JP5995235B2 - シガテラを治療するためのロスマリン酸及びその誘導体の使用 - Google Patents

Description

本発明は、魚による食中毒、特にシガテラを治療することを意図した医薬品を製造するためのロスマリン酸及びその誘導体の使用に関する。

シガテラは、魚肉中毒、即ち、サンゴ礁内に存在する底生微細藻類ガンビエルディスカスｓｐｐ（Gambierdiscus spp）のシガトキシン（ＣＴＸ）で汚染された新鮮な魚による食中毒の形態である。それは、太平洋、インド洋及びカリブ海の地域における、魚よりの中毒の最も一般的な形態の１つである。

シガトキシンは、ガンビエルディスカス・トキシカス（Gambierdiscus toxicus）が付着した、珊瑚を採食する魚及び藻を菜食する草食動物を介して食物連鎖に入り込む。次いで、これらの魚は、雑食性の魚、そして肉食動物の餌であり、その結果、毒素は食物連鎖に沿って蓄積される。潜在的に感染している４００種のうち、カマス、ウツボ、ハタ、或いは、またアジのような大きな捕食魚が中毒を最も起こし易い。

シガトキシンは低分子量で熱に安定な脂溶性のポリエーテルであり、そしてたった１マイクログラムがヒトを死亡させるのに十分であるため、それらは最も強力な海洋生物毒素に含まれる。

クロマトグラフィの精製及び検出の技術は、３９の異なったシガトキシンが単離されることを可能とする。それらは、地理的な起源（２３の太平洋シガトキシン（Pacific ciguatoxins）又はＰ−ＣＴＸ、１２のカリブ海シガトキシン（Caribbean ciguatoxins）又はＣ−ＣＴＸ、及び４のインド洋シガトキシン（Indian Ocean ciguatoxins）又はＩ−ＣＴＸ）、魚の種類、及び食物連鎖中のそれらの位置に従って変化する。それらの分子構造の全ては解明されてはいない。

シガトキシンは神経毒であり、その電位依存性ナトリウムチャンネルでの作用が中毒で確認される臨床症状の原因となる。ＣＴＸは、通常、ナトリウムチャンネルが閉鎖されるであろう電圧値で、ナトリウムチャンネルの開放を維持することにより作用し、活動電位の自然で反復的な発現をもたらす。ナトリウムチャンネルの開放は細胞内へのナトリウムイオンの大量流入の原因となり、膨潤を引き起こし、この現象はランビエ絞輪及び軸索終末で特に可視的である。

その結果、神経症の症状は運動及び知覚神経と、神経筋接合部との両方における毒素のこの作用により生じる。心臓及び消化器の病気の症状は、交感及び副交感神経系におけるシガトキシンの作用にも依存する。

「シガトキシン」は、特に、太平洋シガトキシン又はタイプ１（Murataら 1989. J. Am. Chem. Soc. 111: 8929-31）：
及びタイプ２（Satakeら 1993. Tetrahedron Letter. 34: 1975-78）：

のＰ−ＣＴＸ−１〜２３、カリブ海シガトキシン又はＣ−ＣＴＸ−１〜１２（Lewisら 1998. J. Am. Chem. Soc. 120: 5914-20）：

及びインド洋シガトキシン又はＩ−ＣＴＸ−１〜４（Hamiltonら 2002. Toxicon 40: 685-93）を指す。

現時点ではシガテラのための治療は全くなく、西洋医薬は症状を緩和するための薬剤：胃腸系疾患のための制吐剤及び止痢剤、痒みに対する抗ヒスタミン薬、並びに筋骨格系疾患のための鎮痛剤のみを提供する。

マンニトールはシガテラの治療のために研究され、中毒後４８〜７２時間に投与されると、マンニトールは神経及び筋肉の疾患を緩和することができると記載されている(Palafoxら, 1988, JAMA 259, 2740-2742; Blytheら, 1994, Mem. Queensl. Mus. 34, 465-470)。しかしながら、マンニトール及び食塩水で行われた盲検臨床試験は、２４時間後シガテラの症状に対するマンニトールの有益な効果を示さず(Schnorfら 2002, Neurol. 58, 1155-1163)、その結果、その有効性には意見が分かれる。

