：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407，用于预防或治疗情绪波动
实施例29：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407，用于预防或治疗记忆丧失或认知功能减退
实施例30：一种组合物，其包含于2017年9月27日以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407，用于预防或治疗与慢性压力相关的病症，例如肠易激综合征
实例
提供以下实例以便证实和进一步说明本发明的具体实施例和方面，而不应被解释为限制本发明的范围。
实例1；候选菌株的初步筛选。
针对益生菌特征、安全性和制造性能，初步筛选了多个候选益生菌。这些候选菌大多因性能不佳而被弃用。对其余候选菌进行效力测试，并从中选择5个菌株进行进一步的实验测试，如下面实例中所报告的。
用从五个结直肠癌患者个体收集的粘液测试细菌粘液粘附特性。首先，用等体积的0.1M HEPES-汉克缓冲液稀释粘液并剧烈摇动5分钟。稀释液以11,000g离心10min(4℃)，并且然后以26.000g离心15min(4℃)，以去除细胞和细胞碎片。然后将上清液转移到干净的试管中，并使用PIERCETM BCA蛋白测定试剂盒测量其蛋白含量。使用HEPES-汉克缓冲液将粘液调节到0.1mg/ml的蛋白质浓度。然后将96孔板与300μl粘液或阴性对照牛血清白蛋白(BSA)在4℃孵育24小时，以用粘液包被孔。将细菌在MRS液体培养基中生长至OD600，通过离心(8500rpm，15分钟)收获，并用HBSS洗涤细菌沉淀一次。然后将细菌与荧光Syto24染料在冰上孵育15分钟，离心并悬浮于HBSS。用HEPES-汉克缓冲液洗涤包被的板，以去除多余的粘液或BSA，并向孔中添加200μl细菌悬浮液，并且在37℃下孵育1小时。再次洗涤板，并测量粘附的细菌细胞的荧光。通过比较粘附的细菌细胞的荧光与未洗涤的细胞的荧光(即最大荧光)计算粘附比(％)：粘附％＝(粘附后荧光-空白)/(最大荧光-空白)x 100。取决于粘液，一式三份样品的平均CV％在15％-30％之间变化。为了确定细菌粘附至粘液相比于粘附至其他蛋白质的特异性，粘附比计算如下：粘附比＝与粘液的粘附/与BSA的粘附。数值大于1表示与粘液的亲和力比与BSA更好。
粘液层是肠道中细菌刺激宿主细胞的第一道物理屏障。因此，与这种粘液的粘附是益生菌与宿主细胞相互作用并引起应答所需的第一步。如图1所示，粘液粘附试验表明植物乳杆菌菌株LP12407和LP12418在与人肠粘液结合的能力方面优于其他被测试的菌株。
实例2；材料和方法-一般性的
动物
使用来自JANVIER(圣伯特文(Saint Berthevin)，法国)的5周大、体重30-35g的雄性瑞士小鼠，实验在Amylgen公司进行(朗格多克-鲁西永地区粮食、农业和森林地区局(Direction Régionale de l'Alimentation,de l'Agriculture et de la Forêt duLanguedoc-Roussillon),协议#A 34-169-002，来自2014年5月2日)。动物被以六只老鼠一组中圈养，除行为实验期间外，可自由获取食物和水。每个笼子里都有来自单一治疗组的小鼠。它们被饲养在温度和湿度受控的动物设施中，以12小时的光/暗循环(晚上07:00熄灯)。所有动物程序均严格遵守2010年9月22日欧洲联盟指令(2010/63/UE)。
细菌菌株配制和施用
将细菌菌株溶解在0.9％NaCl中，并在每天上午9:00通过强饲口服施用(每只小鼠100μL)，对应于每只小鼠109CFU/天的剂量。媒剂小鼠接受0.9％NaCl，不含细菌菌株。疗程共33天。
慢性压力程序
