CN113143835A - 一种除螨祛痘植物组合酵素及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种除螨祛痘植物组合酵素，是由假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮中的至少一种经过水提和发酵后制得。本发明制备方法简单易操作，对原料有效部位萃取完全。对本发明的植物组合酵素进行体外除螨实验，结果表明，该植物组合酵素具有优良的除螨作用；且对人体皮肤无刺激性，可直接使用，也可应用于日化用品配方中，可有效起到除螨祛痘的作用。

Description

一种除螨祛痘植物组合酵素及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种除螨祛痘植物组合酵素及其制备方法与应用。
背景技术
痤疮，俗称“青春痘”或“粉刺”，是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症疾病，好发于15-25岁的青年群体，所以才称它为“青春痘”。其临床特征为出现粉刺、丘疹、脓疱等，常常伴有皮脂溢出；祛痘则是一种运用医学技术或方法，治疗消除青春痘的过程。
近年来的研究表明，螨虫与痤疮关系密切相关。人体寄生的螨虫一般分为两种，称为毛囊螨和皮脂腺螨，通常情况下，头面部皮肤感染螨虫的几率较大，而螨虫的排泄物会导致毛孔堵塞，形成黑头，久而久之皮肤会变得毛孔粗大，甚至发炎，从而引起诸如痤疮、酒糟鼻、毛囊炎等一系列病变，严重影响人体健康及颜面部的美观。因此在祛痘的过程中，除螨显得尤为重要。
目前常用的眼部除螨剂中，外用的有茶树精油、硝唑霜、苯甲酸苄酯乳剂、二氯苯醚菊酯霜剂和硫磺软膏等；内服药物有甲硝唑和伊维菌素等，但是这些治疗药物存在多种问题，例如刺激性强、容易过敏(如茶树精油)，抗生素药物易产生耐药性(如伊维菌素)，价格昂贵，因此研制一种新的除螨剂具有重要的意义。
酵素，本意是参与生物体内各类生理生化活动的所有酶的通称。现在，酵素也成为各种原料发酵后产物的通称。酵素产品通常以果蔬等食材为原料，经过加糖、密封、保存的过程让其充分发酵，最终得到发酵后的液体，这实际上就是自然发酵的过程。在制作酵素的过程中，可以只依靠原材料表面携带的微生物，也可以人工添加发酵菌种；这些微生物菌种在制作过程中繁殖形成一定菌落结构，从而完成整个发酵过程。由于发酵过程是一个复杂的微生物生理和代谢过程，其产生的物质类型也较为多样。决定酵素功能的一个非常重要的方面是其是否有科学的主材选择和发酵菌种配方，发酵后的产物一定条件下可以对人体起到美容、养颜、调节身体机能等诸多益处。
发明内容
本发明所要解决的问题是，针对上述现有技术中的缺点，提出创新方案，尤其是一种能够有效除螨祛痘的方案。
为解决上述问题，本发明采用的方案如下：一种除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，除螨祛痘植物组合酵素是由假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮中的至少一种经过水提和发酵后制得。
进一步，根据上述设计方案所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，所述假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮的质量组分比为假荆芥30～60份：竹子20～40份：芹菜籽10～30份：橙皮10～30份；所述假荆芥为其茎、叶、花中的至少一种；竹子为竹青、竹黄、竹叶中的至少一种。
进一步，根据上述设计方案所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，所述假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮的质量组分比为40份：30份：15份：15份。
进一步，根据上述设计方案所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，所述假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮的质量组分比为60份：20份：10份：10份。
进一步，根据上述设计方案所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，所述假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮的质量组分比为30份：30份：20份：20份。