２つの生成物：
−２つの抗シガトキシン性の(anticiguatoxin)モノクローナル抗体（同時投与はインビトロ及びインビボでのシガトキシンＣ−ＴＸ３Ｃの作用を中和する）（Inoueら; 2009, Toxicon doi: 10.1016/j.toxicon.2009.02.17）
−ブレベトキシンを産生する渦鞭毛虫カレニア・ブレビスから単離されるブレベナール（brevenal）（Bourdelaisら, 2005, J. Nat Prod. 68(1), 2-6）：
が現在、シガテラの治療のために研究されている。

それはシガトキシンにより誘発される神経毒性効果の強力な阻害剤であり、シガテラのための潜在的な治療である（Bourdelaisら, 2004 Molecular Neurobiology, 24(4), 553-563; Matteiら, 2008, cells. PLoS ONE 3(10) 1-9）。しかしながら、この化合物は合成するのが難しく、カレニア・ブレビスの培養物から少量でのみ得られ得る。

伝統的な薬物類は治療薬という点では西洋医薬よりもより豊かであり、太平洋では、植物をベースとする多くの伝統的な治療薬がシガテラを治療するのに使用されている。

ニューカレドニア及びバヌアツで主に行われた民族薬理学的な（ethno-pharmacological）調査は、伝統的な医薬で使用される約１００の植物のリストを作成することを可能とした（Bourdyら, 1992, J. Ethnopharmacology 36, 163-174; Laurentら, 1993, ORSTOM Editions, Paris, pp. 51-116）。ニューカレドニアでは、これらの治療薬の使用は極めて人気があり、住民の大半は医者に掛かるよりもむしろ治療者（healers）に行くことを好む。

これらの治療薬の中でも、モンパノキの葉の煎じ汁は南太平洋の多くの島々（ニューカレドニア、フランス領ポリネシア、バヌアツ、トンガ、ミクロネシア）、そして日本の琉球諸島でさえ幅広く使用されている。ヌメアの住民の中で行われた調査によれば、質問された５００人の４０％より多くが治療としてこの植物を使用する（Amade & Laurent, 1992, eds Gopalakrishnakone P.及びTan C.K., 2, 503-508）。

ポリネシア、ミクロネシア及びメラナシアで幅広く使用され、インド洋にも存在するモンパノキはムラサキ科の沿岸植物である。元々はトウネフォーティア・アルジェンティアＬ．ｆ．（Tournefortia argentea L.f.）と呼ばれ、次いでアルグシア・アルジェンティア（Ｌ．ｆ．）・ハイネ（Argusia argentea (L.f.) Heine）と呼ばれ、最近までこの名前のままであり、分子の研究の後、２００３年にヘリオトロープ（Heliotropium）と呼ばれる前に、トウネフォーティア（Tournefortia）と再命名された。

それは、学名メッサーシュミディア・アルジェンティア（Ｌ．ｆ．）ジョンストン（Messerschmidia argentea (L.f.) Johnston）、Ｔ．アルボレア・ブランコ（T. arborea Blanco）、Ｔ．サルメントサ・センス・クリスチャン・ノン・ラム（T. sarmentosa sensu Christian non Lam）及びＴ．セリセア・カム（Ｔ. sericea Cham）で記載されてもいる。

モンパノキの葉の抽出物のインビボ及びインビトロでの研究は、シガテラの症状を防ぐためのこの植物の有効性を示した。シガトキシンを含むウツボの肝臓で中毒にしたマウスの体重減少試験で評価したときに、モンパノキの葉の抽出物は誘発された体重減少の低下をもたらした（Amade & Laurent, 1992）。この抽出物は太平洋シガトキシンで処理された、摘出されたカエルの軸索に対してもマンニトールと同じ効果を示した。

事実、この抽出物は、シガトキシンによる開放位置でのナトリウムチャンネルのブロッキングより引き起こされる活動電位の自然で反復的な放電を阻害し、そしてその結果起こるナトリウムの再浸入を阻害する。それは、浸透圧の変化に対応する、水の再浸入により引き起こされる有髄軸索のランビエ絞輪の膨潤も阻害する（Benoitら, 2000, Cybium 24, 33-40）。

モンパノキはシガトキシンにより引き起こされるヒト又はカエルの赤血球の膨潤も阻害する（Boydronら, 2001, Rencontres en toxinologie: Explorer, exploiter les toxines et maitriser les organismes producteurs, Editions scientifiques et medicales Elsevier, Paris, pp. 63-6 及び Boydronら, 2002, Rencontres en toxinologie: Toxines et recherches biomedicales, Editions scientifiques et medicales Elsevier, Paris, pp. 101-104）。

