CN115737709A - 一种生物发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物发酵物及其制备方法和应用，涉及生物发酵技术领域。本发明所述生物发酵物为复合菌剂发酵生物物料，经复合纤维素水解酶酶解过滤得到；所述生物物料包括桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草，所述复合菌剂包括酵母菌液和乳酸菌液。本发明将复合菌剂用于发酵所述生物物料，生物物料为整个发酵体系提供基本营养物质，满足复合菌剂中酵母菌和乳酸菌的生长；发酵过程中产生的各种酶产物又作用于生物物料，促进胞浆活性成分溶出同时产生丰富的次级代谢产物。本发明生物发酵物安全环保，且具有突出的抗炎和抗氧化功效。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种生物发酵物及其制备方法和应用。
背景技术
面部皮炎是发生在面部的皮炎湿疹情况，表现为面部的红斑、丘疹、水泡、脓疱，此类表现严重的病例后期可以出现结痂、脱皮、肥厚。紫外线、病菌、外界环境刺激或接触敏感源等都有可能引起皮肤炎症。
目前，防治面部炎症一般外用糖皮质类激素药物、四环素类药物、非甾体类抗炎药。但是上述药物使用存在非常大的安全风险，并且会产生副作用，须在医生专业的指导下使用，不适合日常皮肤的保养和护肤。因此，亟需开发出防治皮肤炎症的效果更佳，且副作用少的替代产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物发酵物及其制备方法和应用，所述生物发酵物具有抗炎、抗氧化的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种生物发酵物，所述生物发酵物为复合菌剂发酵生物物料，经复合纤维素水解酶酶解过滤得到；所述生物物料包括桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草，所述复合菌剂包括酵母菌液和乳酸菌液。
优选的，所述桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草的重量比为(50～70):(5～15):(5～20):(5～20):(3～8):(3～8)。
优选的，所述酵母菌为扣囊复膜酵母菌，所述乳酸菌为粪肠球菌。
优选的，所述酵母菌液的制备方法包括：将所述扣囊复膜酵母菌株接种于YPD液体培养基，于28～32℃、150～200r/min条件下活化15～25h，活化1～3次；所述乳酸菌液的制备方法包括：将粪肠球菌株接种于MRS液体培养基，于35～40℃活化15～25h，活化1～3次。
优选的，所述酵母菌液和乳酸菌液的重量比为1:2～2:1。
本发明还提供了上述生物发酵物的制备方法，包括：将复合菌剂接种于生物物料中进行发酵，然后加入复合纤维素水解酶酶解，过滤，得到的滤液为所述生物发酵物。
优选的，所述复合菌剂的接种量为5～15％，所述发酵的温度为28～32℃，时间为40～50h。
优选的，所述复合纤维素水解酶为发酵后物料重量的1～3％，所述酶解的温度为48～52℃，时间为1.5～2.5h。
本发明还提供了上述生物发酵物或上述制备方法得到的生物发酵物在制备抗炎产品中的应用。
本发明还提供了上述生物发酵物或上述制备方法得到的生物发酵物在制备抗氧化产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明所述生物发酵物为复合菌剂发酵生物物料，经复合纤维素水解酶酶解过滤得到；所述生物物料包括桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草，所述复合菌剂包括酵母菌液和乳酸菌液。本发明将复合菌剂用于发酵所述生物物料，生物物料为整个发酵体系提供基本营养物质，满足复合菌剂中酵母菌和乳酸菌的生长；发酵过程中产生的各种酶产物又作用于生物物料，促进胞浆活性成分溶出同时产生丰富的次级代谢产物，使得到的生物发酵物具有抗炎、抗氧化的效果。
附图说明
图1为实验例1中不同处理对COX-2的抑制率；
图2为实验例2中不同浓度生物发酵物对ABTS自由基的抑制率；
图3为实验例3中不同浓度生物发酵物对DPPH自由基的抑制率。
具体实施方式
本发明提供了一种生物发酵物，所述生物发酵物为复合菌剂发酵生物物料，经复合纤维素水解酶酶解过滤得到；所述生物物料包括桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草，所述复合菌剂包括酵母菌液和乳酸菌液。