进一步，根据上述设计方案所述除螨祛痘植物组合酵素的其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a.将假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮混合，然后加入混合物总质量30倍的浓度为60％乙醇溶液去离子水；b.超声波超声震荡，超声波功率为200W，混合液温度50℃，超声波超声振荡时间为120min；c.超声波超声振荡完成后，将全部物料转移至水浴加热装置中，水浴加热至体系保持微沸状态4h连续提取；d.待提取结束后，静置，冷却至25℃，加入按提取液质量5％比例的蔗糖混匀；e.然后加入提取液质量5％比例的生物复合菌种开始发酵，在避光条件下，维持温度25℃，密封发酵15d，发酵过程结束后，将混合发酵液离心，取上清液置于4℃下保存；制得除螨祛痘植物组合酵素。
进一步，根据上述设计方案所述除螨祛痘植物组合酵素的其制备方法，其特征在于，所述生物符合菌种为诺卡氏放线菌(Nocard's bacillus)、胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、布氏白僵菌(Beauveriabassiana)、里氏木霉菌(Trichoderma reesei)、假丝酵母菌(Candida famata)中的任意四种至六种的组合。
进一步，根据上述设计方案所述的除螨祛痘植物组合酵素在制备日化用品中的应用。
进一步，根据上述设计方案所述的除螨祛痘植物组合酵素在制备日化用品中的应用，其特征在于，所述日化用品包括水剂、精华类、乳液类、膏霜类、凝胶类、粉类、面贴膜类、手工皂类、喷雾类、洗护类。
进一步，根据上述设计方案所述的除螨祛痘植物组合酵素在制备日化用品中的应用，其特征在于，所述日化用品中除螨祛痘植物组合酵素添加量以质量分数计为0.5～50％
本发明的技术效果如下：本发明提供的植物组合酵素提取原料中，假荆芥(Nepetacataria)为一年生草本植物，又称为猫薄荷，也称作土荆芥，主要为药用，幼嫩时也可作为蔬菜食用，在我国分布较广。假荆芥新鲜植株中可以提取挥发性精油，已有报道具有较强的昆虫趋避作用，假荆芥的乙醇提取物中含有假荆芥内酯、假荆芥酸等；但未见假荆芥提取物的其他活性报道。
竹，又名竹子，学名Bambusoideae(Bambusaceae或Bamboo)；多年生禾本科竹亚科植物，品种繁多，有毛竹、麻竹、箭竹等。竹子向外的竹皮，由于新鲜的时候是绿色的，称为竹青，而竹腔内发黄的一面就叫作竹黄；本发明应用的竹子的部位即为新鲜的竹叶、竹青、竹黄部位。竹子的提取物，因其含有黄酮类、酚酸类、各种氨基酸等活性成分，在化妆品中的应用已有报道，但未见除螨祛痘类化妆品应用的报道。
芹菜，属伞形科植物，学名ApiumgrauensL.var.dulcedc.，品种繁多，是中国人常吃的蔬菜之一，同时还具有平肝清热、祛风利湿、除烦消肿等功效。芹菜籽，为芹菜的成熟种子，体形非常小，呈卵形，颜色多为棕褐色或深棕色，含桉油醇、伞花内酯、芹菜素、亚麻酸、挥发油以及多种矿物质。芹菜籽在中国传统医学上被认为具有散气、消肿、利尿、开通阻滞、降血压等功效。
橙皮，为芸香科植物甜橙(Citrus sinensis(L.)Osbeck)的果实外皮；橙皮具有理气、化痰、健胃、导滞的功效，橙皮提取物中含有橙皮甙、柠檬烯等活性成分，能平衡皮肤的酸碱值，对于皮肤的生长与修复有一定的功效。
本发明利用中国传统中药“君臣佐使”原理进行组方，其中假荆芥为君药，具有优良的除螨抗菌功效，竹子为臣药，具有良好的的抗炎、抗菌功效；芹菜籽为佐药，具有清热、散气、消滞的功效；橙皮为使药，调和诸药，具有保湿美白抗过敏等作用，能改善痘疮部位的皮肤酸碱度，促进皮肤修复。将这4种各具功效的植物原料组方复配后，利用生物发酵技术使其发挥出增效协同作用；其发酵产物具有除螨、抑菌、清热、抗炎、消肿止痒等特殊功效；且制备方法简便，所得产品有效物质含量高。对该植物组合酵素进行生理活性检测，发现其对除螨祛痘具有显著功效。
本发明公开了一种具有除螨祛痘功效的植物组合酵素及其制备方法与应用。该植物组合酵素是由以下重量份的植物组分制成：假荆芥(包括茎、叶、花)30～60份，竹子(包括竹青、竹黄、竹叶)20～40份，芹菜籽10～30份、橙皮10～30份；本发明以中国传统医药中“君臣佐使”理论为指导进行组方，并利用先进的生物发酵技术，通过多种天然植物的协同作用，达到除螨祛痘的目的。其制备方法分为水提-发酵两个过程，水提过程采用超声波辅助提取工艺，具体如下：将各植物成分粉碎成颗粒状，按比例混合后，加入去离子水，料液比1:10～30，超声波功率200～300W，温度50～70℃，超声波振荡提取60～120min；然后转移至水浴加热装置中，水浴加热至体系保持微沸状态，提取时间2～4h；水提过程完成后静置，待提取液冷却至25～35℃时，加入按提取液质量5～15％比例的蔗糖混匀；然后加入提取液质量5％比例的生物复合菌种开始发酵，在避光条件下，维持温度25～35℃，密封发酵7-15d。发酵过程结束后，将混合发酵液离心，取上清液置于4℃下保存；即为本发明的植物组合酵素。本发明制备方法简单易操作，对原料有效部位萃取完全。对本发明的植物组合酵素进行体外除螨实验，结果表明，该植物组合酵素具有优良的除螨作用；且对人体皮肤无刺激性，可直接使用，也可应用于日化用品配方中，可有效起到除螨祛痘的作用。