次に、ネズミの神経芽細胞腫（ニューロ−２a）を使用して、この植物の葉の抽出物はシガトキシン及びブレベトキシンの細胞傷害性作用に対する保護効果を発揮することが示された（Boydron-Le Garrecら, 2005, Toxicon 46, 625-634）。ブレベトキシンはそれらのポリエーテル構造がシガトキシンに類似する海洋生体毒素のもう１つのクラスに属し、そして電位依存性ナトリウムチャンネルの同じ部位に結合する。

発明者らはシガトキシンの症状を防ぐことができる物質の同定を目的に、モンパノキの調査を行った。

普通に用いられる方法に従って治療薬の調製から出発し（Laurentら, 1993）、２００グラムの黄変した葉を１リットルの水中で３０分間沸騰し、発明者らは生物学的な化学分別によりモンパノキの活性成分を単離した。

生成物の構造解析をプロトン及びカーボンのＮＭＲ並びに質量分析で行い、このことはロスマリン酸の同定に到った。

かくして、本発明は、シガトキシンでの中毒により引き起こされる疾患の予防及び／又は治療での使用のための、一般式（Ｉ）：

（式中、
− Ｒ₁〜Ｒ₁₀は、互いに独立して：
○ 水素原子又はハロゲン原子；
○ Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₆アシル基又はＣ₃−Ｃ₁₀アリール基；
○ 基−Ｏ−Ｚ₁（ここで、Ｚ₁は、水素原子、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₆アシル基、Ｃ₃−Ｃ₁₀アリール基及びグリコシル基を含む群から選択される）；
○ 基−Ｓ−Ｚ₂（ここで、Ｚ₂は、水素原子及びＣ₁−Ｃ₆アルキル基を含む群から選択される）；
○ 基：

（ここで、Ｚ₃及びＺ₄は、互いに独立して、水素原子、酸素原子、窒素原子、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₆アシル基、Ｃ₃−Ｃ₁₀アリール基及びグリコシル基を含む群から選択される）；
○ 基−ＣＯＯＺ₅又は基：

（ここで、Ｚ₅及びＺ₆は、互いに独立して、水素原子及びＣ₁−Ｃ₆アルキル基から選択される）；
○ −ＣＮ官能基を示し（ここで、Ｒ₁〜Ｒ₅又はＲ₆〜Ｒ₁₀から選択される２つの隣接基は、フェニル、ナフチル、フラニル、チオフェニル、ピロリル及びトリアゾリルを含む群から選択される環を一緒に形成することができると理解される）；

− Ｘ₁〜Ｘ₁₂は、互いに独立して、炭素原子又は窒素原子を示し；

− Ｙ₁及びＹ₂は、互いに独立して：
○ 水素原子又はハロゲン原子；
○ Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基又はＣ₃−Ｃ₁₀アリール基、
○ 基−Ｏ−Ｚ’₁（ここで、Ｚ’₁は、水素原子、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₆アシル基及びＣ₃−Ｃ₁₀アリール基を含む群から選択される）；
○ 基：

（ここで、Ｚ’₂及びＺ’₃は、互いに独立して、水素原子、酸素原子、窒素原子、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₆アシル基及びＣ₃−Ｃ₁₀アリール基を含む群から選択される）；
○ 基−ＣＯＯＺ’₄又は基：

（ここで、Ｚ’₄は、水素原子及びＣ₂−Ｃ₆アシル基を含む群から選択され、そしてＺ’₅は、水素原子、Ｃ₂−Ｃ₆アシル基及びＣ₃−Ｃ₁₀アリール基を含む群から選択される）
○ −ＣＮ官能基を示し；

− Ｚは、酸素原子又は鎖−ＮＺ₇−を示し（ここで、Ｚ₇は、水素原子、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基及びＣ₃−Ｃ₁₀アリール基を含む群から選択される）；

