CN115739050A - 一种交联琼脂糖微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种交联琼脂糖微球的制备方法，该方法以短链烷烃二卤代物、短链二酸以及环酸酐类物质为交联剂，先交联后乳化成球，大幅度提高了交联琼脂糖微球的制备效率。该交联剂具有高反应活性基团并且两端均可与琼脂糖分子上的羟基发生反应，同时可在较高温度即60～90℃下进行交联反应，使交联周期大幅度缩短。该制备方法制备得的微球粒径分布稳定，流速可达到800～900cm/h，适用于各类蛋白质、酶以及多肽的分离纯化，具有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种交联琼脂糖微球的制备方法。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，人们对健康生活的渴求也愈来愈迫切，目前生物大健康行业已经成为了全球瞩目的热点。生物药分子是蛋白质，这些蛋白质分子的分离纯化在生物药的整个生产过程中极为重要。层析分离技术具有分离效率高、条件温和、适用性广、过程易于放大以及易于自动化的特点，在广大蛋白质分离技术中脱颖而出。传质问题是层析分离技术所面临的关键问题之一，为了满足对生物制品日益增长的需求，研究和开发新的分离介质是其中一条重要途径。
琼脂糖提取于海洋藻类生物，制备层析介质时往往制成微球使用。作为最主要的天然多糖分离介质，琼脂糖具有良好的亲水性和生物相容性，这使得蛋白质分离纯化过程中大大降低了蛋白质的结构破坏。同时琼脂糖在30～40℃为凝胶态，凝胶态的琼脂糖内部呈空间网状结构，孔径分布在10～50nm，绝大多数蛋白质可以通过。另外，琼脂糖分子上有着数目众多的羟基，可与带有羧基、卤素、环氧基以及氨基等基团的活性物质反应，从而衍生出具有不同功能的层析介质，大大拓展了琼脂糖的使用范围。因此，琼脂糖的理化性质表明其是一种良好的生物层析填料。
琼脂糖的凝胶态是由其分子间氢键导致的，破坏分子间氢键将导致其凝胶化消失。由于氢键强度较弱，未经交联的琼脂糖微球在较高的压力下会发生形变，从而导致流速降低，影响分离速度和分离性能。因此，琼脂糖微球往往需要通过交联剂进行交联后通过共价键结合，从而使其机械性能和化学稳定性大大地提高。
目前琼脂糖微球产品大多都是先制备成微球，再经过交联反应得到最终的产品。微球形成后，大部分交联剂只能停留在微球表面发生反应，很难扩散至微球内部，反应困难且反应速率缓慢。
公开号为CN102989400A的专利报道了一种琼脂糖4B微球的交联方法。该方法以琼脂糖4B微球为材料，以季戊四醇缩水甘油醚和环氧氯丙烷为交联剂通过两步交联制备得微球。但该方法的交联反应需进行12h，得到的微球流速仅为400cm/h左右。
公开号为CN105713212A的专利也报道了一种琼脂糖交联凝胶微球的制备方法，该制备方法以琼脂糖溶液为水相，甲苯为油相，采用环氧氯丙烷对琼脂糖微球的形成过程进行交联，制备得琼脂糖凝胶微球。该方法的乳化过程和交联过程一步进行，提供了一种方便简洁的交联琼脂糖凝胶微球的制备方法，但是实际上在乳化过程中直接进行交联制备凝胶微球的可行性较低。
可见，研发一种制作周期短、微球流通性能良好的交联琼脂糖微球的制备方法具有重大意义。
发明内容
针对目前本领域存在的瓶颈问题，本发明提供了一种交联琼脂糖微球的制备方法，该制备方法以短链烷烃二卤代物、短链二酸以及环酸酐类物质为交联剂，先交联后乳化成球，大幅度提高了交联琼脂糖微球的制备效率，同时，制备得的微球粒径均一、流通性能良好，具有良好的应用价值。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种交联琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)水相制备：
将琼脂糖溶解于去离子水中，加热、搅拌直至琼脂糖溶液澄清透明；
(2)琼脂糖改性：
将步骤(1)所得的琼脂糖溶液中加入改性剂，于60～90℃下反应1～4h，将反应后所得的溶液烘干得到的粉末，多次洗涤并烘干，得到改性后的琼脂糖粉末；
所述改性剂为短链烷烃二卤代物、短链二酸以及环酸酐类物质中的一种；所述的短链烷烃二卤代物的烷烃链碳原子数为2～6个，所述短链二酸的烷烃链碳原子数为2～6个，所述环酸酐类物质为马来酸酐和戊二酸酐中的一种；
(3)粘度控制：
将步骤(2)所得的琼脂糖粉末溶解于去离子水中，加热、搅拌直至溶液澄清透明，缓慢降低溶液的温度，当琼脂糖溶液的粘度为100～400cP时，保温并进入下一步骤；
(4)乳化成球：
将步骤(3)所得的琼脂糖溶液添加至含乳化剂的油相中，于70～90℃乳化，当90％以上的微球粒径在50～180μm时停止乳化，立即降温并析出固体微球，分离油相，多次洗涤，得到所述交联琼脂糖微球。