在本发明中，所述桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草的重量比优选为(50～70):(5～15):(5～20):(5～20):(3～8):(3～8)，更优选为60:10:10:10:5:5。
本发明所述桦褐孔菌富含的多酚化合物具有良好的抗氧化功能，能清除自由基且可与其他抗氧化物质协同发挥作用；除此之外，还具有抗菌消炎的作用，能减缓皮肤问题如痤疮、炎症等，改善皮肤健康。
本发明所述茯苓含多糖、三萜、甾醇、挥发油、蛋白质、氨基酸、核苷酸及微量元素等多种化学成分，茯苓具有良好的抗氧化和抗炎作用，其中的三萜类成分茯苓酸可通过抑制促炎症因子、调节酶、蛋白质和相关信号通路实现抗炎和抗氧化作用。
本发明所述厚朴是我国重要的药、材两用经济树种，其根皮、树皮、枝皮、花、果实及种子均可入药，其主要有效成分是厚朴酚类物质。厚朴酚类物质具有较强的抗菌作用，抗炎作用与抗氧化作用。
本发明所述虎杖根含有丰富的白藜芦醇、大黄素、大黄酚等活性成分，其表现出广泛的抗氧化特性，如LDL胆固醇氧化和脂质过氧化反应。对弹性蛋白酶的抑制作用，结合其抗氧化特性，可延缓衰老；其对B16黑色素细胞的活性有很好的抑制作用，可减少皮肤中黑色素含量；除此之外还具有抗炎和抗菌作用。
本发明所述积雪草叶中的主要活性成分有积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸。积雪草苷可以刺激成纤维细胞增殖并激活SMAD信号传导途径，增加I型胶原蛋白的产生，从而具有愈合伤口的活性。积雪草叶能促进成纤维细胞的增殖，增加胶原蛋白的合成，降低金属蛋白酶的活性；可以抑制LPS诱导的炎症反应，有效降低炎性细胞因子的释放，可作为抗炎抗过敏成分，缓解面部痤疮、发红、过敏等症状。
本发明所述甘草含有三大类活性成分，黄酮类(甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草查尔酮A、光甘草定等)，三萜类(甘草酸、甘草次酸等)，以及多糖类。甘草具有美白、抗炎、吸收紫外线作用，甘草主要是通过抑制酪氨酸酶和多巴色素互变酶的活性以此来阻止黑色素的形成，从而达到美白皮肤的效果。
混菌发酵相对于单菌发酵而言，代谢机制更加复杂，若混菌中各菌种搭配不当，会发生拮抗现象，影响发酵效果。因此，采用复合菌发酵时选择合适的菌株至关重要。在本发明中，所述酵母菌优选为扣囊复膜酵母菌，更优选为扣囊复膜酵母ATCC24945，所述乳酸菌优选为粪肠球菌更优选为粪肠球菌ATCC29212。
本发明所述粪肠球菌与扣囊复膜酵母菌发酵具有协同效果，粪肠球菌与扣囊复膜酵母菌的代谢产物之间存在互补机制，扣囊复膜酵母菌为粪肠球菌提供营养因子，粪肠球菌为扣囊复膜酵母菌提供能量来源；扣囊复膜酵母菌代谢产生的大分子物质能诱导粪肠球菌中氨基肽酶的合成，使氨基酸及小分子缩氨酸含量增加，促进粪肠球菌的生长，并且能增加粪肠球菌的葡萄糖水解酶及肽酶的活性，使培养基的营养丰富，间接地促进粪肠球菌的生长；扣囊复膜酵母菌产生的蛋白酶能够作用于植物原料的蛋白质组分使之自溶，大分子水解成小分子肽，均能促进粪肠球菌的生长。
本发明将复合菌剂用于发酵所述生物物料，生物物料为整个发酵体系提供基本营养物质，满足复合菌剂中粪肠球菌与扣囊复膜酵母菌的生长；发酵过程中产生的各种酶产物又作用于生物物料，促进胞浆活性成分溶出同时产生丰富的次级代谢产物，使得到的生物发酵产物具有抗炎、抗氧化的效果。
在本发明中，所述酵母菌液的制备方法优选包括：将所述扣囊复膜酵母菌株接种于YPD液体培养基，优选于28～32℃、150～200r/min条件下活化15～25h，活化1～3次，更优选于30℃、180r/min条件下活化20h，活化2次；所述扣囊复膜酵母菌株的接种量优选为5～15％，更优选为10％。所述乳酸菌液的制备方法优选包括：将粪肠球菌株接种于MRS液体培养基，优选于35～40℃活化15～25h，活化1～3次，更优选于37℃活化20h，活化2次；所述粪肠球菌株的接种量优选为2～18％，更优选为5％；所述发酵优选为静置发酵。
在本发明中，所述酵母菌液和乳酸菌液的重量比优选为1:2～2:1，更优选为1:1。本发明对所述复合菌剂的制备方法没有特殊限定，作为一种可实施的方式，将所述酵母菌菌液和乳酸菌菌液混合即可。
本发明还提供了上述生物发酵物的制备方法，包括：将复合菌剂接种于生物物料中进行发酵，然后加入复合纤维素水解酶酶解，过滤，得到的滤液为所述生物发酵物。
在本发明中，所述复合菌剂的接种量优选为5～15％，更优选为10％，所述发酵的温度优选为28～32℃，更优选为30℃，时间优选为40～50h，更优选为48h；所述发酵优选为摇床发酵。