− Ｗ₁及びＷ₂は、互いに独立して、
○ 水素原子；
○ −ＮＯ₂、−Ｎ₃又は−ＣＮ官能基；
○ 基−ＣＯＯＺ’’₁又は基：

（ここで、Ｚ’’₁は、水素原子及びＣ₁−Ｃ₆アルキル基を含む群から選択され、そしてＺ’’₂は、水素原子、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基及びＣ₃−Ｃ₁₀アリール基を含む群から選択される）を示す）
の化合物、それらの（Ｒ，Ｓ）エナンチオマー及びそれらの医薬的に許容な塩に関し、

本発明は、シガトキシンでの中毒により引き起こされる疾患の予防及び／又は治療を意図する医薬組成物を製造するための前記で定義したような化合物の使用にも関する。

本発明による一般式（Ｉ）の化合物は、例えば植物抽出物から単離後に特に使用され、それらを化学合成後に単離して得ることもできる。

「ハロゲン原子」は、元素周期表のＶＩＩ族の化学元素、特にフッ素、塩素、臭素及びヨウ素を意味する。

「Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基」は、１〜６の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味する。

「Ｃ₂−Ｃ₆アシル基」は、２〜６の炭素原子を含む、基：
を意味する（ここで、Ｒはｍ個の炭素原子を有するアルキル鎖であり（ここで、ｍは０と４との間である）、そしてＲ’はｎ個の炭素原子を有するアルキル基であり（ここで、ｎは１と５との間であり）、そしてそのようなｍ＋ｎは１と５との間である）。アルキル鎖又は基は、それぞれ直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素の鎖又は基を意味する。

「Ｃ₃−Ｃ₁₀アリール基」は、３〜１０の炭素原子を有する単−又は二環式の芳香族基を意味する。好ましくは、Ｃ₃−Ｃ₁₀アリール基は、ピロール、チオフェン、フラン、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジニル、ピリミジニル、グアニル、ナフチル、キノレイニル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニルの基を含む群から選択される。

「グリコシル基」は、グリコシル、マンノシル、グルクロニル、グルコサミン及びマンノサミンの残基のモノマー又はダイマーを意味する。

好ましくは、一般式（Ｉ）の化合物は：
− Ｘ₁〜Ｘ₁₂は炭素原子を表し；及び／又は
− Ｙ₁及びＹ₂は水素原子を表す
ようなものである。

本発明による好ましい一般式（Ｉ）の化合物はロスマリン酸である。

ロスマリン酸（（Ｒ）−ａ−［［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−オキソ−２Ｅ−プロペニル］オキシ］−３，４−ジヒドロキシベンゼンプロパン酸、分子量３６０、及び実験式Ｃ₁₈Ｈ₁₆Ｏ₈）は構造：
のポリフェニール化合物である。

ロスマリン酸の化学的な合成はジンスマイスターにより記載された（Zinsmeister H.D.ら, 1991, Angew. Chem.103, 134-151）。

ロスマリン酸を植物細胞の培養のバイオテクノロジー法により製造もでき（Hippolyteら, 1992, 1. Plant Cell Rep.11, 109-112）、或いは植物から単離もできる（Luら, 1999. Phytochemistry 51, 91-94; Zgorkaら 2001. J. Pharmaceut. Biomed. 26, 79-87）。

この化合物は興味深い生物学的な活性：抗ウイルス性、抗菌性、抗炎症性及び抗酸化性を有することが知られ（Petersenら, 2003, Phytochemistry 62, 121-125）、それは食品及び化粧品の産業で一般に使用されている。しかしながら、シガテラのような食中毒に対して有益な効果を有するようであるとは全く記載されていなかった。

一般式（Ｉ）の化合物を、シー−ヒョン パークらにより記載されているようなカルボン酸単位とアルコール／アミン単位との間のペプチド型のカップリング（エステル及びアミドの類似物の製造）により合成することができる（Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2003, 12 (20), 3455-3459）。

シガトキシンでの中毒により引き起こされる疾患にはいくつかの種類がある。

− 消化器系疾患
これらは最初に現れ、それらは分離され得るか、或いは神経性の徴候（nervous signs）に関連することもある。最も頻繁に現れる症状は、腹部全体の痛み、吐き気及び嘔吐、並びに下痢、最も頻繁には水様性下痢である。しぶり及びしゃっくりのようなその他の症状も起こり得る。

− 中枢並びに／若しくは末梢神経系の疾患
それらは数日、或いはたった数時間で現れ、徴候は長期に亘って持続することもある（数週間、ときには数ヶ月）。それらは神経系全体に影響することもある。