附图说明
图1植物组合酵素、植物组合水提物(未发酵)对螨虫的致死率柱状图。
图2植物组合酵素不同浓度对螨虫致死率柱状图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂及材料，如无特殊说明，均为常规商业途径购得。
实施例1制备植物组合酵素
将假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮混合，混合物100g质量中假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮分别占40g、30g、15g、15g；加入2kg去离子水；然后超声波超声震荡，超声波功率为250W，温度60℃，超声波超声振荡时间为90min；超声波超声振荡完成后，将全部物料转移至水浴加热装置中，水浴加热至体系保持微沸状态，连续提取3h，提取结束后静置，冷却至30℃；加入提取液质量10％比例的蔗糖混匀；然后加入提取液质量5％比例的生物复合菌种开始发酵，在避光条件下，维持温度30℃，密封发酵10d。发酵过程结束后，将混合发酵液离心，取上清液置于4℃下保存；即为本发明的植物组合酵素。植物组合酵素色泽为黄色，半透明，经测定其干物质含量为0.52％。
实施例2制备植物组合酵素
将假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮混合，混合物100g质量中假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮分别占60g、20g、10g、10g；加入1kg去离子水；然后超声波超声震荡，超声波功率为300W，温度70℃，超声波超声振荡时间为60min；超声波超声振荡完成后，将全部物料转移至水浴加热装置中，水浴加热至体系保持微沸状态，连续提取2h，提取结束后静置，冷却至35℃；加入按提取液质量15％比例的蔗糖混匀；然后加入提取液质量5％比例的生物复合菌种开始发酵，在避光条件下，维持温度35℃，密封发酵7d。发酵过程结束后，将混合发酵液离心，取上清液置于4℃下保存；即为本发明的植物组合酵素。植物组合酵素色泽为黄色，半透明，经测定其干物质含量为0.94％。
实施例3制备植物组合酵素
将假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮混合，混合物100g质量中假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮分别占30g、30g、20g、20g；加入3kg去离子水；然后超声波超声震荡，超声波功率为200W，温度50℃，超声波超声振荡时间为120min；超声波超声振荡完成后，将全部物料转移至水浴加热装置中，水浴加热至体系保持微沸状态，连续提取4h，提取结束后静置，冷却至25℃；加入按提取液质量5％比例的蔗糖混匀；然后加入提取液质量5％比例的生物复合菌种开始发酵，在避光条件下，维持温度25℃，密封发酵15d。发酵过程结束后，将混合发酵液离心，取上清液置于4℃下保存；即为本发明的植物组合酵素。植物组合酵素色泽为黄色，透明，经测定提其干物质含量为0.36％。
对比例1-3制备植物组合水提液
按照实施例1-3所述的制备方法，在水提过程结束后不再进行生物发酵，离心，过滤收集提取液，即分别制得对比例1-3对应的植物组合水提液。
实施例4植物组合酵素与植物组合水提液体外杀螨实验
1材料与方法
1.1实验材料
器材：人工气候箱(日本Sanyo,MLR-350H)、体视显微镜(日本Olympus，SZ2)、透明胶带等。
实验螨类：采用透明胶带粘贴过夜法获取人体蠕形螨，具体步骤如下：嘱受检者睡前彻底清洁脸部后，将长为6cm，宽为1.5cm的透明胶带分别贴于受检者额、颊、鼻、下巴等部位。次日揭下后粘于载玻片上，镜检。
待测样准备：将按实施例1与对比例1制备的植物组合酵素、植物组合水提液减压蒸馏浓缩至原体积1/20备用，编号1、2号样；将按实施例2与对比例2制备的植物组合酵素、植物组合水提液减压蒸馏浓缩至原体积1/10备用，编号3、4号样；将按实施例3与对比例3制备的植物组合酵素、植物组合水提液减压蒸馏浓缩至原体积1/30备用，编号5、6号样。
1.2实验方法
1.2.1试验分组：待测液1-6号依次编号，同时设2％甲硝唑溶液为阳性对照组，液体石蜡为空白对照组。每组供试蠕形螨为10只。每个药液浓度重复3次实验，结果取平均值。
1.2.2观察方法：用微量移液器吸取200μL药液滴加于载波片上，用推片将药液均匀铺开，将检出蠕形螨的胶带贴于载玻片上，保证药液与虫体充分接触。然后将载玻片置于人工气候箱(温度30℃、湿度75％)，4h后显微镜下观察蠕形螨死亡情况。
1.2.3死亡判断标准：在400倍显微镜下连续观察1min，螨体螯肢或足爪不动者初步判断为死亡，30min后继续观察仍不动者确诊为死亡。
校正死亡率/％＝(空白对照组存活虫数—处理组存活螨数)/空白对照组存活螨数×100
