CN115746341A - 聚合物微球及其制备方法与在注射型组织填充剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药化工技术领域，具体公开了聚合物微球及其制备方法与在注射型组织填充剂中的应用。本发明提供了制备聚合物微球的方法，所述聚合物微球通过将水相与油相混合后，以多级管线式在线剪切方式进行乳化剪切制备而成；剪切的转速为4000‑12000r/min；油相包括所述聚合物原料和有机溶剂，油相的浓度为5‑20％；水相为PVA的水溶液，水相的浓度为0.4％‑1％(w/v)；油相与水相的体积比为1：(3‑5)。本发明的方法可高质、高收率地获得目的粒径微球，配合凝胶液的使用，可获得安全性高、效果好的注射型组织填充剂。

Description

聚合物微球及其制备方法与在注射型组织填充剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药化工技术领域，具体地说，涉及聚合物微球及其制备方法与在注射型组织填充剂中的应用。

背景技术

聚己内酯PCL、聚乳酸PLA等聚合物材料是经认证的生物安全材料，由于其优异的生物相容性、生物可降解性和无毒性，常用于医药载体。近年来，随着医美市场的火热，聚己内酯PCL、聚乳酸PLA等聚合物材料优异的特性也被应用到医美填充整形领域中。一般将聚合物微球复配凝胶后制成注射型针剂使用，这类注射填充型美容整形手术简单，创伤小，效果显著，并且聚合物微球可长期刺激自身皮肤深层胶原蛋白产生，形成较长时间的持续性修复的效果，避免了单纯填充凝胶经人体吸收降解后需要短时间反复注射来维持填充效果，故受到了越来越多消费者的认可。

从临床应用的安全性和便利性方面，临床医师推荐的产品剂型为可注射凝胶悬液，保证即刻组织填充和持久刺激胶原修复的双重功效，可控降解周期，材料生物相容性较好，无血管栓塞和炎性反应。

目前聚合物微球的制备一般采用的方法是剪切乳化法、膜乳化法、喷雾干燥法等方法。剪切乳化法和喷雾干燥法制备的微球存在粒径难以控制，微球粒径分布宽(1-100μm)，基于临床应用现状反馈，颗粒粒径较大，存在易沉淀、结节和血管栓塞的风险；并且这两种方法需增加筛分工艺控制范围，造成目标粒径微球收率低，原料成本高。膜乳化法制备微球效率低，难以量产。

另外，微球的凝胶载体如CMC、HPMC等，植入体内后其结构易松散，凝胶粘度下降和细胞粘附力弱，难以支撑微球长期稳定悬浮，存在微球沉降团聚和注射移位的风险，此外一般使用较广泛的单相交联HA植入凝胶，也具有交联剂使用高，残留难以控制的问题，交联剂使用过少会导致凝胶强度低，从而粘弹性无法达到使用的需求。

因此，需要对聚合物微球及凝胶载体进行进一步研究。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种制备聚合物微球的方法，其可高收率地获得目标粒径微球，无需筛分，提高生产效率。本发明的另一目的是提供一种上述聚合物微球在注射型组织填充剂中的应用。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种制备聚合物微球的方法，所述聚合物微球的聚合物原料包括PCL、PLGA、PLA、PEG-PCL、PEG-PLGA、PEG-PLA中的一种或多种；

所述聚合物微球通过将水相与油相混合后，以多级管线式在线剪切方式进行乳化剪切制备而成；剪切的转速为4000-12000r/min；

所述油相包括所述聚合物原料和有机溶剂，所述油相的浓度为5-20％；所述水相为PVA的水溶液，所述水相的浓度为0.4％-1％(w/v)；所述油相与水相的体积比为1：(3-5)。

针对目前微球制备粒径大、分布不均，目标粒径微球占比小等问题，本发明研究发现，当以特定的乳化剂配方和油相与水相比例，配合多级(至少两级转子)管线式在线剪切乳化方式进行特定转速乳化，可使得获得的微球粒径范围在1-12μm之间，且粒径分布窄，适用于填充的1-10μm的目标粒径微球占比可达98.7％(更优选的3-7μm粒径微球占比可达66.3％)，无需筛分即可得到大量适于注射应用的目标粒径微球，且微球表面光滑，并能根据使用需求通过选择聚合物原料的粘度不同，调整微球降解周期(1年-5年)，提高了微球制备技术工业化产率。