中枢神経系により具体的に関連する神経学的な徴候は、小脳症候群（小脳性運動失調が調整及びバランスの問題と共に確認されることもある）、中枢神経系の疾患、慢性疲労（無力症、無気力、悪夢を伴う睡眠障害、早朝の起床、運動不耐性、モチベーションの欠如、様々な痛み等）、頭痛、めまい（vertigo）、眩暈感（dizziness）、幻視又は幻聴を含む。

末梢神経系に影響を及ぼすものは、最も頻繁には、特に四肢や顔（口の周囲、唇、舌、咽頭）で確認される知覚異常（刺痛、しびれ、蟻走感）、異常感覚を含み、前記異常感覚は頻繁でもあり、そしてシガテラの最も暗示的な徴候（患者は燃えるような感覚又は冷たいものに接した際の放電を訴える）の１つとしてもみなされ、我々は運動失調と言うこともある。

神経学的な疾患に関連するその他の徴候：嚥下障害、痙攣、意識障害、昏睡、呼吸機能の麻痺が確認されることもある。

− 心臓血管系疾患
これらは中毒の最も深刻な側面と通常みなされる。存在するとき、それらは早期に発生するものの、それらは稀に１週間より長く継続する。次のこと：６０／分以下の洞性徐脈、動脈性低血圧、４週間まで持続することもある起立性低血圧が最も頻繁に確認される。

− 筋骨格系疾患
これらのうち、我々は筋肉痛、（特に、大きな関節、特に膝、足首、肩及び肘の）関節痛を挙げることができる。

− 皮膚系疾患
ニューカレドニアの疾患にその名称：ラ・グラット（「引っ掻くこと」）が与えられる程、痒みはシガテラの主な症状の１つである。手のひら及び足の裏が最も頻繁に影響を受ける。特に、アルコールの摂取後、或いは激しい肉体的な運動の後、即ち、皮膚の血流が増加したときに、痒みはときには全身化され得る。痒みは極めて深刻なものとなり得り、合併症の範囲：表皮剥離、膿瘍、蜂巣炎、瘢痕化、苔癬化を伴う、引っ掻きからの外傷を引き起こすことがある。

皮膚発疹：非限定的な丘疹紅斑性の発疹性外傷のようなその他の皮膚疾患が、ときには治癒期間に落屑と共に確認されるであろう。

従って、本発明による化合物及び／又は医薬組成物は、腹部全体の痛み、及び／又は、吐き気並びに嘔吐、及び／又は下痢、及び／又は小脳症候群、及び／又は慢性疲労、及び／又は頭痛、及び／又はめまい、及び／又は眩暈感、及び／又は、幻視若しくは幻聴、及び／又は知覚障害、及び／又は異常感覚、及び／又は嚥下障害、及び／又は痙攣、及び／又は意識障害、及び／又は昏睡、及び／又は呼吸機能の麻痺、及び／又は６０／分以下の洞性徐脈、及び／又は動脈性低血圧、及び／又は起立性低血圧、及び／又は筋肉痛、及び／又は関節痛、及び／又は痒み、及び／又は皮膚発疹を治療するためにより具体的に意図される。

哺乳類に投与される一般式（Ｉ）の化合物、及び特にロスマリン酸の量は、吸収されたシガトキシンの量及び、それが吸収された経路から特に生じる、治療される疾患の深刻さ及び症状の深刻さに特に依存し、最終的には、それは治療を受ける個人の年齢及び体重に依存する。ロスマリン酸は低い毒性のため、それを高濃度で投与することができる。非限定的な例として、ロスマリン酸又はその誘導体の１日の投与量は、１〜３の分割投与で摂取して、０．１ｍｇと１ｇとの間、好ましくは５ｍｇと５００ｍｇとの間である。

一般式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を、経口、非経口、肺、眼、鼻の経路等による投与に適合することができる。

次の補足の図面だけでなく以下の残りの記載から本発明をより理解することができる（前記記載は、モンパノキの活性成分としてロスマリン酸の単離及び特徴付けの例、及びシガトキシンの効果に対するその活性の評価に関する）。

