CN115746014B - 马醉木中具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的抗血栓化合物及其制备和应用 - Google Patents
马醉木中具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的抗血栓化合物及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及马醉木中具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的抗血栓化合物及其制备和应用，属于医药技术领域。本发明化合物的结构式如式I或式II所示，本发明具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物或前体用于制备抗血栓药物的应用，具体为脑中风、脑梗阻或肺栓塞药物。本发明中的化合物为专一性的蛋白二硫键异构酶抑制剂；能够浓度依赖性地抑制α‑凝血酶诱导的血小板聚集，且通过抑制胞外PDI酶活性来减少血小板活化；通过作用于胞外PDI酶活性来抑制血小板聚集和纤维蛋白生成，从而发挥体内的抗血栓活性；不增加出血风险，是安全有效的抗血栓药物化合物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及马醉木中具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的抗血栓化合物及其制备和应用，尤其涉及马醉木中具有PDI抑制作用的化合物1-6及其分离制备方法和应用。具体涉及化合物分离纯化过程，结构确证，PDI酶抑制作用，分子对接和分子动力学模拟，体内、外抗血栓作用和体内出血风险评估。
背景技术
血栓性疾病是心血管疾病的一种，常见有缺血性脑卒中、中风和肺栓塞等，呈现高发病率和高死亡率，严重危害人体健康和生活质量。临床上针对血栓性疾病治疗药物有抗凝药、抗血小板药和溶栓药。血小板活化和聚集是血栓性疾病发展恶化的重要因素，因此抑制血小板聚集是治疗血栓性疾病的首要研究方向。目前抗血小板药物主要包括COX抑制剂、P2Y12拮抗剂、蛋白酶激活受体抑制剂和GPIIb/IIIa受体拮抗剂，常用药物有阿司匹林、氯吡格雷和替格瑞洛等。尽管这些药物能有效地减少血栓形成，降低心血管疾病发病率，但是仍存在不同程度的出血和药物抵抗等缺陷。因此，寻找疗效更佳、安全性更高的新型抗血栓药物对治疗和预防血栓性疾病具有重大意义。
蛋白二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase，PDI)是具有催化蛋白质二硫键氧化、还原和异构功能的酶。PDI酶与血小板表面的整合素αIIbβ3结合，催化αIIbβ3中二硫键开放和构象变化，促进血小板活化和聚集而形成血栓。同时，PDI也能介导凝血因子活化、释放，激活纤维蛋白凝血通路。PDI酶可双重调控血小板聚集和纤维蛋白生成，是抗血栓治疗的新靶点，因此PDI酶抑制剂是潜在的新型抗血栓先导化合物。与传统的抗血小板药物相比，PDI抑制剂不直接阻断血小板活化受体或凝血因子，出血风险较低，安全性更高。小分子PDI抑制剂具有选择性高和抑制率高的特点，新型小分子PDI抑制剂是血栓性疾病领域备受关注的焦点。从传统药用植物中探寻显著药效活性的先导化合物是药物研究的热点，因此，从药用植物中发现新颖的PDI抑制剂是开发新型抗血栓药物的有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供具有蛋白二硫键异构酶PDI抑制作用的化合物以及其分离制备方法。本发明的另一目的是阐明该PDI抑制作用的化合物在制备抗血栓药物中的应用价值。
根据本发明第一方面，提供了一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物，所述化合物的结构式如式I或式II所示；
式I中的R1-R11以及式II中的R1-R5各自独立地选择氢、羟基、含1～10碳原子的烷基、硝基、氰基、酰基、酰卤、苯环或杂环。
优选地，所述杂环为咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、吲哚、咔唑、吡啶、嘧啶、二氢化吡咯、二氢吡唑、二氢嘧啶、恶唑啉环或哌嗪环。
优选地，所述化合物的结构式为式1、式2、式3或式4所示；
根据本发明另一方面，提供了所述的具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的生源前体，所述生源前体的结构式为式5或式6所示；
根据本发明另一方面，提供了一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；其中第8组分Fr.8经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同组分，得到极性从大到小的16个亚组分Fr.8A-Fr.8P；其中组分Fr.8L经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的7个亚组分Fr.8L1-Fr.8L7；组分Fr.8L6继续经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到含量最大的亚组分Fr.8L6a；组分Fr.8L6a经过正相硅胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇洗脱，得到1个亚组分Fr.8L6a1；组分Fr.8L6a1经过半制备高效液相色谱柱分离，得到式1所示的化合物；