本发明中w/v为g/ml，即1％(w/v)表示1g溶质溶于100ml溶剂中。

作为一个具体实施方式，本发明的聚合物微球的制备方法包括剪切乳化形成微球、挥发溶剂固化微球以及洗涤微球的步骤，具体为：

采用多级在线式剪切乳化机，将剪切转速调整至4000-12000r/min，将配置好的油相和水相按比例泵入剪切机中，剪切后的微球混悬液投入反应釜中，夹套加热使内部混悬液至38℃，负压搅拌挥发溶剂，使得微球均匀稳定固化，微球固化后沉降抽出上清液，再加入与上清液相同体积纯水搅拌均匀，反复沉降清洗3次得到目标粒径微球。剪切原理示意图参见图1。

优选，所述油相的浓度为10％-20％；所述水相的浓度为0.4％-0.8％(w/v)；所述油相与水相的体积比为1：(3-4)；

和/或，采用三级在线式剪切乳化机进行乳化剪切，剪切的转速为4000-6500r/min。

若微球固化差，则易产生碎片，微球出现形状不规则及孔洞，本发明的优选乳化剂配方可使聚合物微球固化过程的结构稳定，表面光滑，无异型球，粒径分布更理想。

本发明的聚合物原料的粘度为0.2-2.0dl/g(特性粘度)。PVA的粘度为20±5mPa·s(动力粘度)，醇解度＞88％。以本发明限定的原料参数进行微球制备，可获得更好的粒径分布。

本发明中聚合物特性粘度测试的标准为GB/T 37642-2019聚己内酯(PCL)附录A粘度测定方法。

聚乙烯醇动力粘度测试的标准为GB/T 12010.2-2010塑料聚乙烯醇材料(PVAL)第2部分附录E粘度测定方法。

本发明的方法中，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃中的一种或多种；优选，所述有机溶剂为二氯甲烷。

优选的有机溶剂毒性低，沸点低，易挥发去除，有利于减少微球固化时间。

本发明还提供一种聚合物微球，其由上述方法制备得到。

本发明的聚合物微球粒径分布均匀，表面光滑，利于应用。

本发明另提供一种注射型组织填充剂，其包括上述聚合物微球的磷酸盐混悬液和凝胶液；所述凝胶液为CMC凝胶、自交联HA凝胶、海藻酸钠凝胶中的一种或多种；所述凝胶液在注射型组织填充剂中的质量占比为60％-90％；所述聚合物微球的磷酸盐混悬液中，所述聚合物微球的含量为65±5％(w/w)。

本发明的注射型组织填充剂中，微球与凝胶组分均具有有良好的生物相容性和可调控的生物降解性，满足面部和体部不同部位的组织填充和整形，尤其是在血管丰富的组织部位，主要包括颈部和私密组织部位，由于微球粒径小，可有效规避血管栓塞风险，提高微球注射的可操作性。

优选，所述凝胶液为自交联HA凝胶；所述自交联HA凝胶的制备方法包括：

(1)将透明质酸钠与交联剂进行反应，获得微交联透明质酸钠凝胶；

(2)将所述微交联透明质酸钠凝胶制成大小为50-250μm的凝胶微粒。

(3)将所述凝胶微粒与未交联的透明质酸钠的溶液按体积比(1-5)：(5-9)混合；所述未交联的透明质酸钠的溶液的浓度为3％-8％(w/v)；

在步骤(1)的反应体系中，所述透明质酸钠的浓度为3％-8％(w/v)，所述交联剂的浓度为0.1％-5％(w/v)。

本发明优选通过上述特定多级自交联HA凝胶技术制备获得凝胶液，采用微交联的透明质酸钠与未交联的透明质酸钠的溶液进一步混合，其降解周期可控，为微球提供了更好的悬浮载体，并兼顾推挤应用时的适从性，解决了凝胶结构单一，微球易沉降，凝胶粘附力低(胶原产生不集中)等问题，在满足填充达到使用需求的前提下，可以控制交联剂的使用量，提高了植入安全性，缩短了残留交联剂的去除时间。