慢性压力程序如前文所述进行(Espallergues等人,Psychoneuroendocrinology[精神神经内分泌学],2009年)。将小鼠反复置于有机玻璃(Plexiglas)透明约束管(长12cm，直径3cm)中，在强光下每天180分钟(上午11:00至下午2:00)，每周连续5天，总计3周。在不同于压力发生的房间中，对照组动物(无压力小鼠/媒剂)从未置于约束管中并且在压力程序中保持不受干扰。
动物随机化
在每个笼中(N＝6)，动物接受相同的治疗。治疗和压力程序是由一个没有参与行为和生化实验的实验者以随机的方式进行的。行为程序是由另一个不同的实验者进行的。
实验程序计划表
·在第01天，将动物随机分配到实验组，称重并用适当的菌株或媒剂治疗。
·从第01天到第33天，用适当的菌株或媒剂治疗动物。
·从第08天到第28天，按照上述慢性压力程序，从周一到周五，每周5天，每天3小时，使动物接受慢性压力。
·第29天，动物进行高架十字迷宫程序。
·在第30天，动物进行旷场程序，这也是对第31-32天任务的习惯化。
·第30天至第32天，动物进行对象再识别记忆任务
·第33天，动物进行强迫游泳试验。
·第36天，动物被安乐死。从每只动物身上采集血浆样品。收集肾上腺称重。
在治疗期间，每天检查急性或迟发死亡率。
终点测量
高架十字迷宫：在第29天，通过评估小鼠探索高架十字迷宫开放臂和封闭臂的能力来测量小鼠的焦虑状态。透明有机玻璃器械由两个开放臂(23.5x 8cm)和两个封闭臂(23.5x 8x 20cm高)组成，所述臂从中央平台伸出且放置在地面上方50cm处。将每只小鼠置于面向封闭臂的十字迷宫中心，并用
Figure BDA0002547877750000221
XT9.0(诺达思信息技术公司(NoldusInformation Technology))记录其探索行为10分钟。结果用自主活动、开放臂中花费的时间和开放臂进入的次数来表示。用
Figure BDA0002547877750000222
XT 9.0软件考虑动物的重心来计算动物在高架十字迷宫中的位置。
旷场：在第30天，小鼠被单独放置在由白色有机玻璃制成的方形旷场(50cm x50cm x 50cm高)中，旷场地面配有红外线发光二极管。小鼠在旷场中适应10分钟，并且通过IR敏感相机捕捉它们的自主活动，并使用
Figure BDA0002547877750000223
XT 9.0软件(诺达思信息技术公司)进行分析。行为被分析为自主活动(行进距离，cm)、软件定义的25x 25cm中心区域内的自主活动、以及小鼠呈现的刻板行为的数量(后腿直立和理毛事件的数量总和)。
新对象识别：在第31天，两个相同的对象(50ml带盖的塑料小瓶)被放置在旷场有机玻璃活动场所的规定位置(位置#1和位置#2，在中心区域的两个相对边缘)。每只小鼠被放置在旷场中，并在10分钟的持续过程内记录探索活动。使用鼻子跟踪方案，根据与对象接触的数量和接触的持续时间来分析活动。结果表示为对象交互的百分比和与位置#2中的对象的总交互持续时间的百分比。
在第32天，位置#2的对象被在颜色、形状和质地上与熟悉的对象不同的新的对象所取代。每只小鼠再次被放置在旷场中，并在10分钟的持续过程内记录探索活动。对活动进行了类似的分析。优先探索指数计算为与位置#2的对象接触的次数(或持续时间)与跟两个对象接触的总次数和持续时间之比。过程中与对象接触少于10次的动物被排除在研究之外。
强迫游泳试验：行为绝望(一种抑郁易感性的测量)使用强迫游泳试验来评估。每只小鼠被单独放置在高度为12cm的装有水的玻璃圆柱体(直径12cm，高24cm)中。水温保持在22℃-23℃。动物被迫游泳6分钟。过程由连接到计算机的CCD摄像机记录，并使用
Figure BDA0002547877750000231
XT 9.0软件(诺达思信息技术公司)分析运动。分析了两个水平的像素变化来区分静止、挣扎和游泳。在程序的最后五分钟内每分钟进行分析。
收集脑样品：在下面的实例3中，脑样品是在安乐死之后采集的(见下文)。脑被收集并在冷板上解剖出来。将海马和额叶皮层分成两半，解剖出来，在干冰上冷冻，然后保存在零下80℃。在海马区的一半中测定BDNF水平。