根据本发明另一方面，提供了一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；其中第8组分Fr.8经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同组分，得到极性从大到小的16个亚组分Fr.8A-Fr.8P；组分Fr.8M和Fr.8N合并，经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，获得分子量从大到小的3个亚组分Fr.8M1-Fr.8M3；其中组分Fr.8M3经过正相硅胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇洗脱，得到极性从小到大的3个亚组分Fr.8M3a-Fr.8M3c；组分Fr.8M3c经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到1个亚组分Fr.8M3c1；该组分Fr.8M3c1经过半制备高效液相色谱柱分离，得到式2所示的化合物；
根据本发明另一方面，提供了一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；第10组分Fr.10和第11组分Fr.11合并经过反相中压柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从大到小的6个亚组分Fr.10A-Fr.10F；组分Fr.10C经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的2个亚组分Fr.10C1和Fr.10C2；组分Fr.10C1经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到式6所示的化合物；
根据本发明另一方面，提供了一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；第10组分Fr.10和第11组分Fr.11合并经过反相中压柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从大到小的6个亚组分Fr.10A-Fr.10F；组分Fr.10E经过甲醇溶液重结晶得到式5所示的化合物；
根据本发明另一方面，提供了一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将正丁醇萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的11个组分Fr.a-Fr.k；第四组分Fr.d经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到极性从小到大的7个亚组分Fr.d1-Fr.d7；组分Fr.d5经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，得到极性从大到小的16个亚组分Fr.d5A-Fr.d5P；组分Fr.d5K经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到7个亚组分Fr.d5K1-Fr.d5K7；组分Fr.d5K6经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到极性从小到大的9个亚组分Fr.d5K6a-Fr.d5K6i；其中组分Fr.d5K6g经过半制备高效液相色谱C18柱分离，得到式4所示的化合物；
根据本发明另一方面，提供了一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将正丁醇萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的11个组分Fr.a-Fr.k；第五组分Fr.e经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，得到极性从大到小的21个亚组分Fr.e1-Fr.e21；组分Fr.e12经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的10个亚组分Fr.e12A-Fr.e12J；其中组分Fr.e12G经过中压柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，得到极性从大到小的4个亚组分Fr.e12G1-Fr.e12G4；组分Fr.e12G4经过半制备高效液相色谱苯基柱分离，得到式3所示的化合物；
根据本发明另一方面，提供了所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物或所述生源前体用于制备抗血栓药物的应用。
根据本发明另一方面，提供了所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物或所述生源前体用于制备治疗脑中风、脑梗阻或肺栓塞药物的应用。