具体地，本发明的特定复配自交联HA，较单一交联HA凝胶，BDDE残留更易控制，自交联凝胶结构更稳定，微球悬浮作用维持程度高，凝胶梯度降解周期，长时间提供微球悬浮的载体结构，利于细胞粘附和生长，可使得微球刺激产生的胶原更圆滑集中，降低凝胶在皮下移位(胶原产生不集中)导致填充效果差的风险，达到靶向定位和持久填充的效果。

优选，制备微交联透明质酸钠凝胶时，在将透明质酸钠与交联剂进行反应后还包括洗涤的步骤，具体可通过以磷酸盐溶液透析的方式进行洗涤，通过控制磷酸盐缓冲液换液次数，将未反应的交联剂不断置换，直至达到标准要求(不得超过2μg/g)。其中微交联透明质酸钠与透析液的比例优选为1:5。磷酸盐缓冲液优选药典中pH5.0，pH6.6，pH7.3的配方。

更优选，步骤(1)中用于进行交联反应的透明质酸钠的粘度为29.5±2dl/g；步骤(3)中未交联的透明质酸钠的粘度为37±1dl/g；

和/或，所述交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

本发明透明质酸钠的粘度指凝胶剪切粘度，其测试标准为YYT0308-2015医用透明质酸钠凝胶粘度测定方法。

本发明优选通过对各步骤使用的透明质酸钠原料的粘度进行特定配合，以特定中等粘度的交联HA复配较大粘度的非交联HA凝胶作为微球悬浮载体(即，本发明对进行交联反应所用的HA原料的粘度进行选择，并配合对用于形成未交联的透明质酸钠的溶液的HA原料的粘度进行选择，以形成特定微球载体)，进一步优化了凝胶结构，使微球悬浮在特定的交联结构中，既获得理想的力学稳定性，又兼顾保持凝胶推挤应用时的适从性，利于注射后对注射部位达到即刻填充修复效果，并在作用位置具有靶向定位与占位作用(胶原产生集中)，不易团聚。

进一步优选地，在步骤(1)的反应体系中，所述透明质酸钠的浓度为5％(w/v)，交联剂的浓度为0.5％(w/v)；步骤(3)中未交联的透明质酸钠的溶液的浓度为5％(w/v)；

在步骤(3)中，将所述凝胶微粒与未交联的透明质酸钠的溶液按体积比3:7混合。

本发明通过调整HA交联程度与较大粘度的HA凝胶(未交联的透明质酸钠)的比例，可使微球在凝胶液中具有更好的悬浮分散性、稳定性，保证靶部位注射的占位和填充效果。

本发明还提供一种制备上述注射型组织填充剂的方法，其包括：

(1)将聚合物微球混悬在磷酸盐缓冲溶液(起到盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用)中，得到聚合物微球的磷酸盐混悬液；

(2)将所述聚合物微球的磷酸盐混悬液与凝胶液混合。

作为一个具体的实施方式，可按微球纯化水质量比为60-70％，在制备好的微球中添加纯化水，之后加入磷酸盐搅拌均匀，使微球混悬在药典中规定的pH5.0，pH6.6或pH7.3的磷酸盐缓冲溶液中。

优选，聚合物微球的磷酸盐混悬液中微球含量为64％；聚合物微球的磷酸盐混悬液与凝胶液的质量比为1:4，以利于微球稳定悬浮分散于凝胶。

本发明的有益效果至少在于：

本发明制备方法获得的聚合物微球降解时间稳定可控，粒径小、分布均匀，结构稳定，比表面积大，表面光滑，增强了细胞粘附效果和生长空间，且目标粒径占比大，提高了微球制备效率和目标粒径产率，无需筛分，工业化生产成本低。