図１は、有毒なミル貝（ＧＰＳ５９）のサンプル１００μｇ／ｍｌ中に含まれるシガトキシンの存在下での、（１０〜１０００μｇ／ｍＬの範囲の）ロスマリン酸を含むか、或いは含まない、神経芽細胞腫の細胞生存率を示すグラフである。 図２は、ラットの脳膜の調製物のナトリウムチャンネルにおける、放射リガンド（［³Ｈ］ＰｂＴｘ−３）とロスマリン酸との間の競争の曲線である。 この曲線はロスマリン酸による作用部位からの標識化したブレベトキシン［³Ｈ］ＰｂＴｘ−３の置き換えを示す。

しかしながら、明白に、これらの実施例は本発明の課題を示すために純粋に与えられ、全くそれらの限定を構成しない。

Ｉ−生成物の単離
モンパノキの活性成分を生物学的な化学分別により単離した。

モンパノキの黄変した葉を、ニューカレドニアの沿岸地域（アンスヴァタ、ヌメア）の木の根元で回収した。治療薬を普通に用いられる方法に従って製造する（Laurentら, 1993）。手短には、２００ｇの黄変した葉を１リットルの水中で３０分間沸騰する。次いで、溶液（約７５０ｍＬ）を濾過し、凍結乾燥して、７．９３４ｇの粗抽出物を得る。

次いで、７．８ｇを水に再度溶解させ、ｎ−ブタノールで分配する。５００ｍｇのブタノール相をシリカカラムのクロマトグラフに付し、極性を増加させつつジクロロメタンとメタノールとの６つの混合液で溶出させる。活性成分（約３６０ｍｇ）をＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨで主に溶出する（９０％）。

ＩＩ−生成物の分析
生成物の構造分析を、ブルカーＡＲＸ４００分光器を使用してプロトン及びカーボンＮＭＲにより行う。マススペクトルを、エレクトロスプレイを備えたパーキンエルマーＡＰＩサイエックス三連四重極分光光度計で得る。

マススペクトル及びＮＭＲデータを、対照化合物のもの及び文献のものと比較して化合物をロスマリン酸であると同定した。

ＩＩＩ−ロスマリン酸の毒性
マウスの静脈に（ｉ．ｖ．）５３１ｍｇ／ｋｇで溶液を注射後、ロスマリン酸のＬＤ５０を測定した（フィッシュ シグマ−アルドリッチ、ペターセンより得た値、２００３）。参考文献: Parnham, M.J., Kesselring, K., 1985. Rosmarinic acid. Drugs of the Future 10, 756-757。

これらの結果から、この濃度でロスマリン酸が毒性を示さないことは明らかである。

ＩＶ−ロスマリン酸の活性
ＩＶ．１．神経芽腫細胞の培養での有毒なドジョウ又は有毒なミル貝の抽出物により引き起こされる細胞毒性の阻害
ルイ・マラルデ研究所より供給されるサーモンピンク色のドジョウのサンプル（Ｒｅｆ１５）はムルロア（ツアモツ諸島、フランス領ポリネシア）で採取された。ミル貝のサンプル（ＧＰＳ５９）はレイヴァヴァエ（オーストラル諸島、フランス領ポリネシア）で採取された。これらの２つのサンプルの毒性を、神経芽細胞腫での細胞毒性のアッセイ及びＰ−ＣＴＸ−３での放射リガンドのアッセイによりマウスで前もって確認した。

サンプルを４℃で保存する。ロスマリン酸をシグマから得た。

９６ウェルのプレートを、ウェル当たり１００μＬの培地中に５００００の細胞で調製する。エッジ効果による応答の変動を回避するために、外側のウェルを使用しない。細胞を２４時間、３７℃で、５％のＣＯ₂と共にインキュベートし、それらに接着するための時間を与える。

以下でＯ／Ｖと示される、ウアバイン（細胞透過性に関与し、Ｎａ／Ｋポンプを阻害する強心配糖体）とベラトリジン（ナトリウムチャンネルの持続的な活性化を引き起こす多環式アルカロイド）との混合物をウェルに加える（２つの活性物質はそれぞれ、２０μｌ中に０．３３ｍＭ及び０．０３３ｍＭの最終濃度で存在する）。

ウアバインはアデノシントリフォスファターゼ（ATPase）Ｎａ⁺／Ｋ⁺の阻害剤であり、ベラトリジンはナトリウムチャンネルの活性化剤である。これらの２つの物質の組み合わさった作用はナトリウムの細胞内での濃度の上昇を誘発し、細胞の形態の変化をもたらし、前記変化はそれらの生存率を大きく低下させる。これらの２つの化合物による、ナトリウムチャンネルに作用する毒素への感作の誘発は、毒素の細胞毒性を可視化することを可能とする。