本发明提供的制备方法是一种先交联后成球的制备方法，大幅度提高了交联琼脂糖微球的制备效率。相较于传统的先制备微球再交联的制备方法，本发明避免了交联剂难以扩散至微球内部而导致的交联速率缓慢的问题，并主要通过选用特定的高活性交联剂、精确控制改性后琼脂糖溶液的粘度，解决了先交联后成球存在的技术问题。本制备方法制备的琼脂糖凝胶微球粒径分布稳定，主要分布在50～150μm之间，流速可达到800～900cm/h，适用于各类蛋白质、酶以及多肽的分离纯化。
本发明选用了特定的高活性交联剂，包括短链烷烃二卤代物、短链二酸以及环酸酐类物质。首先，相比传统交联剂，本发明中的高活性交联剂的卤素、羧基以及酸酐具有更高的反应活性，并且所述交联剂的两端均可与琼脂糖分子上的羟基发生反应，因此使用该交联剂对琼脂糖溶液进行改性，交联反应的活性更高，可使交联周期大幅度缩短。其次，该交联剂可在较高温度即60～90℃下进行交联反应，该交联剂不会因温度过高而发生水解，进一步提高了交联效率；而传统交联剂则由于存在着高温下极易水解、稳定性差的问题，需要在温度较低的环境下进行交联，而在传统交联剂的交联温度下琼脂糖溶液呈凝胶状，交联困难、交联时间较长。再次，使用该交联剂改性，改性后部分琼脂糖分子间氢键转变为共价键，使得琼脂糖的凝胶强度大大提高，保证了微球的机械强度；并且该交联剂引入的短链烃适当增大了微球孔道网络从而使微球的流通性能加强，同时琼脂糖凝胶的机械强度和稳定性不会下降。
本发明还通过精确控制改性后琼脂糖溶液的粘度、调节乳化成球的乳化温度，从而实现了最终微球粒径的控制。琼脂糖溶液经交联改性后粘度提高，较高的粘度不利于乳化过成球步骤中的微球成型以及微球的粒径控制，而通过升高温度可以降低琼脂糖溶液粘度。为解决上述问题，本发明所提供的制备方法优化了制备工艺并对工艺参数进行了优化，具体体现在：一方面，调节了乳化温度，相比传统乳化温度本发明的乳化温度较高，为70～90℃；另一方面，制备方法中还包括有粘度控制步骤，即本发明先将改性后得到的琼脂糖经洗涤烘干后重新溶解于去离子水中，当粘度在适宜范围内(100～400cP时)再保温进入乳化成球步骤。因此，本发明提供的制备方法能得到粒径适宜(适用于分离纯化)、粒径均一的交联琼脂糖微球。
优选地，所述制备方法的步骤(1)中，所述琼脂糖溶液中琼脂糖的质量分数为3％～10％。进一步优选有，所述琼脂糖溶液中琼脂糖的质量分数为4％～6％。
优选地，所述制备方法的步骤(1)中，所述琼脂糖溶液的加热温度为90～100℃。
优选地，所述制备方法的步骤(2)中，所述改性剂为短链烷烃二卤代物。
优选地，所述制备方法的步骤(2)中，改性反应在pH为9～12时进行，反应结束后调节pH至中性。
优选地，所述制备方法的步骤(2)中，所述改性剂和琼脂糖溶液的质量比为1:10～40。
优选地，所述制备方法的步骤(2)中，所述反应的温度为75～85℃。
优选地，所述制备方法的步骤(3)中，所述琼脂糖溶液中改性后的琼脂糖的质量分数为4％～12％。进一步优选有，所述琼脂糖溶液中改性后的琼脂糖的质量分数为4％～8％。
优选地，所述制备方法的步骤(3)中，所述琼脂糖溶液的加热温度为90～100℃。
优选地，所述制备方法的步骤(3)中，当所述琼脂糖溶液的粘度为150～250cP时，保温并进入下一步骤。
优选地，所述制备方法步骤(3)中所述去离子水与步骤(4)中所述油相的体积比为1:1～6。进一步优选有，步骤(3)中所述去离子水与步骤(4)中所述油相的体积比为1:2～3。
优选地，所述制备方法的步骤(4)中，所述油相为甲苯、液体石蜡、环己烷、橄榄油、蓖麻油中的一种。进一步优选有，所述油相为甲苯。
优选地，所述制备方法的步骤(4)中，所述乳化剂为单一乳化剂或复配乳化剂，所述单一乳化剂包括壬基酚聚氧乙烯醚、聚甘油硬脂酸酯，所述复配乳化剂包括San80和Tween80的混合物。当所述乳化剂为San80和Tween80的混合物时，所述混合物中San80和Tween80体积比为1:0.1～1。
优选地，所述制备方法的步骤(4)中，所述乳化剂的重量为油相重量的1％～6％。
进一步优选地，本发明提供的制备方法中，以壬基酚聚氧乙烯醚为乳化剂，并当壬基酚聚氧乙烯醚的重量为油相重量的3.5％～4.5％时，乳化效果良好。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
1、本发明提供的制备方法先交联后乳化成球，避免了交联剂难以扩散至微球内部而导致的交联速率缓慢的问题，大幅度提高了交联琼脂糖微球的制备效率，同时制备得的微球粒径均一、流通性能良好。
2、本发明提供的制备方法以短链烷烃二卤代物、短链二酸以及环酸酐类物质为交联剂，该交联剂具有高反应活性基团并且两端均可与琼脂糖分子上的羟基发生反应，同时可在较高温度即60～90℃下进行交联反应，使交联周期大幅度缩短。另外，该交联剂通过交联强化了琼脂糖凝胶强度，并且引入的短链烃适当增大了微球孔道网络从而使微球的流通性能加强，同时琼脂糖凝胶的机械强度和稳定性不会下降。
3、本发明提供的制备方法通过精确控制改性后琼脂糖溶液的粘度、调节乳化成球的乳化温度，可得到粒径适宜(适用于分离纯化)、粒径均一的交联琼脂糖微球。