本发明的注射型组织填充剂，微球和凝胶液降解周期可控，优选采用特定多级自交联HA，基质结构和力学性质稳定，具有高细胞粘附作用，可实现注射位置精准和固定，解决了填充物移位风险，为微球提供靶向定位和填充作用，提高与皮下组织之间的交互作用，促进细胞粘附和增殖。且其交联剂使用可控，残留量小、安全性高。特定的凝胶网络结构还可实现梯度降解周期(多级自交联HA凝胶中未交联HA先降解，微交联HA后降解)，降低了聚合物微球沉降聚集作用，使微球可稳定悬浮，不团聚，提高了靶向即刻填充效果。

本发明的注射型组织填充剂解决了现有技术的微球类产品凝胶颗粒粒径较大，存在易沉淀、结节和血管栓塞的风险问题，还解决了短期填充材料的效果限制和永久性填充材料的安全性担忧问题，具有有效填充组织容积优势和无血栓风险的安全保证，可满足医美整形领域广泛的临床需求。

附图说明

图1为本发明的乳化剪切原理示意图。

图2为本发明实施例1的聚合物微球的粒径分布图。

图3为本发明实施例1的聚合物微球的显微镜观测结果，图中标尺为20μm。

图4为本发明实施例1的聚合物微球的SEM观测结果。

图5为本发明实施例1的自交联HA凝胶显微镜观测结果。

图6为实施例1的推挤力测试结果。

图7为实施例1的动物实验切片观察测试结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中所涉及到的部分化学物质英文简称如下：

PCL：聚己内酯；PLA：聚乳酸；PVA：聚乙烯醇；CMC：羧甲基纤维素；HPMC：羟丙基甲基纤维素；PBS：磷酸盐缓冲盐溶液；HA：透明质酸；BDDE：1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

实施例1

本实施例提供一种本发明的聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法。

1、微球原料准备：聚己内酯PCL(特性粘度为0.54dl/g)加入二氯甲烷中配置成油相，浓度为10％(w/v)；PVA(动力粘度22mPa·s，醇解度大于88％)加入纯水中，配置成水相，浓度为0.4％(w/v)。油相与水相体积比例为1:3。

微球制备：采用三级在线式剪切乳化机，剪切转速为6500rpm，制备混悬液5L。负压固化去除有机溶剂，用水清洗获得微球。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布1-12μm。主要粒径分布(体积分布)于1-10μm，占比98.5％，Dv(10)＝2.43μm，Dv(50)＝4.78μm，Dv(90)＝7.94μm，3-7μm占比65％。马尔文粒度测试分布结果见图2。显微镜和SEM观测结果见图3和图4。

2、配置微球含量为64％的微球磷酸盐混悬液(pH为6.6)。

3、制备自交联HA凝胶：在1％(w/v)浓度的NaOH溶液中，加入HA(该原料的粘度为29.5dl/g)搅拌至溶解，再加入1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)常温下进行交联反应，交联反应体系中，HA的浓度为5％(w/v)，BDDE的浓度为0.5％(w/v)，即交联时，HA和BDDE的质量比为5:0.5，交联4h后，将获得的微交联透明质酸钠凝胶用pH6.6的磷酸盐溶液进行透析，清洗去除NaOH与BDDE，透析袋孔径20μm，微交联透明质酸钠凝胶和磷酸盐溶液的质量体积比为1：5(g/mL)，换液清洗5次,每次100rpm搅拌8h，将透析清洗后的微交联透明质酸钠凝胶挤出60目的筛网得到凝胶微粒(50-250μm)，将凝胶微粒和浓度为5％(w/v)的未交联HA(该原料的粘度为37dl/g)的溶液以体积比例3:7进行混合得到自交联HA凝胶，自交联HA凝胶中，HA浓度为5％(w/v)，显微镜观测结果如图5所示；