压力激素释放的测量：在包括啮齿动物在内的许多物种中，皮质酮是参与调节压力反应的主要糖皮质激素。在人类中，皮质醇是主要的糖皮质激素。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量血浆样品的小鼠血浆皮质酮水平。处死时，在2ml EDTA微管中收集全血(参考061666100，Sarstedt)，并立即在+4℃的冷冻离心机中以3,000g离心15分钟。用巴斯德移液器仔细收集血浆并将其转移到新的Eppendorf管中，以构成两个等体积的等份。在处理过程中，样品在冰中保存在4℃，然后储存在零下20℃，直到进行分析。用比色试剂盒(皮质酮(CSCI)ELISA试剂盒，ab108821，艾博抗公司(Abcam)，法国)从25-μl样品中测定血浆皮质酮。小鼠血浆样品用1X稀释液M1:200稀释，按制造商说明书直接测定。测定内和测定间变异系数常规分别为5％和7％。所述测定的灵敏度对于皮质酮通常为0.3ng/ml。样品一式两份进行测定。用比色试剂盒(ACTH ELISA试剂盒，ENZ-KIT 138，恩佐生命科学公司(Enzo LifeScience)，法国)在25-μl样品中测定血浆ACTH。小鼠血浆样品在1:1 1X稀释液M中稀释，按制造商说明书直接测定。对海马样品进行BDNF含量测定。解冻后，海马组织在pH 7.5的50mMTris-150mM NaCl缓冲液中匀浆，并超声处理20秒。离心(16,100g，在4℃下15分钟)后，根据制造商(普洛麦格公司(Promega)，#7610)的说明书将上清液用于BDNF ELISA。在450nm处读取吸光度，并使用标准曲线计算样品浓度。由于样品容量较小，ACTH和BDNF均以单重分析，并且因此采用ROUT方法对数据进行离群值分析。为每个结局确定三个离群值，并从分析中移除。
体重和肾上腺重量：为了评估长期压力激素释放，在处死时解剖肾上腺并称重。结果以肾上腺/体重比值表示。
皮层GABA受体表达；测量每组六只小鼠的额叶皮层GABAAα2和GABAB1β表达。将组织浸入1ml裂解试剂(QIAzol)中，并使用单个1mm不锈钢珠(组织裂解仪(tissue Lyzer)凯杰公司(Qiagen)，2x2分钟，20Hz)高速振荡进行匀浆。添加氯仿并离心样品以收集含RNA的水相。然后使用Qiacube机器人工作站和miRNeasy迷你试剂盒(凯杰公司)纯化RNA。使用TurboDNA酶试剂盒(安必恩公司(Ambion))进行残余DNA去除，然后使用ReadyScript cDNA合成混合物(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))按照制造商的方案将RNA转录为cDNA。使用ACTB作为看家基因，用SYBR Green以一式三份进行各个qPCR。引物序列如下：GABAAα2正向：GGAAGCTACGCTTACACAACC，反向：CCATCGGGAGCAACCTGAA，GABAB1b正向：CGCACCCCTCCTCAGAAC，反向：GTCCTCCAGCGCCATCTC，ACTB正向：ATGCTCCCCGGGCTGTAT，反向：CATAGGAGTCCTTCTGACCCATTC。
统计分析：用均值±均值标准误差(SEM)表示值。根据夏皮罗-威尔克正态性检验的结果，使用Prism 5.0a(GraphPad软件公司(GraphPad Software,Inc.))对不同条件进行统计分析：
·进行单因素ANOVA(F值)，然后进行邓尼特事后多重比较检验，以进行各个组彼此之间的比较(如果数据服从高斯分布)。
·进行克鲁斯卡尔-沃利斯非参数ANOVA(H值)，然后进行邓尼特多重比较检验(如果数据不服从高斯分布)。
p<0.05被认为是统计学上显著的。
实例3；研究AM306.3表征三个选择的菌株(LP12151、LP12407、LP12418)对小鼠中 重复压力的影响