4、本发明提供的制备方法操作简单、成本低廉、容易放大，具有良好的应用价值。
附图说明
图1为实施例1得到的交联琼脂糖微球显微镜物镜4X下的照片；
图2为实施例1得到的交联琼脂糖微球显微镜物镜40X下的照片；
图3为实施例1得到的交联琼脂糖微球的粒径分布图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
以下具体实施方式中所采用的原料均购于市场。除非特殊说明，室温表示为25℃。
实施例1
(1)水相制备：
在100mL三颈烧瓶中加入2.4g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明。
(2)琼脂糖改性：
降温至70℃，加入2g1,3-二溴丙烷和1mL0.1mol/L的NaOH溶液，搅拌速度保持不变，反应2h。向反应体系中加入适量冰醋酸调节pH至中性。将琼脂糖溶液放入烘箱80℃烘干，用无水乙醇和去离子水反复冲洗，重新放入烘箱80℃烘干。
(3)粘度控制：
将烘干后的琼脂糖重新溶于去离子水中，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为200cP时，保温。
(4)乳化成球：
在500mL玻璃反应瓶中加入120mL甲苯，加入壬基酚聚氧乙烯醚-103.6g，升温至80℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至甲苯中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％以上微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层甲苯、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净甲苯，将微球保存在去离子水中。
图1、图2为本实施例得到的交联琼脂糖微球的显微镜照片。图3为本实施例得到的交联琼脂糖微球的粒径分布图。
本实施例采用1,3-二溴丙烷作为琼脂糖改性剂和交联剂，在消除了部分分子间氢键的同时，增加了共价键的连接，从而导致了内部孔道进一步增大，流通性能更优。通过将琼脂糖溶液粘度控制在100～400cP范围内，得到的微球其尺寸几乎分布在45～160μm，平均粒径为96.2μm。在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速为880cm/h。
实施例2
(1)水相制备：
在100mL三颈烧瓶中加入3.6g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明。
(2)琼脂糖改性：
降温至70℃，加入2g丙二酸，搅拌速度保持不变，反应4h。将琼脂糖溶液放入烘箱80℃烘干，用无水乙醇和去离子水反复冲洗，重新放入烘箱80℃烘干。
(3)粘度控制：
将烘干后的琼脂糖重新溶于去离子水中，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为250cP时，保温。
(4)乳化成球：
在500mL玻璃反应瓶中加入180mL液体石蜡，加入六聚甘油五硬脂酸酯5.4g，升温至80℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至液体石蜡中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层液体石蜡、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净液体石蜡，将微球保存在去离子水中。
本实施例采用丙二酸作为琼脂糖改性剂和交联剂，在消除了部分分子间氢键的同时，增加了共价键的连接，从而导致了内部孔道进一步增大，流通性能更优。通过将琼脂糖溶液粘度控制在100～400cP范围内，得到的微球其尺寸几乎分布在45～160μm，平均粒径为103.6μm。在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速为805cm/h。
实施例3
(1)水相制备：
在100mL三颈烧瓶中加入3.0g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明。
(2)琼脂糖改性：
降温至70℃，加入2g马来酸酐和1mL0.1mol/L的NaOH溶液，搅拌速度保持不变，反应2h。向反应体系中加入适量冰醋酸调节pH至中性。将琼脂糖溶液放入烘箱80℃烘干，用无水乙醇和去离子水反复冲洗，重新放入烘箱80℃烘干。
(3)粘度控制：
将烘干后的琼脂糖重新溶于去离子水中，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为224cP时，保温。
(4)乳化成球：