优选地，所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物或所述生源前体用于抑制α-凝血酶诱导的血小板聚集，且通过抑制胞外蛋白二硫键异构酶活性来减少血小板活化。
优选地，所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物或所述生源前体用于抑制胞外蛋白二硫键异构酶活性来抑制血小板聚集和纤维蛋白生成，从而发挥抗血栓作用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明中提供的化合物1-4为两类全新骨架化合物。化合物1和2含有一个前所未有的多氧杂环桥联二氢查耳酮二聚体新骨架，具有独特的3,6,10,15-四氧杂四环[7.6.0.04,9.01,12]十五烷环系的骨架结构，由3个四氢呋喃环和1个四氢吡喃环融合而成的9个连续手性立体中心的结构。化合物3和4属于二氢查耳酮重排糖苷类化合物，具有独特的2,7-二氧双杂环[3.3.0]辛烷的核心结构。
(2)本发明中提供的化合物1-6具有显著的PDI酶抑制活性，且化合物1、2和4具有纳摩尔级别PDI抑制活性，显著强于阳性对照药异槲皮素。本发明中提供式I或式II的有潜在的PDI酶抑制活性。
(3)本发明通过计算机分子对接，结合化合物与PDI的活性结果，总结PDI蛋白中的Lys328、Lys352、Pro353、Leu354和Leu355残基是PDI蛋白的活性结合位点，为后续开发高效的PDI抑制剂提供理论依据。
(4)本发明中化合物1(PDI酶最强抑制剂)在体内的激光诱导小鼠损伤实验中，能浓度依耐性地降低体内血小板的聚集和纤维蛋白的生成。在中等剂量(3μg/g)和高剂量(10μg/g)下，具有显著的抗血栓作用。
(5)本发明中提供的具有PDI酶抑制活性的化合物的优势是不增加出血风险，有潜力开发成安全有效的抗血栓药物。
附图说明
图1是化合物1的X-射线单晶衍射图；
图2是化合物3的X-射线单晶衍射图；
图3是化合物1、2和异槲皮素对PDI酶抑制活性结果图；
图4是化合物1的分子对接和分子动力学模拟结果图；
图5是化合物1抑制胞外PDI减少体内血栓形成结果图；
图6是化合物1对小鼠尾出血影响结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式I或式II所示；
式I中的R1-R11以及式II中的R1-R5各自独立地选择氢、羟基、含1～10碳原子的烷基、硝基、氰基、酰基、酰卤、苯环或杂环等。
一些实施例中，本发明提供的具有PDI抑制作用的化合物1-6是二氢查耳酮类化合物，其结构式如下：
化合物1：Piericone A
化合物2：Piericone B
化合物3：Piericone C
化合物4：Piericone D
化合物5：Phlorizin根皮苷
化合物6：Asebotin马醉木素
本发明化合物是从杜鹃花科马醉木属药用植物马醉木(Pieris japonica)中分离纯化得到。本发明通过对马醉木的95％乙醇提取物中的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位浸膏进行反复柱层析分离纯化，得到上述二氢查耳酮类化合物1-6，其中化合物1-4为两种类型新骨架化合物。化合物1和2含有一个前所未有的多氧杂环桥联二氢查耳酮二聚体新骨架，具有独特的3,6,10,15-四氧杂四环[7.6.0.04,9.01,12]十五烷环系的骨架结构，由3个四氢呋喃环和1个四氢吡喃环融合而成的9个连续手性立体中心的结构。化合物3和4属于二氢查耳酮重排糖苷类化合物，具有独特的2,7-二氧双杂环[3.3.0]辛烷的核心结构。化合物5和化合物6为生源前体。运用多种波谱分析方法、化学衍生化法、量子化学计算法(13C-NMR DP4+概率分析和计算ECD)以及X射线单晶衍射等方法确定其结构，具体结构如化合物1-化合物6所示。
本发明提供的上述化合物1-6能显著地抑制胞外PDI还原酶活性的作用，可用于制备抗血栓药物，具体可用于制备治疗血栓性疾病如脑中风、脑梗阻或肺栓塞等药物。
本发明的另一个任务是提供具有以下式(I)所示结构的化合物，
其中，R1-R11可以相同或不同，可以各自、分别或同时为氢、羟基、含1～10碳原子的烷基、硝基、氰基、酰基和酰卤等。R1-R11可以各自、分别或同时为以下芳杂环，如苯环、咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、吲哚、咔唑、吡啶、嘧啶、二氢化吡咯、二氢吡唑、二氢嘧啶、恶唑啉环和哌嗪环等。
本发明的又一个任务是提供具有以下式(II)所示结构的化合物，
其中，R1-R5可以相同或不同，可以各自、分别或同时为氢、羟基、含1～10碳原子的烷基、硝基、氰基、酰基和酰卤等。R1-R5可以各自、分别或同时为以下芳杂环，如苯环、咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、吲哚、咔唑、吡啶、嘧啶、二氢化吡咯、二氢吡唑、二氢嘧啶、恶唑啉环和哌嗪环等。
本发明的另一个实施例提供了化合物1-6对PDI还原酶活性的抑制作用的实验资料。化合物1-6的PDI酶抑制活性通过胰岛素浊度法测定。结果表明，化合物1-6具有显著的PDI酶抑制活性，且化合物1、2和4具有纳摩尔级别PDI抑制活性，显著强于阳性对照药异槲皮素。
本发明的另一个实施例对化合物1(PDI酶抑制活性最强)进行了PDI酶亚型ERp5、ERp57和ERp72的抑制活性测定，结果表明化合物1对PDI酶亚型ERp5、ERp57和ERp72没有明显地抑制作用，说明化合物1是专一性的PDI酶抑制剂。