在本发明中，所述复合纤维素水解酶优选包括植物水解酶和蛋白酶；所述植物水解酶和蛋白酶的质量比优选为4:1；所述复合纤维素水解酶优选为发酵后物料重量的1～3％，更优选为2％，所述酶解的温度优选为48～52℃，更优选为50℃，时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。
本发明还提供了上述生物发酵物或上述制备方法得到的生物发酵物在制备抗炎产品中的应用。本发明所述生物发酵物在1％、2％、5％浓度下，对COX-2的抑制率可达60％以上。可见，本发明所述生物发酵物具有抗炎的效果。
本发明还提供了上述生物发酵物或上述制备方法得到的生物发酵物在制备抗氧化产品中的应用。本发明所述生物发酵物在0.5％～5％浓度能够有效抑制ABTS自由基，且抑制率高达90％以上；在5％浓度能够显著抑制DPPH自由基，抑制率可达60％以上。可见，本发明所述生物发酵物具有抗氧化的效果。
本发明所述产品优选包括化妆品，所述化妆品优选包括化妆水、眼霜、面霜、精华、乳液、面膜精华液；当所述化妆品为精华时，优选包括以下重量份的组分：生物发酵物80～100份，水溶性维生素E 1～5份，甘油1～5份，壳聚糖1～2份，透明质酸1～2份和羧甲基纤维素钠1～2份；更优先包括：生物发酵物90份，水溶性维生素E 3份，甘油3份，壳聚糖1.5份，透明质酸1.5份和羧甲基纤维素钠1.5份。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
复合菌剂的制备
(1)酵母菌菌液：将扣囊复膜酵母菌株按10％(V/V)接种量接于YPD液体培养基，在30℃、180r/min条件下培养20h，连续活化2次。
(2)乳酸菌菌液：将粪肠球菌菌株按5％(V/V)接种量接于MRS液体培养基，在37℃恒温培养箱中静置培养20h，连续活化2次。
(3)将步骤(1)得到的酵母菌菌液和步骤(2)得到的乳酸菌菌液等重量混合，得到复合菌剂。
实施例2
称量桦褐孔菌6kg、茯苓菌1kg、厚朴树皮1kg、虎杖根1kg、积雪草叶0.5kg和甘草0.5kg，混合后得到生物物料。将1kg实施例1得到的复合菌剂接种于生物物料中，在30℃条件下摇床发酵48h，然后加入0.2kg的复合纤维素水解酶，于50℃条件下酶解2h，过滤，得到的滤液为生物发酵物。
实施例3
称量桦褐孔菌5kg、茯苓菌0.5kg、厚朴树皮0.5kg、虎杖根0.5kg、积雪草叶0.3kg和甘草0.3kg，混合后得到生物物料。将0.355kg实施例1得到的复合菌剂接种于生物物料中，在32℃条件下摇床发酵50h，然后加入0.071kg的复合纤维素水解酶，于52℃条件下酶解2.5h，过滤，得到的滤液为生物发酵物。
实施例4
称量桦褐孔菌7kg、茯苓菌1.5kg、厚朴树皮1.5kg、虎杖根1.5kg、积雪草叶0.8kg和甘草0.8kg，混合后得到生物物料。将1.965kg实施例1得到的复合菌剂接种于生物物料中，在28℃条件下摇床发酵40h，然后加入0.393kg的复合纤维素水解酶，于48℃条件下酶解1.5h，过滤，得到的滤液为生物发酵物。
实验例1
生物发酵物的抗炎功效
样品和试剂的制备：将实施例2得到的生物发酵物配制得5.0％、2.0％、1.0％、0.50％浓度的待测溶液。
分别用DMSO配制COX-2 Probe、COX-2 Cofactor(50X)和COX-2 Substrate(50X)。
1)COX-2 Cofactor工作液的配制：取适量的COX-2 Cofactor(50X)，按照1:49的比例用COX-2 Assay Buffer稀释，配制COX-2 Cofactor工作液。
2)COX-2工作液的配制：取适量的rhCOX-2(25X)，按照1:24的比例用COX-2 AssayBuffer稀释配制COX-2工作液。
3)COX-2 Substrate工作液的配制：取适量的COX-2 Substrate(50X)，加入等体积的Substrate Buffer，充分涡旋混匀，该混合物再按照1:24的比例用Milli-Q级纯水稀释，充分涡旋混匀。
样品检测：使用96孔板设置空白对照、酶活性对照和样品(空白对照：不添加COX-2工作液，不发生反应；酶活性对照：添加COX-2工作液，不添加样品，呈现正常情况下的反应；样品：添加COX-2工作液，添加实施例2生物发酵物，发生反应)，依次按顺序加入75μL～80μLCOX-2 Assay Buffer、5μL COX-2 Cofactor工作液、5μL COX-2工作液，再加入待测样品后，混匀，37℃孵育10min。各孔依次加入5μL COX-2 Probe后，快速加入5μL COX-2 Substrate工作液，混匀。37℃避光孵育5min后进行荧光测定。激发波长为560nm，发射波长为590nm。具体结果见表1和图1。