4、注射型组织填充剂制备：将微球含量为64％的微球磷酸盐混悬液与自交联HA凝胶按1:4的质量比例混合均匀，制备成组织填充高分子组合物。

实施例2

本实施例提供一种本发明的聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、微球原料准备为：PLA(特性粘度为0.82dl/g)加入二氯甲烷中配置成油相，浓度为15％(w/v)；PVA(动力粘度22mPa·s，醇解度大于88％)加入纯水中，配置成水相，浓度为0.6％(w/v)。油相与水相体积比例为1:5。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布1-12μm。主要粒径分布(体积分布)于1-10μm，占比96.6％，Dv(10)＝2.56μm，Dv(50)＝4.88μm，Dv(90)＝8.12μm，3-7μm占比63.7％。

2、配置微球磷酸盐混悬液时，以及制备自交联HA凝胶时，对微交联透明质酸钠凝胶的洗涤均采用pH7.3的磷酸盐溶液。

3、制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，HA的浓度为8％(w/v)，交联剂BDDE的浓度为3％(w/v)。

凝胶微粒与未交联HA的溶液以体积比例1:1进行混合得到自交联HA凝胶，自交联HA凝胶中，HA浓度为7％(w/v)。

4、注射型组织填充剂制备时，凝胶液(自交联HA凝胶)在注射型组织填充剂中的质量占比为60％。

实施例3

本实施例提供一种本发明的聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、微球原料准备为：PLGA(特性粘度为0.23dl/g)加入二氯甲烷中配置成油相，浓度为20％(w/v)；PVA(动力粘度22mPa·s，醇解度大于88％)加入纯水中，配置成水相，浓度为0.8％(w/v)。油相与水相体积比例为1:4。微球制备时，剪切转速为4000rpm。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布1-12μm。主要粒径分布(体积分布)于1-10μm，占比98.7％，Dv(10)＝2.37μm，Dv(50)＝4.69μm，Dv(90)＝8.09μm，3-7μm占比66.3％。

2、配置微球磷酸盐混悬液时，以及制备自交联HA凝胶时，对微交联透明质酸钠凝胶的洗涤均采用pH5的磷酸盐溶液。

3、制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，HA的浓度为3％(w/v)，交联剂BDDE的浓度为0.1％(w/v)。未交联HA的溶液的浓度为3％(w/v)。

凝胶微粒与未交联HA的溶液以体积比例1:9进行混合得到自交联HA凝胶，自交联HA凝胶中，HA浓度为3％(w/v)。

4、注射型组织填充剂制备时，凝胶液(自交联HA凝胶)在注射型组织填充剂中的质量占比为90％。

实施例4

本实施例提供一种本发明的聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、微球原料准备为：PEG-PCL(特性粘度为1.34dl/g)加入四氢呋喃中配置成油相，浓度为10％(w/v)；PVA(动力粘度22mPa·s，醇解度大于88％)加入纯水中，配置成水相，浓度为0.6％(w/v)。油相与水相体积比例为1:4。微球制备时，剪切转速为9000rpm。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布1-12μm。主要粒径分布(体积分布)于1-10μm，占比95.8％，Dv(10)＝2.55μm，Dv(50)＝4.83μm，Dv(90)＝8.36μm，3-7μm占比64.7％。

2、配置微球磷酸盐混悬液时，以及制备自交联HA凝胶时，对微交联透明质酸钠凝胶的洗涤均采用pH7.3的磷酸盐溶液。

3、制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，HA的浓度为8％(w/v)，交联剂BDDE的浓度为5％(w/v)。未交联HA的溶液的浓度为8％(w/v)。

凝胶微粒与未交联HA的溶液以体积比例1:9进行混合得到自交联HA凝胶，自交联HA凝胶中，HA浓度为8％(w/v)。

4、注射型组织填充剂制备时，凝胶液(自交联HA凝胶)在注射型组织填充剂中的质量占比为90％。

实施例5

本实施例提供一种本发明的聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、微球原料准备为：PEG-PLGA(特性粘度为1.55dl/g)加入三氯甲烷中配置成油相，浓度为15％(w/v)；PVA(动力粘度22mPa·s，醇解度大于88％)加入纯水中，配置成水相，浓度为0.8％(w/v)。油相与水相体积比例为1:5。微球制备时，剪切转速为9000rpm。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布1-12μm。主要粒径分布(体积分布)于1-10μm，占比95.2％，Dv(10)＝2.71μm，Dv(50)＝4.85μm，Dv(90)＝8.62μm，3-7μm占比64.2％。