本发明的又一实施例利用Autodock和Discovery Studio等分子对接软件，研究化合物1和2与PDI酶(pdb ID：4EKZ)的作用模式。并通过分子动力学模拟进一步确认化合物1和2与PDI蛋白的结合机制。
本发明的又一实施例对化合物1进行了体外血小板聚集活性的测定，结果表明化合物1能够浓度依赖性地抑制α-凝血酶诱导的血小板聚集，且通过抑制胞外PDI酶活性来减少血小板活化。
本发明的又一实施例对化合物1进行了激光诱导损伤的小鼠体内抗血栓活性的测定，结果表明化合物1通过作用于胞外PDI酶活性来抑制血小板聚集和纤维蛋白生成，从而发挥体内的抗血栓活性。
本发明的又一实施例通过小鼠断尾实验对化合物1的出血风险进行评估，发现化合物1不增加出血风险，是安全有效的抗血栓药物先导化合物。
以下为具体实施例：
实施例1
1、化合物1-6的制备分离
干燥的马醉木叶子(Pieris japonica，37.0kg)粉碎，用95％乙醇常温提取4次，每次7天，减压浓缩提取液合并得到总浸膏。粗浸膏温水混悬，依次用极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取部位(1568.8g)用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱(30：1～3：1，V/V)，结合TLC板检测，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分(Fr.1-Fr.16)。第8组分(Fr.8，59.8g)经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱(35：65～100：0，V/V)，结合TLC板检测，合并相同组分，得到极性从大到小的16个亚组分(Fr.8A-Fr.8P)。其中组分Fr.8L经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，获得分子量从大到小的7个亚组分(Fr.8L1-Fr.8L7)。组分Fr.8L6继续经过一个小规格的Sephadex LH-20凝胶柱层析得到含量大的亚组分(Fr.8L6a)。组分Fr.8L6a经过正相硅胶H柱层析，以二氯甲烷/甲醇洗脱(25：1，V/V)，得到1个亚组分Fr.8L6a1。组分Fr.8L6a1经过半制备高效液相色谱柱分离，流动相为乙腈/水(47：53，V/V)，流速为1.5mL/min，得到化合物1(piericone A，34.4mg，0.0000930％)，保留时间tR为63.5min。组分Fr.8M和Fr.8N合并，经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，获得分子量从大到小的3个亚组分(Fr.8M1-Fr.8M3)。其中组分Fr.8M3经过正相硅胶H柱层析，以二氯甲烷/甲醇洗脱(30：1，V/V)，得到极性从小到大的3个亚组分(Fr.8M3a-Fr.8M3c)。组分Fr.8M3c经过SephadexLH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到1个亚组分Fr.8M3c1。该组分Fr.8M3c1经过半制备高效液相色谱柱分离，流动相为乙腈/水(63：37，V/V)，流速为1.5mL/min，得到化合物2(piericone B，209.2mg，0.0005654％)，保留时间tR为33.2min。第10组分Fr.10和第11组分Fr.11合并经过反相中压柱层析，用甲醇/水梯度洗脱(30：70～90：10，V/V)，结合TLC板检测，合并相同的组分，得到极性从大到小的6个亚组分(Fr.10A-Fr.10F)。组分Fr.10C经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的2个亚组分Fr.10C1和Fr.10C2。组分Fr.10C1经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱(20：1～5：1，V/V)，获得纯度较高的化合物6(53.8mg，0.0001454％)。组分Fr.10E经过甲醇溶液重结晶得到化合物5(118.8g,0.3210811％)。
正丁醇萃取部位(1087.1g)用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱(15：1～0：1，V/V)，结合TLC板检测，合并相同的组分，得到11个组分(Fr.a-Fr.k)。第四组分Fr.d经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱(15：1～5：1，V/V)，得到极性从小到大的7个亚组分(Fr.d1-Fr.d7)。组分Fr.d5经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱(40：60～100：0，V/V)，得到极性从大到小的16个亚组分(Fr.d5A-Fr.d5P)。组分Fr.d5K经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到7个亚组分Fr.d5K1-Fr.d5K7。