在500mL玻璃反应瓶中加入180mL环己烷，加入3.0gSpan80，0.6gTween80。升温至75℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至环己烷中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层环己烷、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净环己烷，将微球保存在去离子水中。
本实施例采用马来酸酐作为琼脂糖改性剂和交联剂，在消除了部分分子间氢键的同时，增加了共价键的连接，从而导致了内部孔道进一步增大，流通性能更优。通过将琼脂糖溶液粘度控制在100～400cP范围内，得到的微球其尺寸几乎分布在45～160μm，平均粒径为100.2μm。在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速为853cm/h。
实施例4
(1)水相制备：
在100mL三颈烧瓶中加入2.4g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明。
(2)琼脂糖改性：
降温至70℃，加入2g丁二酸，搅拌速度保持不变，反应4h。将琼脂糖溶液放入烘箱80℃烘干，用无水乙醇和去离子水反复冲洗，重新放入烘箱80℃烘干。
(3)粘度控制：
将烘干后的琼脂糖重新溶于去离子水中，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为180cP时，保温。
(4)乳化成球：
在500mL玻璃反应瓶中加入180mL蓖麻油，加入壬基酚聚氧乙烯醚-12 5.4g，升温至80℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至蓖麻油中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层蓖麻油、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净蓖麻油，将微球保存在去离子水中。
本实施例采用丁二酸作为琼脂糖改性剂和交联剂，在消除了部分分子间氢键的同时，增加了共价键的连接，从而导致了内部孔道进一步增大，流通性能更优。通过将琼脂糖溶液粘度控制在100～400cP范围内，得到的微球其尺寸几乎分布在45～160μm，平均粒径为120.4μm。在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速为756cm/h。
实施例5
(1)水相制备：
在100mL三颈烧瓶中加入3.6g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明。
(2)琼脂糖改性：
降温至70℃，加入2g1,4-二氯丁烷和1mL0.1mol/L的NaOH溶液，搅拌速度保持不变，反应2h。向反应体系中加入适量冰醋酸调节pH至中性。将琼脂糖溶液放入烘箱80℃烘干，用无水乙醇和去离子水反复冲洗，重新放入烘箱80℃烘干。
(3)粘度控制
将烘干后的琼脂糖重新溶于去离子水中，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为185cP时，保温。
(4)乳化成球：
在500mL玻璃反应瓶中加入120mL甲苯，加入三聚甘油单硬脂酸酯6.0g，升温至80℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至甲苯中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层甲苯、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净甲苯，将微球保存在去离子水中。
本实施例采用1,4-二氯丁烷作为琼脂糖改性剂和交联剂，在消除了部分分子间氢键的同时，增加了共价键的连接，从而导致了内部孔道进一步增大，流通性能更优。通过将琼脂糖溶液粘度控制在100～400cP范围内，得到的微球其尺寸几乎分布在45～160μm，平均粒径为95.0μm。在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速为918cm/h。
实施例6
(1)水相制备：
在100mL三颈烧瓶中加入2.4g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明。
(2)琼脂糖改性：
降温至70℃，加入2g戊二酸酐和1mL0.1mol/L的NaOH溶液，搅拌速度保持不变，反应2h。向反应体系中加入适量冰醋酸调节pH至中性。将琼脂糖溶液放入烘箱80℃烘干，用无水乙醇和去离子水反复冲洗，重新放入烘箱80℃烘干。
(3)粘度控制：