2结果
表1植物组合酵素、植物单方精油对螨虫的校正死亡率
编号 校正死亡率(％)±SE
1号：组合酵素 68.32±4.15
2号：组合水提液 37.16±5.26
3号：组合酵素 61.08±3.35
4号：组合水提液 31.48±3.66
5号：组合酵素 63.22±5.24
6号：组合水提液 35.23±4.065
甲硝唑组(2％) 56.73±4.07
由表1和图1结果可知，该植物组合酵素对人体蠕形螨具有显著的杀灭效果，致死率在60～70％之间，显著高于阳性对照组2％甲硝唑；而未经生物发酵的植物组合水提液对人体蠕形螨也有一定的杀灭效果，致死率在30～40％之间，低于阳性对照组。由此可见，生物发酵过程促进了植物组方中有效物质的进一步溶出与转化，显著提升了杀螨效果。
实施例5植物组合酵素与植物组合水提液抑制酪氨酸酶活性实验
酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)又称多酚氧化酶，它参与黑色素合成的前两步反应，酪氨酸酶的活性与黑素合成量相关。在人体中，酪氨酸酶主要存在于皮肤表皮细胞的黑色素细胞中，与一些常见皮肤疾病如色素障碍性疾病及恶性黑色素瘤的发生具有重要关系。因此，酪氨酸酶抑制剂也被作为具有美白淡斑作用的添加剂添加到化妆品中，用来改善皮肤中色素细胞的酪氨酸酶的代谢，阻止色素沉着，因此亦可改善痘疮愈合后的痘斑问题，促进痘斑淡化。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1L-酪氨酸溶液(7.5mmol/L)的配置
精确称取L-酪氨酸0.2721g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7.0，加去离子水定容至200mL。
1.1.2酪氨酸酶液的制备
以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液，具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1×1×1cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1∶1(W:V)的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000r/min离心10min，上清即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。
1.1.3受试液配置
将按实施例1与对比例1制备的植物组合酵素、植物组合水提液各取1mL，稀释至3mL备用，编号1、2号样；将按实施例2与对比例2制备的植物组合酵素、植物组合水提液各取1mL，稀释至6mL备用，编号3、4号样；将按实施例3与对比例3制备的植物组合酵素、植物组合水提液各取1mL，稀释至2mL备用，编号5、6号样。阳性对照为1％的熊果苷溶液。
1.2实验方法
总反应体系为5mL。具体设计见表2：
表1 5mL试验体系设计
Figure BDA0003100915040000081
注：用分光光度计测量吸光值时，“受试液”、“标准对照”、“阳性对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”、“阴性对照3”调零。
实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20min时475nm波长下的吸光值。测定时以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率。
Figure BDA0003100915040000091
其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。
每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。
2结果
见表2。
表2植物组合酵素与植物组合水提液对酪氨酸酶抑制率
编号 抑制率(％)
1号：组合酵素 86.18±3.17
2号：组合水提液 44.13±2.51
3号：组合酵素 72.36±4.65
4号：组合水提液 39.08±3.24
5号：组合酵素 77.33±3.48
6号：组合水提液 41.82±2.90
熊果苷(0.5％) 46.33±3.76
由表2和图2的结果可以表明：植物组合水提液经过发酵后所得的发酵液，即实施例1-3制备的植物组合酵素，均比未经发酵的水提液对酪氨酸酶的抑制能力大幅度提升，也大大优于阳性对照1％浓度熊果苷(在美白类日化产品中，熊果苷常见添加浓度即为1％)。这显示出生物发酵过程促进了植物组方中有效物质的进一步溶出与转化，能大大提升植物组合酵素的应用价值。
实施例6制备一款以植物组合酵素为主要功效成分的除螨祛痘护肤乳液制备一款含有除螨祛痘植物组合酵素的除螨祛痘护肤乳液，配方见表3所示。