2、配置微球磷酸盐混悬液时，采用pH7.3的磷酸盐溶液。

3、凝胶液为羧甲纤维素钠凝胶(分子量80万，配置浓度：2.5％(w/v))。

4、注射型组织填充剂制备时，凝胶液(羧甲纤维素钠凝胶)在注射型组织填充剂中的质量占比为80％。

实施例6

本实施例提供一种本发明的聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、微球原料准备为：PEG-PLA(特性粘度为1.88dl/g)加入二氯甲烷中配置成油相，浓度为5％(w/v)；PVA(动力粘度22mPa·s，醇解度大于88％)加入纯水中，配置成水相，浓度为1％(w/v)。油相与水相体积比例为1:5。微球制备时，剪切转速为12000rpm。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布1-12μm。主要粒径分布(体积分布)于1-10μm，占比97.1％，Dv(10)＝2.58μm，Dv(50)＝4.66μm，Dv(90)＝8.38μm，3-7μm占比67.1％。

2、配置微球磷酸盐混悬液时，采用pH7.3的磷酸盐溶液。

3、凝胶液为海藻酸钠凝胶(分子量20万，配置浓度：3％(w/v))。

4、注射型组织填充剂制备时，凝胶液(海藻酸钠凝胶)在注射型组织填充剂中的质量占比为80％。

对比例1

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：PCL的特性粘度为2.03dl/g。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布1-15μm，大粒径微球占比较多。1-10μm粒径占比88.6％。3-7μm粒径占比48.2％。D10＝3.02μm，D50＝5.34μm，D90＝10.21μm。

对比例2

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：PCL的特性粘度为0.13dl/g。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布0.5-10μm，小粒径微球较多。1-10μm粒径占比90.3％，3-7μm粒径占比47.7％。D10＝1.11μm，D50＝4.03μm，D90＝7.82μm。

对比例3

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：油相的浓度为3％(w/v)。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布0.5-10μm，小粒径微球较多。1-10μm粒径占比89.7％，3-7μm粒径占比44.2％。D10＝1.16μm，D50＝4.27μm，D90＝8.00μm。

对比例4

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：油相的浓度为25％(w/v)。

获得的微球表面光滑，少量异型球，粒径分布1-20μm，大粒径微球占比较多。1-10μm粒径占比72.4％，3-7μm粒径占比35.7％。D10＝3.51μm，D50＝6.93μm，D90＝14.16μm。

对比例5

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备水相时所用的PVA的醇解度为78％。获得的微球表面不光滑，有孔洞，有不规则碎片。

对比例6

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：水相浓度为0.3％。

获得的微球表面不光滑，有孔洞，有不规则碎片。

对比例7

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：水相浓度为1.2％。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布0.5-10μm，小粒径微球较多。1-10μm粒径占比89.3％，3-7μm粒径占比43.05％。D10＝0.94μm，D50＝4.13μm，D90＝7.78μm。

对比例8

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：油相与水相的体积比为1:2。获得的微球表面不光滑，有孔洞，有不规则碎片。

对比例9

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：油相与水相的体积比为1:6。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布0.5-10μm，小粒径微球较多。1-10μm粒径占比89.1％，3-7μm粒径占比42.8％。D10＝1.15μm，D50＝3.77μm，D90＝8.78μm。

对比例10

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：剪切转速为3500rpm。

获得的微球表面光滑，少量异型球，粒径分布1-20μm，大粒径微球占比较多。

对比例11

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：剪切转速为12500rpm。

获得的微球表面光滑，无异型球，粒径分布0.5-10μm，小粒径微球较多。1-10μm粒径占比88.7％，3-7μm粒径占比44.4％。D10＝0.98μm，D50＝4.21μm，D90＝7.56μm。