组分Fr.d5K6经过正相硅胶H柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱(100：1～30：1，V/V)，得到极性从小到大的9个亚组分(Fr.d5K6a-Fr.d5K6i)。其中组分Fr.d5K6g经过半制备高效液相色谱C18柱分离，流动相为乙腈/水(48：52，V/V)，流速为1.5mL/min，得到化合物4(piericone D，5.5mg，0.0000149％)，保留时间tR为29.2min。组分Fr.e经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱(15：85～100：0，V/V)，结合TLC板检测情况，得到极性从大到小的21个亚组分(Fr.e1-Fr.e21)。组分Fr.e12经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的10个亚组分(Fr.e12A-Fr.e12J)。其中组分Fr.e12G经过中压ODS柱层析，用甲醇/水梯度洗脱(25：75～35：65，V/V)，得到极性从大到小的4个亚组分(Fr.e12G1-Fr.e12G4)。组分Fr.e12G4经过半制备高效液相色谱苯基柱分离，流动相为乙腈/水(38：62，V/V)，流速为1.5mL/min，得到化合物3(piericone C，9.5mg，0.0000257％)，保留时间tR为41.5min。
2、化合物1-6的结构鉴定
结合多种波谱分析方法(高分辨质谱、紫外光谱、红外光谱、和核磁共振谱)、化学衍生化法、量子化学计算法(13C-NMR DP4+概率分析和ECD)以及X射线单晶衍射等方法综合分析，确定化合物1-6的结构。其中化合物1和化合物3的绝对构型通过X射线单晶衍射确定，如图1和图2所示。
化合物1(piericone A)：无色块状晶体；熔点232-234℃；旋光值[α]25 D+5(c 0.5，甲醇)；紫外(甲醇)λmax(logε):225(2.51),284(2.46)nm；红外(溴化钾)νmax 3427,1622,1514,1447,1375,1213,1165,1090,1047,864cm-1；ECD(甲醇)λmax(Δε):211(-27.4),221(-1.48),229(-13.6),289(+19.7)nm；高分辨质谱m/z[M+Na]+901.2139(计算值C43H42O20Na,901.2167)和[2M+Na]+1779.4212(计算值C86H84O40Na,1779.4437)。其1H和13C NMR谱图数据见表1和表2。
化合物2(piericone B)：白色无定型粉末；旋光值[α]25 D+3(c 0.1，甲醇)；紫外(甲醇)λmax(logε):225(2.07),283(2.07)nm；红外(溴化钾)νmax3410,1791,1620,1515,1434,1377,1215,1163,1092,825cm-1；ECD(甲醇)λmax(Δε):220(+5.28),223(-3.50),289(+9.36)nm；高分辨质谱m/z[M+Na]+915.2287(计算值C44H44O20Na,915.2324)。其1H和13C NMR谱图数据见表1。
表1化合物1和2的1H NMR和13C NMR数据(氘代甲醇，400MHz)
表2化合物1的1H和13C NMR数据(氘代二甲基亚砜，600MHz)
化合物3(piericone C)：无色块状晶体；熔点168-169℃；旋光值[α]25 D-57(c 0.1，乙醇)；紫外(乙醇)λmax(logε):225(3.0)and 286(2.9)nm；红外(溴化钾)νmax 3351,1771,1626,1602,1516,1445,1368,1200,1105,1064,986,948,827cm-1；ECD(乙醇)λmax(Δε):211(-27.9),222(-0.5),228(-15.3),288(+15.1)nm；高分辨质谱m/z[M+Na]+455.0958(calcdfor C21H20O10Na,455.0954)。其1H和13C NMR谱图数据见表3。
化合物4(piericone D)：无色油状物；旋光值[α]25 D-112(c 0.1，乙醇)；紫外(乙醇)λmax(logε):225(3.3),283(3.2)nm；红外(溴化钾)νmax 3384,2926,1774,1624,1517,1428,1372,1210,1163,1104,1066,988,948,827cm-1；ECD(乙醇)λmax(Δε):205(-71.5),221(+4.3),230(-12.8),283(+14.7)nm；高分辨质谱m/z[M+Na]+469.1113(计算值C22H22O10Na,469.1111)。其1H和13C NMR谱图数据见表3。
表3化合物3和4的1H和13C NMR数据(氘代二甲基亚砜，[a]600MHz，[b]400MHz)
化合物5(phlorizin，根皮苷)：白色无定型粉末；旋光值[α]25 D-30(c0.1，甲醇)；1HNMR(氘代甲醇,400MHz)δH:2.87(t,J＝7.6Hz,H2-2),3.47(t,J＝7.6Hz,H2-3),7.06(d,J＝8.5Hz,H-12/H-16),6.69(d,J＝8.5Hz,H-13/H-15),6.20(d,J＝2.3Hz,H-6),5.96(d,J＝2.3Hz,H-8),5.05(d,J＝7.0Hz,H-1′),3.73(dd,J＝12.1,5.4Hz,H-6′a),3.91(dd,J＝12.1,1.9Hz,H-6′b)。