将烘干后的琼脂糖重新溶于去离子水中，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为240cP时，保温。
(4)乳化成球：
在500mL玻璃反应瓶中加入120mL橄榄油，加入壬基酚聚氧乙烯醚-8 4.8g，升温至80℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至橄榄油中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层橄榄油、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净橄榄油，将微球保存在去离子水中。
本实施例采用戊二酸酐作为琼脂糖改性剂和交联剂，在消除了部分分子间氢键的同时，增加了共价键的连接，从而导致了内部孔道进一步增大，流通性能更优。通过将琼脂糖溶液粘度控制在100～400cP范围内，得到的微球其尺寸几乎分布在45～160μm，平均粒径为116.9μm。在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速为781cm/h。
对比例1
(1)在100mL三颈烧瓶中加入2.4g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直到琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为175cP时，保温。
(2)在500mL玻璃反应瓶中加入120mL甲苯，加入壬基酚聚氧乙烯醚-10 3.6g，升温至65℃，150rpm搅拌。将步骤(1)中保温的琼脂糖溶液转移至甲苯中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层甲苯、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净甲苯，将微球保存在去离子水中。
(4)将步骤(3)得到的微球放入250mL三颈烧瓶中，分散于60mL去离子水中，加入1mL0.1 mol/L NaOH溶液，2g1,3-二溴丙烷，70℃反应20h，反应结束用去离子水洗涤微球。
本对比例采用先成球后交联的制备方法，以1,3-二溴丙烷作为交联剂，相较于先交联后成球的制备方法，交联反应时长由2h增加到20h，在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速仅为207cm/h。
对比例2
(1)在100mL三颈烧瓶中加入2.4g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直到琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为230cP时，保温。
(2)在500mL玻璃反应瓶中加入120mL甲苯，加入壬基酚聚氧乙烯醚-10 3.6g，升温至65℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至甲苯中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层甲苯、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净甲苯，将微球保存在去离子水中。
(4)将步骤(3)得到的微球放入250mL三颈烧瓶中，分散于60mL去离子水中，加入1mL0.1 mol/L NaOH溶液，2g马来酸酐，70℃反应20h，反应结束用去离子水洗涤微球。
本对比例采用先成球后交联的制备方法，以马来酸酐作为交联剂，交联反应时长由2h增加到20h，在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速仅为175cm/h。
对比例3
(1)水相制备：
在100mL三颈烧瓶中加入2.4g琼脂糖粉，60mL去离子水，150rpm搅拌，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明。
(2)琼脂糖改性：
降温至70℃，加入2g环氧氯丙烷和1mL0.1mol/L的NaOH溶液，搅拌速度保持不变，反应2h。向反应体系中加入适量冰醋酸调节pH至中性。将琼脂糖溶液放入烘箱80℃烘干，用无水乙醇和去离子水反复冲洗，重新放入烘箱80℃烘干。
(3)粘度控制：
将烘干后的琼脂糖重新溶于去离子水中，升温至95℃直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降温至琼脂糖溶液粘度为260cP时，保温。
(4)乳化成球：
在500mL玻璃反应瓶中加入120mL甲苯，加入壬基酚聚氧乙烯醚-103.6g，升温至65℃，150rpm搅拌。将步骤(3)中保温的琼脂糖溶液转移至甲苯中，搅拌升至350rpm。乳化约40min，取样至光学显微镜观察，当90％微球粒径达到50～180μm时停止乳化，迅速将反应体系温度降至20℃以下，琼脂糖微球析出。