计算COX-2抑制率公式如下：
COX-2抑制率(％)＝(RFU100％酶活性对照-RFU样品)/(RFU100％酶活性对照-RFU空白对照)×100％；RFU为检测得到的平均荧光值。
表1不同处理的COX-2抑制率
由表1和图1可知，本发明生物发酵物在1％、2％、5％浓度下，对COX-2的抑制率可达60％以上，表明抗炎效果较显著。
实验例2
生物发酵物的抗氧化功效
(1)清除ABTS自由基
分别配置ABTS水溶液和K2S2O8水溶液，将ABTS水溶液和K2S2O8水溶液等体积混合，低温避光反应12～16h，配置成母液，用无水乙醇稀释成ABTS工作液使用。取实施例2得到的生物发酵物配制得5.0％、2.0％、1.0％、0.50％浓度的待测溶液。A管：取0.2mL的待测液与0.8mL的ABTS工作液混匀；A0管取0.2mL的溶剂与0.8mL的ABTS工作液混匀，在室温条件下分别避光反应30min，用酶标仪测定其在734nm下的吸光值，具体结果见表2和图2。
ABTS自由基抑制率计算公式：ABTS抑制率(％)＝[(A0-A)/A0]*100％；其中为A0管吸光度，A为待测液吸光度。
表2不同浓度生物发酵物的ABTS自由基抑制率
由表2和图2可知，本发明生物发酵物在0.5％～5％浓度下能够有效抑制ABTS自由基，且抑制率高达90％以上。
(2)清除DPPH自由基
取实施例2得到的生物发酵物配制得5.0％、2.0％、1.0％、0.50％浓度的待测溶液。使用无水乙醇作为溶剂进行DPPH溶液配置后待用。A管：取1mL的待测液与1mL的2×10- 4mol/L的DPPH溶液混匀；B管：取1mL的溶剂与1mL的2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀；C管：取1mL的溶剂与1mL的待测液混匀；各管避光反应30min后，在517nm下测A、B、C管吸光度值，具体结果见表3和图3。
DPPH自由基抑制率计算公式：DPPH抑制率(％)＝(B+C-A)/B；其中A为A管吸光度，B为B管吸光度，C为C管吸光度。
表3不同浓度生物发酵物的DPPH自由基抑制率
由表3和图3可知，本发明生物发酵物在5％浓度下能够显著抑制DPPH自由基，抑制率可达60％以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物发酵物，其特征在于，所述生物发酵物为复合菌剂发酵生物物料，经复合纤维素水解酶酶解过滤得到；所述生物物料包括桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草，所述复合菌剂包括酵母菌液和乳酸菌液。
2.根据权利要求1所述的生物发酵物，其特征在于，所述桦褐孔菌、茯苓菌、厚朴树皮、虎杖根、积雪草叶和甘草的重量比为(50～70):(5～15):(5～20):(5～20):(3～8):(3～8)。
3.根据权利要求1所述的生物发酵物，其特征在于，所述酵母菌为扣囊复膜酵母菌，所述乳酸菌为粪肠球菌。
4.根据权利要求3所述的生物发酵物，其特征在于，所述酵母菌液的制备方法包括：将所述扣囊复膜酵母菌株接种于YPD液体培养基，于28～32℃、150～200r/min条件下活化15～25h，活化1～3次；所述乳酸菌液的制备方法包括：将粪肠球菌株接种于MRS液体培养基，于35～40℃活化15～25h，活化1～3次。
5.根据权利要求1所述的生物发酵物，其特征在于，所述酵母菌液和乳酸菌液的重量比为1:2～2:1。
6.权利要求1～5任意一项所述生物发酵物的制备方法，其特征在于，包括：将复合菌剂接种于生物物料中进行发酵，然后加入复合纤维素水解酶酶解，过滤，得到的滤液为所述生物发酵物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述复合菌剂的接种量为5～15％，所述发酵的温度为28～32℃，时间为40～50h。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述复合纤维素水解酶为发酵后物料重量的1～3％，所述酶解的温度为48～52℃，时间为1.5～2.5h。
9.权利要求1～5任意一项所述生物发酵物或权利要求6～8任意一项所述制备方法得到的生物发酵物在制备抗炎产品中的应用。
10.权利要求1～5任意一项所述生物发酵物或权利要求6～8任意一项所述制备方法得到的生物发酵物在制备抗氧化产品中的应用。
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