次いで、倍地中に、所望の濃度（２５０、１２５及び１００μｇ／ｍｌのウェル当たりの最終濃度）で、前もって溶解させたドジョウ（ＬＳＴ）又はミル貝（ＧＳＰ）の抽出物を加え、そして最後にロスマリン酸を様々な濃度（１０と１０００μｇ／ｍｌの間のウェル当たりの最終濃度）で加える。各ウェルを２００μｌの最終容量に培地で作り上げる。

全てのプレートは培地の標準対照（細胞のみ）と、Ｏ／Ｖの混合物の存在する細胞を含む対照とを有する。細胞毒性又は細胞増殖の効果だけでなく、分光光度計の読み取りにおいて偽陽性を導くこともできる、高濃度の物質による彩色のあらゆる干渉も記録するために、ロスマリン酸をＯ／Ｖ混合物でのみ試験する。

それぞれのサンプルを、ロスマリン酸を含むか、或いは含まずに、Ｏ／Ｖ混合物を常に存在させて、３度（in triplicate）試験を行う。

かくして、細胞を３７℃、５％のＣＯ₂で１８時間インキュベートする。

インキュベート後、培地をウェルから除去し、メチルチアゾリルジフェニル−テトラゾリウム（ＭＴＴ）ブロマイドでアッセイをするために、プレートを吸収紙上で乾燥させるために放置する。

ＭＴＴアッセイは、テトラゾリウムの黄色塩を、ＰＢＳ中で不溶なホルマザン結晶に変換するための、生存細胞の酵素（ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼ）の能力をベースとする。０．８ｍｇ／ｍｌのＭＴＴの溶液をＰＢＳ（リン酸塩で緩衝化させた食塩水）中で調製し、５０μｌのこの溶液を各ウェルに加える。

１．５時間のインキュベートの後、形成したホルマザンの結晶を各ウェルについて１５０μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）で溶解させる。均一化の後、プレートを、ＵＶプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで読み取る。次いで、データを移動させ、エクセル（商標）を使用して処理し、そしてグラフパッドプリズム（商標）ソフトウエア（バージョン４）を用いて分析する。

図１内のグラフは、異なった濃度で（１０〜１０００μｇ／ｍｌ）、ロスマリン酸を含むか、或いは含まずに、有毒なミル貝（ＧＰＳ５９）の抽出物１００μｇ／ｍｌの細胞生存率により測定された毒性を示す。このグラフはロスマリン酸の保護効果を明白に示し、この化合物の効果は５０μｇ／ｍｌから出発して細胞生存率を顕著に増加させる。類似の結果が有毒なサーモンピンク色のドジョウの抽出物で確認された。

これらの結果に基づいて、ロスマリン酸のＩＣ５０（シガトキシン及び関連する毒素により引き起こされる細胞の死亡率を５０％低下させるためのロスマリン酸の濃度）が０．５と１ｍｇ／ｍｌとの間であると見積ることができる。

ＩＶ．２．作用部位（電位依存性ナトリウムチャンネル）からの標識化したブレベトキシン［ ³ Ｈ］ＰｂＴｘ−３の置換
ラットの脳のシナプトソームを、デクラオウイ（Decraoui）らにより、前記したようにして調整する（1999, Toxicon. 37(1):125-43）。シナプトソームの調製物の蛋白質濃度を、標準として牛の血清アルブミンを用いるブラッドフォードの方法により２度（in duplicate）測定する（Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254）。

最終の蛋白質濃度は約１２０μｇ／ｍｌである。

トリチウム化したブレベトキシン［³Ｈ］ＰｂＴｘ−３と一緒にこれらの調製物をインキュベートした後、全放射能の最大１０％が確認される。

リガンド−受容体の相互作用の判定のための試験を、試験管中、１．１ｎＭのトリチウム化したブレベトキシン［³Ｈ］ＰｂＴｘ−３の最終濃度で、ダリウスらの手順に従って行う（Dariusら, 2007 Toxicon 50(5), 612-626）。放射能を、パーキンエルマー・マイクロベータ・トリルックス１４５０・シンチレーションカウンターを使用して、ベータプレート・シンチレーション・リキッド（パーキンエルマー）の２ｍｌのフラスコを計測することで測定する。