表3除螨祛痘护肤乳液配方
Figure BDA0003100915040000092
Figure BDA0003100915040000101
配置工艺：将鲸蜡硬脂醇、角鲨烷、辛葵酸甘油三酯、白油、硬脂醇聚氧乙烯2醚加热搅拌至75℃使溶解充分，为A相；将植物组合酵素、金缕梅提取液与卡波姆U20加适量去离子水，加热搅拌至75℃使溶解充分，保温20-30min；然后加入甘油、丙二醇、丁二醇、、维生素E、香精，在保温条件下搅拌溶解均匀，补足余量去离子水，为B相；将A相加入B相继续保温条件下搅拌，溶解均匀后待其降温至45℃左右时，加入TEA、苯氧乙醇，搅拌均匀，静置降温后即得除螨祛痘护肤乳液。
该除螨祛痘护肤乳液为本发明制备的植物组合酵素在除螨祛痘日化用品中的一个实施例代表，亦可参照日化行业常用配方制备成具有除螨祛痘效果的水剂、凝胶类、膏霜类、粉类、面贴膜类、手工皂类、喷雾类、洗护类等日化产品。
实施例7除螨祛痘护肤乳液效果评价
评价对象：选择面部有痤疮、年龄为15-30岁的年轻人44例，其中男性24例，女性20例。
评价方法：采用双盲法，每天早中晚涂擦实施例6制备的除螨祛痘护肤乳液三次，28天为一个疗程。
评价标准：①效果显著：痤疮消褪70％以上；②有一定效果：痤疮消褪30％以上；③无效：痤疮消褪30％以下。
评价结果：显效29例，占65.9％；有效10例，占22.7％；无效5例，占11.4％。总有效率达到88.6％，且无一例汇报有皮肤过敏红肿等不良反应。说明本发明的除螨祛痘植物组合酵素具有良好的祛痘效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，除螨祛痘植物组合酵素是由假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮中的至少一种经过水提和发酵后制得。
2.根据权利要求1所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，取假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮按照质量组分比为假荆芥30～60份：竹子20～40份：芹菜籽10～30份：橙皮10～30份进行配比；所述假荆芥为其茎、叶、花中的至少一种；竹子为竹青、竹黄、竹叶中的至少一种。
3.根据权利要求2所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，所述假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮的质量组分比为40份：30份：15份：15份。
4.根据权利要求2所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，所述假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮的质量组分比为60份：20份：10份：10份。
5.根据权利要求2所述除螨祛痘植物组合酵素，其特征在于，所述假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮的质量组分比为30份：30份：20份：20份。
6.根据权利要求1所述除螨祛痘植物组合酵素的其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a.将假荆芥、竹子、芹菜籽、橙皮混合，然后加入混合物总质量30倍的浓度为60％乙醇溶液去离子水；b.超声波超声震荡，超声波功率为200W，混合液温度50℃，超声波超声振荡时间为120min；c.超声波超声振荡完成后，将全部物料转移至水浴加热装置中，水浴加热至体系保持微沸状态4h连续提取；d.待提取结束后，静置，冷却至25℃，加入按提取液质量5％比例的蔗糖混匀；e.然后加入提取液质量5％比例的生物复合菌种开始发酵，在避光条件下，维持温度25℃，密封发酵15d，发酵过程结束后，将混合发酵液离心，取上清液置于4℃下保存；制得除螨祛痘植物组合酵素。
7.根据权利要求1所述除螨祛痘植物组合酵素的其制备方法，其特征在于，所述生物符合菌种为诺卡氏放线菌、胶质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、布氏白僵菌、里氏木霉菌、假丝酵母菌中的任意四种至六种的组合。
8.根据权利要求1所述的除螨祛痘植物组合酵素在制备日化用品中的应用。
9.根据权利要求8所述的除螨祛痘植物组合酵素在制备日化用品中的应用，其特征在于，所述日化用品包括水剂、精华类、乳液类、膏霜类、凝胶类、粉类、面贴膜类、手工皂类、喷雾类、洗护类。
10.根据权利要求8所述的除螨祛痘植物组合酵素在制备日化用品中的应用，其特征在于，所述日化用品中除螨祛痘植物组合酵素添加量以质量分数计为0.5～50％。
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