化合物6(asebotin，马醉木素)：白色无定型粉末；旋光值[α]25 D-49(c0.1，甲醇)；1H NMR(氘代甲醇,400MHz)δH:2.88(t,J＝7.3Hz,H2-2),3.47(t,J＝7.3Hz,H2-3),7.06(d,J＝8.4Hz,H-12/H-16),6.69(d,J＝8.4Hz,H-13/H-15),6.30(d,J＝2.4Hz,H-6),6.12(d,J＝2.4Hz,H-8),5.08(d,J＝7.3,Hz,H-1′),3.46(m,H-2′),3.46(m,H-3′),3.38(m,H-4′),3.37(m,H-5′),3.69(dd,J＝12.1,5.9Hz,H-6′a),3.90(dd,J＝12.1,2.0Hz,H-6′b)；13C NMR(氘代甲醇,100MHz):δC 47.2(C-3),30.9(C-2),207.1(C-4),162.0(C-5),95.0(C-6),167.4(C-7),96.7(C-8),167.5(C-9),107.8(C-10),133.9(C-11),130.5(C-12),116.2(C-13),156.5(C-14),116.2(C-15),130.5(C-16),102.3(C-1′),74.9(C-2′),78.6(C-3′),71.4(C-4′),78.6(C-5′),62.6(C-6′)。
实施例2
化合物1-6的PDI酶抑制活性是通过胰岛素浊度法来进行评价。单体化合物初筛浓度10μM，用酶标仪记录650nm波长处的OD值，连续测定120min，每1min读数一次，每组3个复孔。选择检测终点(120min)处OD值小的化合物，设置浓度梯度进行下一步复筛(0.1、0.3、1、3、10和30μM)。化合物1-6的PDI抑制率其结果如表4所示。其中化合物1和2以及异槲皮素的PDI抑制活性结果如图3所示，由图3可知，化合物1(图3中的A)和2(图3中的B)具有显著的PDI酶抑制活性，其抑制结果明显强于阳性药异槲皮素(图3中的C)。
表4.化合物1-6的PDI酶抑制活性
[a]阳性药：异槲皮素.[b]每个实验重复3次.
结论：化合物1-6对PDI酶具有显著的抑制作用，其中化合物1、2和4具有纳摩尔级别的PDI酶抑制活性，其IC50值分别为0.15±0.04、0.23±0.03和4.60±0.04μM，抑制强度分别是阳性药异槲皮素的41.8，20.9和12.5倍。化合物3、5和6具有微摩尔强度的PDI酶抑制活性。
实施例3
PDI家族的其它硫醇异构酶如ERp5、ERp57和ERp72等也参与血栓形成。为了评价化合物对PDI抑制活性的专一选择性，本实施例对化合物1进行了其他硫醇异构酶ERp5、ERp57和ERp72等抑制活性评价。
结论：化合物1专一性地、特异性地抑制PDI还原酶活性，而对PDI亚型ERp5、ERp57和ERp72等其他硫醇异构酶家族没有明显的抑制活性。
实施例4
PDI抑制剂一般分为可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂两种，抗血栓药物需要可逆性PDI抑制剂，而不可逆抑制剂毒副作用大，一般适用于抗肿瘤药物。可逆性抑制剂又分为竞争性、非竞争性、混合型和反竞争抑制剂。本实施例首次通过酶抑制动力学法研究PDI抑制剂的抑制类型和Ki常数。化合物1和2对PDI酶的抑制作用类型如表5所示。
表5化合物1和2的PDI酶抑制剂类型
结论：化合物1和2以及阳性药异槲皮素均为PDI酶的非竞争性抑制剂，其抑制常数Ki值分别为0.73±0.03、0.72±0.05和19.90±3.29μM。与阳性药相比，化合物1和2的Ki值低于阳性药约28倍，表现出对PDI酶更强效的抑制作用。
实施例5
本实施例利用Autodock和Discovery Studio等分子对接软件，研究化合物1-2与PDI酶(pdb ID：4EKZ)的作用模式。通过分子动力学模拟，反映化合物与PDI蛋白结合的动态构象变化和运动轨迹。PDI主要包含有a，a′，b和b′四个结构域，其中a和a′属于催化结构域，主要作用于二硫键的形成、断裂和重排，b和b′属于非催化，在b′结构域中有一个疏水性口袋主要用于底物结合(图4中的A)。
结论：分子对接结果显示，实施例1中得到的化合物1-2均结合在PDI的a′和b′结构域，不同于阳性药异槲皮素结合在b′结构域。化合物1和2都与Lys328、Lys352、Pro353、His354和Leu355残基都有很强的氢键相互作用(图4中的B)。另外化合物1还与a′结构域中的Met356、Ser357、Gln358和Lys375残基有氢键相互作用(图4中的B)。该对接结果可推断出PDI蛋白中的Lys328、Lys352、Pro353、Leu354和Leu355残基是PDI蛋白的活性位点，为后续开发高效的PDI抑制剂提供理论依据。
为了进一步确认化合物1和2与PDI蛋白的结合机制，利用Discovery Studio软件对PDI-1和PDI-2复合物进行分子动力学模拟。在模拟级联过程中，PDI-1和PDI-2复合物的构象都没有明显的变化，均方根偏差(RMSD)(图4中的C)和均方根波动(RMSF)值(图4中的D)的变化分别小于和/>，表明PDI-1和PDI-2复合物结合的高稳定性和亲和力。
实施例6