研究方案
六十只瑞士小鼠(30-35g)用于本研究。根据下面的表1，以如下方式组成五个动物组。
表1.研究AM306.3中的治疗组
n
1.无压力雄性小鼠/媒剂 12
2.慢性压力雄性小鼠/媒剂 12
3.慢性压力雄性小鼠/植物乳杆菌LP12151，10<sup>9</sup>CFU/天 12
4.慢性压力雄性小鼠/植物乳杆菌LP12407，10<sup>9</sup>CFU/天 12
5.慢性压力雄性小鼠/植物乳杆菌LP12418，10<sup>9</sup>CFU/天 12
小鼠总数 60
将动物随机分配到实验组，称重并按照上述实例2中所述的方法用适当的菌株/媒剂治疗。从第01天到第33天，按照上述实例2中描述的治疗计划表治疗动物。
结果和注释
动物体重；图2显示了慢性压力对小鼠体重的影响。与无压力/媒剂治疗组相比，慢性压力在研究的第18天至第32天引起无显著性差异的体重。用选择的菌株(LP12151、LP12407、LP12418)各个单独处理对该参数没有影响。
高架十字迷宫程序中的焦虑测量；治疗对焦虑的影响在高架十字迷宫程序中观察到的结果中得到了说明。如图3所示，压力小鼠表现出非常显著的焦虑样行为，这反映为在开放臂中花费的时间(A)减少。LP12407和LP12418治疗显著地但部分地缓解了这一缺陷。用LP12151治疗小鼠在缓解这种缺陷方面是无效的。动物组在自主活动(B)或开放臂进入次数(C)方面没有差异。
旷场程序中的焦虑；图4显示了不同治疗对小鼠中慢性压力诱导的焦虑的影响。如图4A所示，无论是单独的压力，还是任何一种治疗，都没有对自主活动产生明显的影响。然而，慢性压力确实诱导了在活动场所中心的运动探索的非常显著的下降；这是慢性压力诱导的焦虑样行为的指示(图4B)。此外，用所有选择的菌株(LP12151、LP12407、LP12418)治疗都非常显著地缓解了这一缺陷。无论是单独的慢性压力还是任何一种治疗都没有显示出对后腿直立/理毛行为(与刻板的活动有关)的任何影响(图4C)。
新对象识别程序中的识别记忆；图5显示了不同治疗对小鼠中慢性压力诱导的识别记忆的影响。无论是单独的慢性压力还是任何一种治疗，在第2天的两个相同对象的过程期间，都没有显示出对对象探索的影响(就接触频率(A)而言或就探索两个对象所花费的时间(B)而言)。然而，在新对象过程期间慢性压力诱导的识别记忆缺陷，这是通过减少与新对象交互的频率(C)和与新对象交互的时间(D)。选择的益生菌菌株(LP12151、LP12407和LP12418)在本实验中对识别记忆无影响。
强迫游泳试验；图6显示了慢性压力和各种治疗对小鼠中慢性压力诱导的行为绝望的影响。采用强迫游泳试验测量三个不同参数；静止时间(参数A)、挣扎时间(参数B)和游泳时间(参数C)。慢性压力诱导强迫游泳试验中静止的增加(图6A)。与无压力/媒剂组相比，慢性压力还减少了游泳时间(图6C)。所有测试的益生菌菌株(LP12151、LP12407和LP12418)都完全缓解了这些缺陷。在挣扎时间方面，与无压力/媒剂组相比，无论慢性压力还是各种治疗中的任何一种似乎都不会影响该参数(图6B)。
通过ELISA测量皮质酮含量；图7显示了在第36天每个治疗组的血浆皮质酮浓度。慢性压力使小鼠血浆皮质酮浓度非显著性降低，这未达到统计学显著性。与压力/媒剂组和无压力/媒剂组相比，LP12407治疗提高血浆皮质酮水平。在本研究中，其他治疗对该参数没有显著影响。
AM306.3研究的一般结论；从上述结果可以得出以下结论。
慢性压力引起的行为缺陷：
·与无压力小鼠相比诱导体重下降
·在旷场试验和高架十字迷宫试验中诱导小鼠焦虑样状态。
·显示与无压力小鼠相比，小鼠的非常显著的识别长期记忆缺陷。
·显示在强迫游泳试验中通过行为绝望观察到的显著的抑郁样状态。
·显示在试验条件下对血浆皮质酮水平无显著影响。
用植物乳杆菌LP12151治疗：
·与慢性压力小鼠相比，以非显著方式减少体重损失。
·显示对高架十字迷宫试验中小鼠的焦虑样状态无影响。