对比例12

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，用于交联反应的HA(原料)的粘度为27dl/g。

对比例13

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，用于交联反应的HA(原料)的粘度为32dl/g。

对比例14

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，用于与凝胶微粒混合的未交联HA的溶液中，所含未交联HA(原料)的粘度为35dl/g。

对比例15

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，用于与凝胶微粒混合的未交联HA的溶液中，所含未交联HA(原料)的粘度为40dl/g。

对比例16

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，HA的浓度为2％(w/v)，最终自交联HA凝胶中HA浓度为4％(w/v)。

对比例17

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，HA的浓度为10％(w/v)，最终自交联HA凝胶中HA浓度为6.5％(w/v)。

对比例18

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，交联剂BDDE的浓度为0.05％(w/v)。

对比例19

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，交联剂BDDE的浓度为6％(w/v)。

对比例20

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，未交联HA的溶液的浓度为1％，最终自交联HA凝胶中HA浓度为2.2％(w/v)。

对比例21

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，在交联反应体系中，未交联HA的溶液的浓度为10％，最终自交联HA凝胶中HA浓度为8.5％(w/v)。

对比例22

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，凝胶微粒和未交联HA的溶液以体积比例1:10混合得到自交联HA凝胶。

对比例23

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：制备自交联HA凝胶时，凝胶微粒和未交联HA的溶液以体积比例3:2混合得到自交联HA凝胶。

对比例24

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：注射型组织填充剂制备时，凝胶液(自交联HA凝胶)在注射型组织填充剂中的质量占比为55％。

对比例25

本对比例提供一种聚合物微球、注射型组织填充剂及其制备方法，其与实施例1基本相同，区别仅在于：注射型组织填充剂制备时，凝胶液(自交联HA凝胶)在注射型组织填充剂中的质量占比为95％。

实验例1

本实验例对实施例和对比例制得的注射型组织填充剂进行检测。

1、取1ml注射型组织填充剂四支，置于离心管中，分别在5000r/min、8000r/min、10000r/min和12000r/min离心转速下高速离心15min，查看样品分层情况，考察微球在凝胶中的悬浮稳定性。各组别统计结果见表1。

表1

结果，实施例1-6、对比例13、15、17、19、21、23、25的样品在10000r/min的转速下均未分层。对比例12、14、16、18、20、22、24样品在小于10000r/min的转速下发生分层现象。

取在12000r/min离心后的注射型组织填充剂，平均分为离心管内上下两部分，分别称量两部分填充剂质量(M_上、M_下，M_上/M_下＝1±0.05)，然后分别加入10倍质量的水稀释填充剂，收集离心后底部微球，反复加入10倍质量水离心清洗微球三次去除凝胶，收集微球并烘干，称量收集的微球质量(m_上、m_下)，按下式计算每部分微球占比(ρ_上、ρ_下)，查看样品微球分布情况。

ρ_下＝1-ρ_上。

12000r/min高速离心下不分层的组别的测试统计结果见表2。

表2

组别	上半部分微球含量占比	下半部分微球含量占比
			实施例1	48.1％	51.9％
实施例2	42.7％	57.3％
			实施例3	43.6％	56.4％
实施例4	44.2％	55.8％

结果显示，实施例1上下两部分微球含量占比最近似。

2、取1ml注射型组织填充剂，置于1ml注射器中，排出气泡，安装27G针头(参考同类型产品普遍包装)，参考YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶附录A推挤力的测定方法测定组合物的推挤力。

结果，实施例1-6、对比例12、14、16、18、20、22、24、25的样品推挤力≤15N，其余对比例样品>15N。其中，实施例1的推挤力测试结果图参见图6。活塞持续滑动的持续力≤15N，说明相应组合物具有较适中的推挤力，对于医生的手术操作具有较好的适从性。

3、筛选健康新西兰白兔44只，分为11组，每组4只，分别将实施例1-6与对比例1-4、25制备的注射型组织填充剂样品注入左、右背部皮下，每只兔子每侧背部注射3点，每个点位注射0.1ml，各点位间隔2cm。观察皮肤红肿反应。定期分批处死(一个月和三个月每组各两只)，取注射物皮丘，镜下观察胶原增生的情况。实施例1的动物实验切片观察测试结果见图7。各组别统计结果见表3。