本实施例利用血小板凝集测定仪来评价化合物1对体外血小板聚集的作用。将化合物1溶液(0.3、1、3、10和30μM)与血小板充分混合，加入诱导剂α-凝血酶(0.04U/mL)，使用血小板聚集仪检测各组血小板聚集百分率。实验组额外添加重组PDI蛋白，观察化合物1对血小板聚集的影响，评价化合物1是否靶向PDI来发挥体外抗血栓活性。增加PBS洗涤步骤，观察血小板聚集的变化，判断化合物1与PDI是否可逆性地结合。
结论：化合物1能浓度依耐性地减少α-凝血酶诱导的血小板凝集，在10μM浓度下能显著地减缓体外血栓形成。通过添加重组PDI蛋白评估化合物1对血小板聚集的影响，发现化合物1能减弱PDI引起的血小板聚集，表明化合物1是通过抑制PDI活性来减少血小板的聚集和活化。将预孵育化合物1的血小板用PBS洗涤，结果发现增加洗涤的步骤完全消除了化合物1对血小板的聚集抑制作用，表明化合物1与胞外PDI蛋白通过可逆性地结合来发挥抗血栓活性。
实施例7
本实施例通过激光诱导损伤小鼠血栓模型来评价化合物1体内抗血栓活性。静脉注射不同浓度的化合物1溶液(1、3和10μg/g)，使用高速宽视野活体显微镜记录每组小鼠各规定时间点(0、30、60、120和180min)血栓成像，利用Western blot法测定血栓组织中血小板和纤维蛋白的水平。在化合物1实验组(5μg/g)中额外补充重组PDI蛋白，实时观测各时间点小鼠动脉血栓情况，具体实验结果如图5所示。
结论：化合物1能够浓度依赖性地抑制小鼠体内血小板聚集和纤维蛋白的生成(图5中的A)。分析每个单独的血栓组织的曲线下面积(AUC)表明，在中等剂量(3μg/g)和高剂量(10μg/g)实验组，化合物1能显著抑制血小板积聚(图5中的B和5中的D)和纤维蛋白沉积(图5中的C和图5中的E)。
在实验组中重新输注重组PDI蛋白后，化合物1能减少因PDI导致的血栓的形成(图5中的F)。在3μg/g剂量下，化合物1能显著抑制血小板积聚(图5中的G和5中的I)和纤维蛋白沉积(图5中的H和5中的J)，抑制率分别为87.8％和60.5％。但是重输注PDI蛋白又增加了血小板聚集和纤维蛋白沉积，表明化合物1通过靶向PDI蛋白能有效的抑制体内血栓的形成。
实施例8
目前常用抗血栓药物如阿司匹林、氯吡格雷和替格瑞洛等，尽管能有效地降低心脑血管疾病的发病率，但是长时间服用会有严重的出血副反应。本实施例利用小鼠尾出血模型，通过测定断尾小鼠的出血时间，再出血次数和出血的血红蛋白含量来评估化合物1的出血风险(图6)。
结论：化合物1不延长断尾小鼠的出血时间(图6中的A)，不增加出血的血红蛋白含量(图6中的B)和再出血次数(图6中的C)，不增加出血风险。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式为式1、式2、式3或式4所示；
2.如权利要求1所述的化合物的生源前体根皮苷式5和马醉木素式6在制备抗血栓药物中的应用；
3.如权利要求1所述的化合物的生源前体根皮苷式5和马醉木素式6在制备治疗脑中风、脑梗阻或肺栓塞药物中的应用；
4.一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，其特征在于，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；其中第8组分Fr.8经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同组分，得到极性从大到小的16个亚组分Fr.8A-Fr.8P；其中组分Fr.8L经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的7个亚组分Fr.8L1-Fr.8L7；组分Fr.8L6继续经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到含量最大的亚组分Fr.8L6a；组分Fr.8L6a经过正相硅胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇洗脱，得到1个亚组分Fr.8L6a1；组分Fr.8L6a1经过半制备高效液相色谱柱分离，得到式1所示的化合物；
5.一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，其特征在于，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；其中第8组分Fr.8经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同组分，得到极性从大到小的16个亚组分Fr.8A-Fr.8P；组分Fr.8M和Fr.8N合并，经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，获得分子量从大到小的3个亚组分Fr.8M1-Fr.8M3；其中组分Fr.8M3经过正相硅胶柱层析，以二氯甲烷/甲醇洗脱，得到极性从小到大的3个亚组分Fr.8M3a-Fr.8M3c；组分Fr.8M3c经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到1个亚组分Fr.8M3c1；该组分Fr.8M3c1经过半制备高效液相色谱柱分离，得到式2所示的化合物；