·非常显著地但部分地降低了小鼠在旷场试验中的焦虑样状态。
·与慢性压力小鼠相比，显示对小鼠的识别长期记忆缺陷没有影响。
·与慢性压力小鼠相比，显示在强迫游泳试验中如行为绝望观察到的非常显著的抗抑郁样影响。
·显示对血浆皮质酮水平无影响。
用植物乳杆菌LP12407治疗：
·与慢性压力小鼠相比，以非显著方式减少体重损失。
·非常显著地但部分地降低了小鼠在高架十字迷宫试验和在旷场试验中的焦虑样状态。
·与慢性压力小鼠相比，显示对小鼠的识别长期记忆缺陷没有影响。
·与慢性压力小鼠相比，显示在强迫游泳试验中如行为绝望观察到的非常显著的抗抑郁样影响。
·大幅提高了血浆中的皮质酮水平。
用植物乳杆菌LP12418治疗：
·与慢性压力小鼠相比，以非显著方式减少体重损失。
·非常显著地但部分地降低了小鼠在高架十字迷宫试验和在旷场试验中的焦虑样状态。
·与慢性压力小鼠相比，显示对小鼠的识别长期记忆缺陷没有影响。
·与慢性压力小鼠相比，显示在强迫游泳试验中如行为绝望观察到的非常显著的抗抑郁样影响。
·显示对血浆皮质酮水平无影响。
实例4；研究AM306.5表征三个选择的菌株(Lpc-37、LP12418和LP12407)对小鼠中 重复压力的影响
研究方案
七十二只瑞士小鼠(30-35g)用于本研究。根据下面的表2，以如下方式组成五个动物组。
表2.研究AM306.5中的治疗组
n n*
1.无压力雄性小鼠/媒剂 12 6*
2.慢性压力雄性小鼠/媒剂 12 6*
3.慢性压力雄性小鼠/副干酪乳杆菌，Lpc-37，10<sup>9</sup>CFU/天 12
4.慢性压力雄性小鼠/植物乳杆菌，LP12418，10<sup>9</sup>CFU/天 * 12*
5.慢性压力雄性小鼠/植物乳杆菌，LP12407，10<sup>9</sup>CFU/天 12
小鼠总数 48 24
*由于笼内攻击性行为导致第4组中意外死亡，计划的12只动物被丢弃，并该组计划在第二次实验过程中增加六只动物/对照组。
将动物随机分配到实验组，称重并用适当的菌株/媒剂治疗。从第01天到第33天，按照上述实例2中描述的治疗计划表治疗动物。此外，在第28天，取样血液并从样品制备血浆。同样，在安乐死之后，取出脑，解剖出海马体和额叶皮层并称重，然后在-80℃下储存(也按照实例2中描述的方法)。第28天测量血浆皮质酮和ACTH水平。在小鼠安乐死后的海马样品中也测量了BDNF含量。
结果和注释
动物体重；图8显示了慢性压力对小鼠体重的影响。与无压力/媒剂治疗组相比，慢性压力在研究的第18天至第32天引起的体重增加显著降低。用选择的菌株(Lpc-37、LP12418、LP12407)各个单独处理对该参数没有影响。
高架十字迷宫程序中的焦虑测量；治疗对焦虑的影响在高架十字迷宫程序中观察到的结果中得到了说明。如图9所示，压力小鼠表现出非常显著的焦虑样行为，这反映为在开放臂中花费的时间(A)减少。用Lpc-37、LP12418或LP12407菌株治疗非常显著地但部分地增加了在开放臂中花费的时间(部分地缓解了单独用载体治疗的慢性压力小鼠中所观察到的减少)。动物组在自主活动(B)或开放臂进入次数(C)方面没有差异。
旷场程序中的焦虑；图10显示了不同治疗对小鼠中慢性压力诱导的焦虑的影响。如图10A所示，无论是单独的压力，还是任何一种治疗，都没有对自主活动产生明显的影响。然而，慢性压力确实诱导了在活动场所中心的运动探索的非常显著的下降；这是慢性压力诱导的焦虑样行为的指示(图10B)。此外，用Lpc-37、LP12418或LP12407菌株治疗非常显著地且完全地缓解了这种缺陷。慢性压力还诱导在内区花费的时间(s)(D)的显著减少和在外区花费的时间(s)(E)的显著降低。用Lpc-37、LP12418或LP12407治疗缓解了这些压力诱导的应答，使在内区和外区花费的时间(s)恢复到与无压力/媒剂组相当的水平。无论是单独的慢性压力还是任何一种治疗都没有显示出对后腿直立/理毛行为(与刻板的活动有关)的任何影响(图10C)。