将得到的乳液转移至1000mL烧杯中，加入300mL去离子水，150rpm室温搅拌10min，静置过夜。用循环水式真空泵抽去上层甲苯、乳化层及部分水，加入300mL去离子水重复上述步骤，共洗涤3遍直至洗净甲苯，将微球保存在去离子水中。
本对比例采用环氧氯丙烷作为改性剂和交联剂，采取了先交联后成球的方法制备微球。发现环氧氯丙烷与琼脂糖溶液反应结束后，琼脂糖溶液粘度几乎无变化，这是因为环氧氯丙烷在70℃下水解剧烈，交联量微乎其微。在层析柱中(1.2cm*20cm)测得最大流速仅为130cm/h。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种交联琼脂糖微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)水相制备：
将琼脂糖溶解于去离子水中，加热、搅拌直至琼脂糖溶液澄清透明；
(2)琼脂糖改性：
将步骤(1)所得的琼脂糖溶液中加入改性剂，于60～90℃下反应1～4h，将反应后所得的溶液烘干得到的粉末，多次洗涤并烘干，得到改性后的琼脂糖；
所述改性剂为短链烷烃二卤代物、短链二酸以及环酸酐类物质中的一种；所述的短链烷烃二卤代物的烷烃链碳原子数为2～6个，所述短链二酸的烷烃链碳原子数为2～6个，所述环酸酐类物质为马来酸酐和戊二酸酐中的一种；
(3)粘度控制：
将步骤(2)所得的改性后的琼脂糖溶解于去离子水中，加热、搅拌直至琼脂糖溶液澄清透明，缓慢降低溶液的温度，当琼脂糖溶液的粘度为100～400cP时，保温并进入下一步骤；
(4)乳化成球：
将步骤(3)所得的琼脂糖溶液添加至含乳化剂的油相中，于70～90℃乳化，当90％以上的微球粒径在50～180μm时停止乳化，立即降温并析出固体微球，分离油相，多次洗涤，得到所述交联琼脂糖微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述改性剂为短链烷烃二卤代物。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，改性反应在pH为9～12时进行，反应结束后调节pH至中性。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述改性剂和琼脂糖溶液的质量比为1:10～40。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述琼脂糖溶液中改性后的琼脂糖的质量分数为4％～12％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述琼脂糖溶液的加热温度为90～100℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，当所述琼脂糖溶液的粘度为150～250cP时，保温并进入下一步骤。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述去离子水与步骤(4)中所述油相的体积比为1:1～6。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述油相为甲苯、液体石蜡、环己烷、橄榄油、蓖麻油中的一种。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述乳化剂为单一乳化剂或复配乳化剂，所述单一乳化剂包括壬基酚聚氧乙烯醚、聚甘油硬脂酸酯，所述复配乳化剂包括San80和Tween80的混合物。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| QIONG XIAO ET AL.: "Preparation of macroporous rigid agarose microspheres by pre-crosslinking with cyclic anhydride", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》, vol. 222, pages 41 - 54 * |
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|---|---|---|---|---|
| CN117169393A (zh) * | 2023-11-03 | 2023-12-05 | 杭州湃肽生化科技有限公司 | 一种植物组织中环肽的检测方法 |
| CN117169393B (zh) * | 2023-11-03 | 2024-03-19 | 杭州湃肽生化科技有限公司 | 一种植物组织中环肽的检测方法 |
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