非特異的な相互作用を［³Ｈ］ＰｂＴｘ−３の飽和濃度（０．６７ｍＭ）下で放射能を測定することにより評価し、そして相互作用の合計より差し引くことで、特定の相互作用を得る。

（ガンビエルディスカス・ポリネシアンシス（Gambierdiscus polynesiensis）のクローン培養液から得られる）シガトキシンＰ−ＣＴＸ−３Ｃは、ブレベトキシンより作用部位でよりよい親和性を示すことが知られ、それをサンプルの校正のための内部標準として使用した（Chinainら, 1999; Dariusら, 2007）。

放射リガンドの実験の品質管理用の２つの試験管を各実験について使用し、それらは３．１ｐｇに相当するシガトキシンＰ−ＣＴＸ−３Ｃの公知の濃度を有するガンビエルディスカス・ポリネシアンシスの有毒な抽出物から構成される。

８つの希釈液を、２度、５及び２０ｍｇ／ｍｌの２つのロスマリン酸の濃度を使用して試験した。

Ｓ字状の曲線及びＩＣ₅₀の値を、グラフパッドプリズムｖ４．０ソフトウエアを使用して得る。ＩＣ₅₀は、［³Ｈ］ＰｂＴｘ−３との相互作用の５０％阻害を生じさせることができる抽出物の濃度として定義され、それは（ｍｇ当量）／（抽出物のｍｌ）として表現される。

図２は、ラットの脳膜の調整物のナトリウムチャンネルについての、放射リガンド（［³Ｈ］ＰｂＴｘ−３）とロスマリン酸との間の競争の曲線を示す。５及び２０ｍｇ／ｍｌのロスマリン酸の存在下、我々は、ロスマリン酸によるナトリウムチャンネル上でのトリチウム化したブレベトキシンの置換を示す、測定された放射能の低下を見出す。その結果、ＩＣ５０の値：０．８８ｍｇ／ｍｌを算出することができ、そしてＫｉの値は１．４３×１０^-3Ｍである。

Ｖ−伝統的な治療薬を用いる治療の間にヒトにより摂取される活性成分量の試算
ロスマリン酸の濃度を、１．２ｍｇ／ｇのモンパノキの新鮮な葉、即ち、約１０グラムの葉については、約１２ｍｇのロスマリン酸、及び４〜５の葉からの煎出をベースとする治療薬については、約５０ｍｇの前記化合物と推定する。

伝統的な治療薬の薬量学は極めて変化し易いため、この値はほんの指標であり、さらに、治療薬中の活性物質の含量は、沿岸又は内陸のいずれかの植物が使用されることに依存して変化もし得る。

Claims (6)

1. ロスマリン酸またはその医薬的に許容な塩を含む、シガトキシンでの中毒により引き起こされる疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物。
2. シガトキシンが、太平洋シガトキシン又はＰ−ＣＴＸ−１〜２３、カリブ海シガトキシン又はＣ−ＣＴＸ−１〜１２、及びインド洋シガトキシン又はＩ−ＣＴＸ−１〜４から選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記シガトキシンでの中毒により引き起こされる疾患が、消化器系疾患、及び／又は、中枢並びに／若しくは末梢神経系の疾患、及び／又は心臓血管系疾患、及び／又は筋骨格系疾患、及び／又は皮膚系疾患であることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記疾患が、腹部全体の痛み、及び／又は、吐き気並びに嘔吐、及び／又は下痢、及び／又は小脳症候群、及び／又は慢性疲労、及び／又は頭痛、及び／又はめまい、及び／又は眩暈感、及び／又は、幻視若しくは幻聴、及び／又は知覚障害、及び／又は異常感覚、及び／又は嚥下障害、及び／又は痙攣、及び／又は意識障害、及び／又は昏睡、及び／又は呼吸機能の麻痺、及び／又は６０／分以下の洞性徐脈、及び／又は動脈性低血圧、及び／又は起立性低血圧、及び／又は筋肉痛、及び／又は関節痛、及び／又は痒み、及び／又は皮膚発疹であることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
5. １日の投与量が１〜３回の分割投与で、０．１ｍｇと１ｇとの間であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
6. 経口、非経口、肺、眼又は鼻の経路による投与に好適であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の医薬組成物。