新对象识别程序中的识别记忆；图11显示了不同治疗对小鼠中慢性压力诱导的识别记忆的影响。无论是单独的慢性压力还是任何一种治疗，在第2天的两个相同对象的过程期间，都没有显示出对对象探索的影响(就接触频率(图11A)而言或就探索2个对象所花费的时间(图11D)而言)。然而，在新对象过程期间慢性压力诱导的识别记忆缺陷，这是通过减少与新对象交互的频率(图11B)和与新对象交互的时间(图11E)。用Lpc-37、LP12418和LP12407菌株治疗非常显著地且完全地恢复交互的频率和交互的时间，从而证实了这些菌株治疗对新对象识别的影响。对于辨别指数观察到同样的情况(图11C和11F)。
强迫游泳试验；图12显示了慢性压力和各种治疗对小鼠中慢性压力诱导的行为绝望的影响。采用强迫游泳试验测量三个不同参数；静止时间(参数A)、游泳时间(参数B)和挣扎时间(参数C)。慢性压力诱导强迫游泳试验中静止的增加(图12A)。与无压力/媒剂组相比，慢性压力还减少了游泳时间(图12B)。用Lpc-37、LP12418或LP12407菌株治疗非常显著地且完全地逆转了压力对静止时间和游泳时间的影响，导致静止时间和游泳时间值与无压力/媒剂组相当。在挣扎时间方面，与无压力/媒剂组相比，无论慢性压力还是各种治疗中的任何一种似乎都不会影响该参数(图12C)。
ELISA测量生化标志物；图13A和13B分别显示了每个治疗组的血浆皮质酮和ACTH浓度。图13C显示海马中的BDNF浓度。慢性压力非常显著地增加小鼠血浆中皮质酮浓度，并且显著地降低ACTH浓度。在慢性压力小鼠中也观察到BDNF浓度的非显著性增加。用Lpc-37治疗的小鼠没有显示出血液皮质酮浓度与慢性压力组相似的增加，尽管它们与无压力媒剂小鼠或慢性压力媒剂小鼠没有显著差异。然而，Lpc-37治疗似乎不影响ACTH浓度。LP12418治疗对皮质酮浓度没有影响，但与慢性压力/媒剂组相比非常显著地增加ACTH浓度，使ACTH浓度恢复到与无压力/媒剂组相当的水平。与慢性压力小鼠相比，LP12407治疗在皮质酮或ACTH浓度方面没有显示差异。BDNF浓度跨无压力媒剂小鼠和所有益生菌治疗的慢性压力小鼠是相似的。尽管慢性压力媒剂小鼠的平均BDNF浓度似乎更高，但各组之间没有统计学上的显著差异。
GABA受体表达；图14显示了两种GABA受体GABAAα2(图14A)和GABAB1β(图14B)在小鼠额叶皮层中的表达。与无压力/媒剂组相比，慢性压力显著降低了两种受体类型的表达。与压力/媒剂组相比，LP12418治疗显著增加了两种GABA受体类型的表达，并完全恢复到无压力/媒剂组的表达水平。Lpc-37或LP12407治疗对GABA受体表达无影响。
AM306.5研究的一般结论
从上述结果可以得出以下结论。
慢性压力引起的行为缺陷：
·与无压力小鼠相比诱导部分体重下降
·在旷场试验和高架十字迷宫试验中诱导小鼠焦虑样状态。
·显示与无压力小鼠相比，小鼠的非常显著的识别长期记忆缺陷。
·显示在强迫游泳试验范式中通过行为绝望观察到的显著的抑郁样状态
·显著增加血浆皮质酮浓度。
用副干酪乳杆菌Lpc-37、植物乳杆菌LP12418、植物乳杆菌或LP12407治疗：
·与慢性压力小鼠相比，对体重损失没有影响
·非常显著地且完全地缓解高架十字迷宫试验中小鼠的焦虑样状态。
·非常显著地且完全地缓解在旷场程序中小鼠的焦虑样状态。
·与慢性压力小鼠相比，非常显著地且完全地缓解小鼠的识别长期记忆缺陷。
·与单独使用媒剂治疗的慢性压力组相比，非常显著地且完全地缓解强迫游泳试验范式中通过行为绝望观察到的抑郁样行为·显示对皮质酮、ACTH和BDNF浓度的有差异的影响。
·用LP12418治疗恢复了脑(额叶皮层)中GABA A和B受体的表达，而Lpc-37和LP12407没有显示出影响。
Figure BDA0002547877750000321
Figure BDA0002547877750000331
Figure BDA0002547877750000341