表3

本发明的在线剪切乳化法工艺参数和乳剂种类及油水比配方设计，使微球粒径小、粒径分布窄，球形度高，表面光滑，无需筛分，工业化制备产率高，工业化成本低，可有效降低植入后的皮下结节和红肿等不良反应的发生率，同时微球降解时间可控。

本发明的多级自交联HA凝胶技术，采用多级交联HA凝胶，实现梯度降解周期，交联剂使用可控，残留量小，实现注射位置精准和固定，解决填充物移位风险，梯度降解周期的HA凝胶，降低了聚合物微球沉降聚集作用，提高靶向即刻填充效果，为微球提供靶向定位和填充作用，提高与皮下组织之间的交互作用，促进细胞粘附和增殖。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种制备聚合物微球的方法，其特征在于，所述聚合物微球的聚合物原料包括PCL、PLGA、PLA、PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA中的一种或多种；

所述聚合物微球通过将水相与油相混合后，以多级管线式在线剪切方式进行乳化剪切制备而成，剪切的转速为4000-12000r/min；

所述油相包括所述聚合物原料和有机溶剂，所述油相的浓度为5-20％；所述水相为PVA的水溶液，所述水相的浓度为0.4％-1％(w/v)；所述油相与水相的体积比为1：(3-5)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油相的浓度为10％-20％；所述水相的浓度为0.4％-0.8％(w/v)；所述油相与水相的体积比为1：(3-4)；

和/或，采用三级在线式剪切乳化机进行乳化剪切，剪切的转速为4000-6500r/min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚合物原料的特性粘度为0.2-2.0dl/g；所述PVA的动力粘度为20±5mPa·s，醇解度＞88％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃中的一种或多种；优选所述有机溶剂为二氯甲烷。

5.一种聚合物微球，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。

6.一种注射型组织填充剂，其特征在于，包括权利要求5所述的聚合物微球的磷酸盐混悬液和凝胶液；所述凝胶液为CMC凝胶、自交联HA凝胶、海藻酸钠凝胶中的一种或多种；所述凝胶液在注射型组织填充剂中的质量占比为60％-90％；所述聚合物微球的磷酸盐混悬液中，所述聚合物微球的含量为65±5％(w/w)。

7.根据权利要求6所述的注射型组织填充剂，其特征在于，所述凝胶液为自交联HA凝胶；所述自交联HA凝胶的制备方法包括：

(1)将透明质酸钠与交联剂进行反应，获得微交联透明质酸钠凝胶；

(2)将所述微交联透明质酸钠凝胶制成大小为50-250μm的凝胶微粒；

(3)将所述凝胶微粒与未交联的透明质酸钠的溶液按体积比(1-5)：(5-9)混合；所述未交联的透明质酸钠的溶液的浓度为3％-8％(w/v)；

在步骤(1)的反应体系中，所述透明质酸钠的浓度为3％-8％(w/v)，所述交联剂的浓度为0.1％-5％(w/v)。

8.根据权利要求7所述的注射型组织填充剂，其特征在于，步骤(1)中用于进行交联反应的透明质酸钠的粘度为29.5±2dl/g；步骤(3)中未交联的透明质酸钠的粘度为37±1dl/g；

和/或，所述交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

9.根据权利要求8所述的注射型组织填充剂，其特征在于，

在步骤(1)的反应体系中，所述透明质酸钠的浓度为5％(w/v)，交联剂的浓度为0.5％(w/v)；步骤(3)中未交联的透明质酸钠的溶液的浓度为5％(w/v)；

在步骤(3)中，将所述凝胶微粒与未交联的透明质酸钠的溶液按体积比3:7混合。

10.一种制备权利要求6-9任一项所述的注射型组织填充剂的方法，其特征在于，包括：

(1)将聚合物微球混悬在磷酸盐缓冲溶液中，得到聚合物微球的磷酸盐混悬液；

(2)将所述聚合物微球的磷酸盐混悬液与凝胶液混合。

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