6.一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，其特征在于，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；第10组分Fr.10和第11组分Fr.11合并经过反相中压柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从大到小的6个亚组分Fr.10A-Fr.10F；组分Fr.10C经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的2个亚组分Fr.10C1和Fr.10C2；组分Fr.10C1经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到式6所示的化合物；
7.一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，其特征在于，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将乙酸乙酯萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的16个组分Fr.1-Fr.16；第10组分Fr.10和第11组分Fr.11合并经过反相中压柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从大到小的6个亚组分Fr.10A-Fr.10F；组分Fr.10E经过甲醇溶液重结晶得到式5所示的化合物；
8.一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，其特征在于，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将正丁醇萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的11个组分Fr.a-Fr.k；第四组分Fr.d经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到极性从小到大的7个亚组分Fr.d1-Fr.d7；组分Fr.d5经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，得到极性从大到小的16个亚组分Fr.d5A-Fr.d5P；组分Fr.d5K经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到7个亚组分Fr.d5K1-Fr.d5K7；组分Fr.d5K6经过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到极性从小到大的9个亚组分Fr.d5K6a-Fr.d5K6i；其中组分Fr.d5K6g经过半制备高效液相色谱C18柱分离，得到式4所示的化合物；
9.一种具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物的提取分离方法，其特征在于，将马醉木叶子干燥后粉碎，用乙醇提取后，减压浓缩提取液合并得到总浸膏，将所述总浸膏经水混悬后，先后加入极性从小到大的溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取；将正丁醇萃取部位用100-200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，然后用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，合并相同的组分，得到极性从小到大的11个组分Fr.a-Fr.k；第五组分Fr.e经过反相C18硅胶柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，得到极性从大到小的21个亚组分Fr.e1-Fr.e21；组分Fr.e12经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用甲醇洗脱，得到分子量从大到小的10个亚组分Fr.e12A-Fr.e12J；其中组分Fr.e12G经过中压柱层析，用甲醇/水梯度洗脱，得到极性从大到小的4个亚组分Fr.e12G1-Fr.e12G4；组分Fr.e12G4经过半制备高效液相色谱苯基柱分离，得到式3所示的化合物；
10.如权利要求1所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物用于制备抗血栓药物的应用。
11.如权利要求1所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物用于制备治疗脑中风、脑梗阻或肺栓塞药物的应用。
12.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物或所述生源前体用于抑制α-凝血酶诱导的血小板聚集，且通过抑制胞外蛋白二硫键异构酶活性来减少血小板活化。
13.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述具有蛋白二硫键异构酶抑制作用的化合物或所述生源前体用于抑制胞外蛋白二硫键异构酶活性来抑制血小板聚集和纤维蛋白生成，从而发挥抗血栓作用。
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