Figure BDA0002547877750000351
Figure BDA0002547877750000361
Figure BDA0002547877750000371
Figure BDA0002547877750000381
Figure BDA0002547877750000391
Figure BDA0002547877750000401
Figure BDA0002547877750000411
Figure BDA0002547877750000421
Figure BDA0002547877750000431

Claims (16)

1.一种组合物，其包含以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株LP12151。
2.一种组合物，其包含以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418。
3.一种组合物，其包含以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含另一种细菌菌株。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述另一种细菌菌株是副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的物种，例如菌株Lpc-37，以保藏号DSM 32661保藏于DSMZ。
6.一种组合物，其包含(a)至少两种选自由以下组成的组的植物乳杆菌菌株：以保藏号DSM 32655保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12418，以保藏号DSM 32654保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12407，和以保藏号DSM 32721保藏在DSMZ的植物乳杆菌菌株LP12151，和(b)以保藏号DSM 32661保藏在DSMZ的副干酪乳杆菌菌株Lpc-37。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈食物产品、饮料、膳食补充剂或药学上可接受的组合物的形式。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述组合物是喷雾干燥或冷冻干燥的组合物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物是以单位剂型，并且其中所述植物乳杆菌菌株以106和1012CFU之间，例如108和1012CFU之间，任选地1010CFU/单位剂量的量存在于所述组合物中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗哺乳动物的心理疾病、影响心理健康的症状和/或与慢性压力相关的病症。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其用于使响应于压力时γ-氨基丁酸(GABA)2型表达正常化。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述心理疾病是情绪障碍、焦虑障碍和/或抑郁。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述影响心理健康的症状是焦虑、情绪波动和/或抑郁。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述心理疾病导致认知功能减退，和/或其中所述影响心理健康的症状是认知功能减退。
16.根据权利要求11所述的组合物，其中所述与慢性压力相关的病症是胃肠障碍，例如肠易激综合征。
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